張彩娟 吳宇光 鄭文寅 王文余 朱宗河

摘要 雜交水稻純度鑒定對水稻種子質(zhì)量控制和降低生產(chǎn)經(jīng)營風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。利用SSR標(biāo)記技術(shù)，以秈稻雜交旱稻新品種鑫兩優(yōu)212及其親本DNA為材料，從48對SSR引物中篩選出3對在雜交種鑫兩優(yōu)212中呈現(xiàn)雙親帶型的引物。研究表明，這3對引物均可用于雜交種鑫兩優(yōu)212種子純度鑒定。

關(guān)鍵詞 鑫兩優(yōu)212;SSR標(biāo)記;水稻;純度

中圖分類號 S511文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0068-03

種子質(zhì)量包括純度、凈度、發(fā)芽率、水分等，其中種子純度是最重要，也是最容易引起生產(chǎn)糾紛的質(zhì)量指標(biāo)。我國是雜交水稻研究最早、種植面積最大的國家。在我國廣泛推廣的兩系雜交水稻由于其母本為光、溫敏核不育系，制種過程中受氣候變化影響較大，如低溫天氣，易引起不育系的育性轉(zhuǎn)換，直接影響到雜交種子純度[1]。雜交水稻純度影響著雜種優(yōu)勢強(qiáng)弱和產(chǎn)量高低。種植純度不合格的雜交水稻種子不僅阻礙優(yōu)良品種優(yōu)良遺傳性能的充分發(fā)揮，還會導(dǎo)致大面積減產(chǎn)，給國家、種子企業(yè)和農(nóng)民帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。因此，種子純度是雜交稻種子生產(chǎn)經(jīng)營過程中最突出、種子企業(yè)最關(guān)心的核心問題之一。

目前應(yīng)用于雜交水稻種子純度鑒定的方法主要有種植鑒定、籽粒形態(tài)鑒定、同工酶鑒定、DNA分子標(biāo)記鑒定[3]。不同雜交水稻品種種子籽粒形態(tài)差異有限;同工酶法，多態(tài)性不夠豐富，且有組織和器官特異性，從而限制了其應(yīng)用[4];種植鑒定是最直觀、最有效、最符合生產(chǎn)實(shí)踐的純度鑒定方法，是種子企業(yè)最倚重的鑒定方法，但由于其鑒定周期長，鑒定結(jié)果不能及時(shí)指導(dǎo)種子加工和銷售。因此，研究和應(yīng)用其他簡便、快速、準(zhǔn)確、不受時(shí)空限制的鑒定方法，輔助種植鑒定結(jié)果，彌補(bǔ)種植鑒定的滯后性，作為在種植鑒定結(jié)果出來之前大量銷售時(shí)的初步依據(jù)，是種子企業(yè)最希望采取的方法。 SSR分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、無環(huán)境影響、操作快速簡單、結(jié)果穩(wěn)定可靠、引物序列易交流等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于雜交稻純度鑒定[5-12]。

鑫兩優(yōu)212是合肥市蜀香種子有限公司利用抗旱性較強(qiáng)的兩系不育系蜀鑫1S與抗高溫恢復(fù)系鑫恢212 2009年配組，2014年通過安徽省審定的雜交水稻新品種（審定編號：皖稻2014022），經(jīng)上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心2012年抗旱性鑒定，抗旱性達(dá)1級，是國內(nèi)選育的首個(gè)雜交秈型旱稻品種[13]。筆者擬利用農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY/T 1433—2014）中推薦的48個(gè)SSR標(biāo)記，篩選適合的特異引物用于該雜交種純度的快速鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為鑫兩優(yōu)212雜交標(biāo)準(zhǔn)種及其親本，以及純度待測的鑫兩優(yōu)212樣品，均由合肥市蜀香種子有限公司提供，在光照培養(yǎng)箱（恒溫30 ℃）中培養(yǎng)7 d左右。SSR引物和DNA聚合酶購自上海生工，引物序列（表1）源于中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY/T 1433—2014）。

1.2 方法

1.2.1 供試材料發(fā)芽。按照《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》（GB/T 3543.4—1995）要求，從鑫兩優(yōu)212雜交標(biāo)準(zhǔn)種、親本及純度待測樣品中均隨機(jī)取200粒種子，均勻置于發(fā)芽床上，在溫度為30 ℃、光照為750 lx、濕度為75%的條件下發(fā)芽3～7 d。

1.2.2 DNA提取。DNA提取采用常規(guī)的CTAB法：取2～3 g的水稻幼苗，剪碎放入2 mL離心管中，加入1～2顆鋼珠，放入液氮中5 min，將離心管取出用漩渦振蕩儀粉碎，向離心管中加入500 μL預(yù)熱的CTAB，蓋好離心管蓋放在65 ℃水浴鍋中預(yù)熱30 min，期間來回顛倒2～3次，預(yù)熱后加入氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提液500 μL，振蕩混勻后放入高速冷凍離心機(jī)中10 000 r/min離心5 min，離心結(jié)束后吸取400 μL上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，加入800 μL無水乙醇放入-20 ℃冰箱中冷凍30 min，沉淀DNA，然后放入離心機(jī)中10 000 r/min離心10 min，取出離心管可以看到白色透明沉淀，棄上清液。再加入70%乙醇洗滌2次，放置通風(fēng)處風(fēng)干，加入100 μL? TE緩沖液溶解DNA，-20 ℃保存，使用時(shí)對母液進(jìn)行稀釋，DNA工作液保持在50 ng/μL。

1.2.3 PCR擴(kuò)增。采用10 μL的PCR反應(yīng)體系：1 μL樣品DNA，1 μL 10×buffer，0.6 μL 25 mmol/L MgCl 0.4 μL 5.0 mmol/L dNTP，0.1 μL 5 U Taq酶，上下游引物各0.5 μL，最后加5.9 μL的超純水補(bǔ)足到10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃45 s，57 ℃45 s，72 ℃1 min，36個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min，最后4 ℃冷卻10 min。

1.2.4 電泳檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測。點(diǎn)樣后，1 000 V電泳預(yù)熱30? min，上樣后穩(wěn)壓1 000 V電泳60～90 min。電泳完畢后，用10%冰醋酸溶液（1 L）固定30 min，用2%硝酸銀溶液染色30? min，用預(yù)冷的3%無水碳酸鈉溶液顯色，ddH2O漂洗1～5? min，室溫下自然晾干。拍照、觀察帶型、統(tǒng)計(jì)結(jié)果數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異引物篩選

對鑫兩優(yōu)212標(biāo)準(zhǔn)雜交種及其親本使用《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》 （NY/T 1433—2014）中48 對SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果有18對引物在父母本間具有多態(tài)性，且在鑫兩優(yōu)212標(biāo)準(zhǔn)雜交種各單株中呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶型（圖1），約占檢測引物的37.5% （表1） ，可用于該品種的純度鑒定。

2.2 鑫兩優(yōu)212雜交種純度鑒定

隨機(jī)選取純度待測的鑫兩優(yōu)212幼苗100株，分別提取DNA進(jìn)行純度鑒定，以親本（父、母本）作為對照，選取多態(tài)性好、譜帶清晰穩(wěn)定、非特異性擴(kuò)增少的3對引物（RM72、RM3331、RM493）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在4%變性聚丙烯酰胺凝膠上點(diǎn)樣、電泳并分析結(jié)果。譜帶中出現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶型的為雜交種，其他帶型為雜株（圖2），以此計(jì)算純度的百分率=雜交種單株數(shù)/檢測單株數(shù)×100%。結(jié)果表明，用RM72、RM3331、RM493標(biāo)記檢測鑫兩優(yōu)212，都檢測到第16、25、32、40、68、78和87號7個(gè)單株為非雙親互補(bǔ)帶型雜株，且都是母本帶型，據(jù)此計(jì)算出鑫兩優(yōu)212待測樣品的純度為93%。該批次樣品經(jīng)過合肥市蜀香種子有限公司海南異地種植鑒定和合肥正季種植鑒定，純度鑒定結(jié)果分別為96.0%和94.5%。

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)能從分子水平上反映生物個(gè)體間差異，具有較高的多態(tài)性與重演性，SSR分子標(biāo)記技術(shù)用于作物純度鑒定已是成熟的技術(shù)，能以較小的成本、較短的時(shí)間準(zhǔn)確、穩(wěn)定地鑒定品種的純度。該研究從均勻分布在水稻染色體上的48對SSR引物中篩選到18對用于鑫兩優(yōu)212雜交種純度鑒定，選用其中的3對引物可以快速、較為準(zhǔn)確地鑒定出鑫兩優(yōu)212純度。從篩選的18對引物中篩選特異性較強(qiáng)的引物組合對鑫兩優(yōu)212雜交種進(jìn)行鑒定，能夠減少很多的工作量和成本，且效果更好，可靠性更高。

利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行純度鑒定時(shí)，有些與雜交種帶型有明顯差異的單株在種植鑒定時(shí)并不一定表現(xiàn)出表型性狀的差異，因此SSR分子標(biāo)記技術(shù)用于純度鑒定時(shí)，可以有效鑒別出大田無法確定的表型以及難以鑒別的植株，因而分子鑒定和種植鑒定結(jié)果必然存在一定的差異，而種植鑒定是最符合生產(chǎn)實(shí)踐的純度鑒定方法，如何使分子鑒定結(jié)果更接近種植鑒定、更好地輔助種植鑒定結(jié)果還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]王兆賢，高前寶，王友存，等.兩系雜交水稻純度檢測方法探討[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（10）：5011，5034.

[2]喬蘭蘭.利用SSR分子標(biāo)記鑒定雜交稻種子齊兩優(yōu)918純度[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，19（17）：120，129.

[3]葉尚. 利用溫泉熱能與控光技術(shù)鑒定雜交稻種子純度的研究[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[4]李召華，朱克永，陳祖武，等. SSR分子標(biāo)記技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用[J]. 雜交水稻，2006，21（4）：11-14.

[5]黃成志，黃文章，嚴(yán)明建，等. 利用SSR分子標(biāo)記鑒定雜交水稻真?zhèn)闻c純度[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（8）：3437-3438.

[6]呂桂蘭，丁芬，沈楓，等.SSR標(biāo)記技術(shù)在水稻遺傳育種中的應(yīng)用[J].北京水稻，2007（3）：23-26.

[7]張琳，杜鵑，齊麗霞，等.SSR標(biāo)記在雜交旱稻新組合純度鑒定中的應(yīng)用[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（3）：502-506.

[8]陳榮林，黃運(yùn)川，唐梅，等.SSR分子標(biāo)記檢測超級雜交稻桂兩優(yōu)2 號種子純度的研究[J]. 雜交水稻，2013，28（4）：75-78.

[9]陽慶華，李秀瓊，魯孟海.SSR分子檢測與田間小區(qū)種植鑒定揚(yáng)兩優(yōu)6號純度的比較[J].中國種業(yè)，2014（7）：49-50.

[10]肖子發(fā)，朱克永，劉之熙，等.利用SSR 標(biāo)記構(gòu)建湖南省審雜交水稻品種DNA 指紋圖譜[J]. 雜交水稻，201 26（3）：51-56.

[11]周桂林，范家萌，周賢達(dá)，等.兩系超級稻豐兩優(yōu)四號指紋圖譜構(gòu)建及純度快速鑒定[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，23（13）：138-141.

[12]尤佳，王晉，文朝慧，等.應(yīng)用SSR 技術(shù)鑒定雜交種種子純度的方法探究[J]. 種子，2015，34（5）：46-49.

[13]王文余，陳海洲，張孝國，等.兩系雜交旱稻鑫兩優(yōu)212的選育與應(yīng)用[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，20（18）：39，63.