劉文秀

摘要 從無(wú)脊椎動(dòng)物的角度，綜述了乙酰膽堿酯酶的特性及其在國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展，并對(duì)該領(lǐng)域研究前景進(jìn)行了展望，旨在為環(huán)境監(jiān)測(cè)、農(nóng)藥殘留及疾病治療等方面提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 無(wú)脊椎動(dòng)物；乙酰膽堿酯酶；污染物

中圖分類號(hào) S859.82 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）02-0004-04

Abstract We summarized the characteristics of acetylcholinesterase and its research progress at home and abroad from the perspective of invertebrates. The research foreground of this field was prospected， so as to provide scientific basis for environmental monitoring， pesticide residue，disease treatment and so on.

Key words Invertebrates；Acetylcholinesterase；Contaminants

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，各種廢水大量排放，再加上化學(xué)農(nóng)藥的不合理使用，使得環(huán)境污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，對(duì)生態(tài)環(huán)境及人類安全造成一定影響，引起了世界各國(guó)的普遍關(guān)注。大多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物個(gè)體小，生活自由，容易受環(huán)境影響，適宜研究生態(tài)毒理作用，并被作為潛在環(huán)境污染的篩選工具[1]。其中，枝角類作為指示生物檢測(cè)400多種化學(xué)物的毒性[2]。

乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶，在膽堿能突觸間，該酶能降解乙酰膽堿（ACh），終止神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞。大多數(shù)污染物是AChE的抑制劑，進(jìn)入環(huán)境后，影響生物機(jī)體AChE的活性，造成大量動(dòng)物的死亡。為了避免這種現(xiàn)象的發(fā)生，國(guó)內(nèi)外學(xué)者就不同污染物對(duì)動(dòng)物AChE的毒理學(xué)機(jī)制進(jìn)行了研究。筆者從無(wú)脊椎動(dòng)物的角度，綜述了AChE的特性以及作為神經(jīng)傳導(dǎo)的標(biāo)志物在該領(lǐng)域的研究進(jìn)展，旨在為生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)、農(nóng)藥殘留及疾病治療等提供科學(xué)依據(jù)。

1 乙酰膽堿酯酶的性質(zhì)

1.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因結(jié)構(gòu)

從蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)看，AChE最突出的特征就是有一個(gè)深而窄的狹口，活性基團(tuán)位于此狹口中，而活性中心主要由以下3個(gè)部分組成（圖1）：①酯解部位，主要由絲氨酸和組氨酸組成，可以與乙酰膽堿的羧基碳原子結(jié)合；②季銨基團(tuán)結(jié)合部位，ACh含季銨陽(yáng)離子部分，與AChE活性中心上的陰離子部位結(jié)合；③疏水性區(qū)域，該區(qū)域有色氨酸或酪氨酸等芳香族氨基酸，與酯解或季銨基團(tuán)結(jié)合部位連接或在其附近，在與芳香族底物結(jié)合中起重要作用[3]。

從基因結(jié)構(gòu)來(lái)看，自1986年黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的第1個(gè)AChE基因被克隆以來(lái)，生物體內(nèi)的AChE催化亞基的cDNA逐步被發(fā)現(xiàn)，這些cDNA均編碼1個(gè)長(zhǎng)度535個(gè)氨基酸左右的多肽鏈。絕大部分生物的AChE由單個(gè)Ace基因編碼，但線蟲基因組中有4種Ace基因（Ace-1、Ace-2、Ace-3、Ace-4），棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）和三帶喙庫(kù)蚊（Culex tritaeniorhynchus）4種昆蟲中發(fā)現(xiàn)2種Ace基因（Ace-1、Ace-2）[5]。不同生物間Ace的堿基長(zhǎng)度、內(nèi)含子、外顯子數(shù)目不同，結(jié)構(gòu)就不同，所以它們編碼的AChE對(duì)抑制劑的敏感性也不同。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中得到不同物種AChE的基因序列，利用MEGA 5.1軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），顯示了不同物種間AChE基因的親緣關(guān)系：大型溞Daphnia magna（AB697764.1）、玻璃海鞘Ciona intestinalis（NM_001128877.1）、

斑馬魚Danio rerio（NM_131846.2）、家蠅Musca domestica（AF533335.1）、鯉魚Cyprinus carpio（AB361595.1）、河鲀Tetraodon nigroviridis（AY733039.1）、橄欖星室木虱Pseudophacopteron canarium（DQ425058.1）、根結(jié)線蟲Meloidogyne javanica（AF080184.1）、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata（GU066339.1）、

巴氏白蛉Phlebotomus papatasi（JQ922267.1）、藥材甲Stegobium paniceum（GU944767.1）、盲鰻Myxine glutinosa（U55003.1）、催命按蚊Anopheles funestus（JN815138.1）、廄螫蠅Stomoxys calcitrans（HM125963.1）、

擬黑多刺蟻Polyrhachis vicina（JF742990.1）、螺旋蠅Cochliomyia hominivorax（FJ830868.1）、埃及血吸蟲Schistosoma haematobium（AY228511.1）、南方根瘤線蟲Meloidogyne incognita（AF075718.1）、煙草甲Lasioderma serricorne（GU211888.1）、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis（FN538987.1）、褐飛虱Nilaparvata lugens（FM866396.2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，家蠅、廄螫蠅和螺旋蠅三者間的親緣關(guān)系較近，根結(jié)線蟲和南方根瘤線蟲的AChE基因也比較相似，而按蚊與其他物種的AChE基因的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。這些物種間AChE基因親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近可能就是由于其編碼基因的不同所造成的。

1.2 乙酰膽堿酯酶的生物學(xué)功能

AChE是生物體內(nèi)反應(yīng)速度最快的酶之一（Kcat=1.6×104 s-1），是絲氨酸水解酶最重要的家族成員之一，在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)都有分布，是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶，調(diào)節(jié)ACh轉(zhuǎn)換，負(fù)責(zé)終止跨突觸的許多神經(jīng)元細(xì)胞信息的傳遞。AChE是一種多分子型的復(fù)雜蛋白質(zhì)，在中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)與ACh受體一起完成神經(jīng)之間動(dòng)作電位的傳遞，從而保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)的正常傳遞[6]。

在生態(tài)毒理學(xué)中，AChE被認(rèn)為是神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能信號(hào)傳導(dǎo)的最重要的生物標(biāo)志物，因此AChE活性檢測(cè)被廣泛應(yīng)用于研究中，酶抑制是化學(xué)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的征兆[7]。在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，無(wú)脊椎動(dòng)物的AChE常被作為指示劑，監(jiān)測(cè)環(huán)境中污染物的含量。AChE可能與細(xì)胞的發(fā)育和成熟有關(guān)，此外，有研究發(fā)現(xiàn)利用不同方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，均檢測(cè)到AChE的表達(dá)，且AChE的反義核酸可以部分抑制細(xì)胞凋亡，說(shuō)明AChE對(duì)細(xì)胞凋亡有一定的影響[8]。醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，AChE促進(jìn)釋放ACh時(shí)，致使迷走神經(jīng)興奮，表現(xiàn)為心率減慢、血管擴(kuò)張、消化道平滑肌收縮、消化腺分泌增加等，從而引起胃腸蠕動(dòng)。楊筱珍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)腸道鋪片和組化染色的方法發(fā)現(xiàn)在中華絨螯蟹后腸中廣泛存在AChE，促進(jìn)腸道的排泄，腸胃蠕動(dòng)加劇，使機(jī)體攝食率增加。

1.3 乙酰膽堿酯酶的分布情況

在不同無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，AChE的含量和組織分布均存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，AChE主要合成于肝臟，存在于肌肉、肝胰、心臟、腸黏膜、血漿及神經(jīng)組織（如腦白質(zhì)、神經(jīng)細(xì)胞髓鞘）等，其中在腦組織中的AChE含量最高[3]。在組織中，也主要存在于膽堿能神經(jīng)末梢突觸間隙，特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)終板突觸后膜的褶皺中聚集較多。

2 國(guó)內(nèi)外對(duì)乙酰膽堿酯酶的研究進(jìn)展

2.1 污染物對(duì)生物體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性的影響 1953年，Stedman等首先從馬血清中分離出AChE后，不同生物體內(nèi)的AChE相繼得到分離和研究，對(duì)AChE的研究也更加廣泛。

工業(yè)上，不同形式的金屬?gòu)U物排入環(huán)境中，在生物體內(nèi)富集，尤其在低等的無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，直接影響機(jī)體AChE的活性，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育造成一定傷害。李會(huì)等[10]研究發(fā)現(xiàn)暴露在 60 mg/L Fe3+溶液中，泥鰍腦組織中AChE活性顯著降低（P<0.05），表明 Fe3+對(duì)泥鰍具有神經(jīng)毒性。暴露于毒死蜱（CHP）和Cu后，紫貽貝鰓中AChE的活性也顯著降低[11]。然而，暴露在納米顆粒TiO2中的扇貝組織鰓和消化腺內(nèi)的AChE活性都隨時(shí)間的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，表現(xiàn)出時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系[12]。納米形式的金屬對(duì)機(jī)體AChE的影響都不是特別明顯，只有達(dá)到一定時(shí)間和劑量才會(huì)起作用。暴露在ZnO納米顆粒下的蜜蜂，腦組織中AChE的活性基本不受影響[13]。據(jù)此推測(cè)，可能是金屬的納米形式比離子形式的毒性小，對(duì)AChE的抑制作用也較弱。

除了金屬物質(zhì)外，各種藥物排入環(huán)境中，對(duì)AChE也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。張丹等[14]研究發(fā)現(xiàn)在亞致死濃度（LC5、LC10和LC20）脅迫下，氧化樂(lè)果、甲萘威和辛硫磷對(duì)搖蚊幼蟲AChE活性都有明顯的抑制作用。熏蒸劑對(duì)谷物象鼻蟲的AChE也有顯著的抑制作用[15]。相同地，暴露在反式肉桂醛下，果蠅AChE活性表現(xiàn)出顯著的抑制作用[16]。以上污染物都對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物機(jī)體AChE表現(xiàn)出抑制作用，然而可能由于化學(xué)藥物的不同特性，對(duì)AChE會(huì)有不同的作用。溴化1-乙基-3-甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響在LC20濃度處理下呈抑制趨勢(shì)，LC50濃度處理下呈先抑制后誘導(dǎo)的趨勢(shì)；溴化1-丁基-3-甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響在LC20濃度處理下呈先抑制后誘導(dǎo)的趨勢(shì)，在LC50濃度處理下呈抑制趨勢(shì)；1，2-二甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾AChE活性的影響在LC20濃度處理下呈先抑制后誘導(dǎo)的趨勢(shì)；在LC50濃度處理下呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢(shì)，3種離子液體在斜紋夜蛾體內(nèi)的積累對(duì)體內(nèi)AChE的活性均有不同程度影響，改變生物體內(nèi)神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)，導(dǎo)致生物體嚴(yán)重的行為改變、功能紊亂、癱瘓，從而產(chǎn)生毒害作用[17]。Deng等[18]研究發(fā)現(xiàn)低濃度的毒死蜱短期對(duì)小菜蛾體內(nèi)AChE的活性增加23.5%～29.8%。同時(shí)暴露在殺蟲劑氯蟲苯甲酰胺和真菌病原體的東亞飛蝗體內(nèi)AChE活性在后期也呈上升趨勢(shì)[19]。

隨著對(duì)AChE研究的不斷擴(kuò)展延伸， AChE的應(yīng)用已經(jīng)深入到醫(yī)藥或疾病治療等領(lǐng)域。醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，AChE不僅參與膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，而且具有調(diào)節(jié)和促進(jìn)神經(jīng)組織的發(fā)育和神經(jīng)再生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子樣作用。Prugh等[20]研究表明暴露于有機(jī)磷的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的AChE活性降低， 造成MSC分化成成骨細(xì)胞的能力降低。大量醫(yī)學(xué)研究表明，目前用于阿爾茨海默?。ˋD）的治療主要基于AChE抑制劑的給藥[21]，且已經(jīng)在臨床上得到實(shí)踐。

2.2 乙酰膽堿酯酶活性改變的機(jī)理

基于目前國(guó)內(nèi)外對(duì)AChE的廣泛研究，污染物對(duì)生物體AChE的毒性研究越來(lái)越受到關(guān)注，尤其各種農(nóng)藥對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物毒性反應(yīng)的影響已經(jīng)成為焦點(diǎn)[22-23]。當(dāng)污染物進(jìn)入機(jī)體與AChE相互作用時(shí)，與AChE活性中心的絲氨酸發(fā)生不可逆反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)更穩(wěn)定的污染物-乙酰膽堿酯酶絡(luò)合物，使AChE不能有效水解ACh，在體內(nèi)大量積累，受體不斷被激活，突觸后神經(jīng)纖維長(zhǎng)期處于興奮狀態(tài)，引起戰(zhàn)栗、痙攣[24]。然而，過(guò)量的ACh又可以造成去極化阻斷，從而抑制了神經(jīng)傳導(dǎo)，使機(jī)體后期逐漸失去活動(dòng)能力，昏迷死亡。

不同污染物對(duì)AChE的影響程度還取決于污染物和酶的化學(xué)特性。AChE有多個(gè)不同的結(jié)合部位，不同污染物對(duì)它們的結(jié)合能力不同，影響作用也不同。Dos Santos Miron等[24]研究發(fā)現(xiàn)污染物誘導(dǎo)AChE活力上升，推測(cè)可能是由于機(jī)體在應(yīng)對(duì)外源污染物時(shí)的一種應(yīng)激機(jī)制，通過(guò)加快AChE的合成來(lái)補(bǔ)償污染物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的脅迫。AChE活力升高表明神經(jīng)遞質(zhì)膽堿水解增強(qiáng)，引起煙堿和毒蕈堿受體活化下降，造成正常的神經(jīng)信息傳遞也受到影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中毒。AChE活性的下降，表明污染物濃度的升高，對(duì)機(jī)體的神經(jīng)毒性增大，酶活力中心絲氨酸受到抑制，酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶失活；也可能是因?yàn)榇罅康幕钚匝踝杂苫种屏嗣傅幕盍25]。

2.3 污染物對(duì)水溞乙酰膽堿酯酶的影響

枝角類作為食物鏈中的關(guān)鍵物種，在食物鏈中起重要的作用。水溞營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、繁殖快、適口性好，適合大量培養(yǎng)，是許多水產(chǎn)品動(dòng)物的餌料，對(duì)多種有毒物質(zhì)敏感，是毒性試驗(yàn)中普遍采用的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)材料。因此，枝角類的餌料價(jià)值和應(yīng)用前景已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。通過(guò)對(duì)污染物脅迫無(wú)脊椎動(dòng)物AChE機(jī)理的研究，分析污染物對(duì)水溞AChE活性的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)乙酰氨基酚（鎮(zhèn)痛藥）和雙氯芬酸（抗炎藥）的攝入顯著抑制了大型溞的AChE活性，說(shuō)明對(duì)乙酰氨基酚和雙氯芬酸具有干擾大型溞神經(jīng)傳遞的能力[26]。Toumi等[27]研究表明將大型溞暴露在氰菊酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑下，AChE活性均顯著降低。大型溞在AgNPS下脅迫48 h，隨著AgNPS濃度的升高，AChE活性升高，與Ulm等[28]的研究結(jié)果一致。

通過(guò)對(duì)水溞AChE的研究，發(fā)現(xiàn)不同污染物對(duì)水溞AChE有不同程度的影響，這可能與污染物的化學(xué)特性有關(guān)，不同污染物與機(jī)體酶的結(jié)合能力不同，而且對(duì)AChE的效應(yīng)時(shí)間和劑量也不同。

3 小結(jié)與展望

AChE是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性的酶。低等無(wú)脊椎動(dòng)物在污染物的脅迫下，AChE可作為一種生物指示劑來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境的污染情況。大量研究表明，大多數(shù)無(wú)脊椎動(dòng)物在污染物的脅迫下，AChE活性隨著污染物濃度的升高會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，使得動(dòng)物機(jī)體神經(jīng)中毒，甚至導(dǎo)致死亡。

水溞作為一種甲殼類水生動(dòng)物，在水環(huán)境系統(tǒng)食物鏈中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體受到污染物脅迫時(shí)，水溞AChE能迅速發(fā)生變化，為監(jiān)測(cè)水質(zhì)污染、保護(hù)生態(tài)環(huán)境和防治污染物提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也可為今后研究工作的開展奠定理論基礎(chǔ)并提供技術(shù)支撐。

隨著分子技術(shù)、基因工程和計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)等的發(fā)展，這些成果被廣泛應(yīng)用到水環(huán)境污染監(jiān)測(cè)、農(nóng)藥殘留檢測(cè)、生態(tài)環(huán)境保護(hù)以及人類疾病治療等領(lǐng)域。利用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)水體動(dòng)物體內(nèi)AChE的活性及其基因等一系列變化來(lái)反映水環(huán)境的污染情況。通過(guò)點(diǎn)突變技術(shù)和基因克隆技術(shù)獲得對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類化合物敏感的乙酰膽堿酯酶的cDNA序列，利用基因克隆使其在微生物中大量表達(dá)，提取大量敏感性的AChE，用于研制生物傳感器，檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品或環(huán)境中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的含量[29]。在疾病防治方面，某些疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ?、重癥肌無(wú)力病等）的發(fā)生也與AChE有密切的關(guān)系。Zhang等[30]研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物細(xì)胞凋亡過(guò)程中會(huì)表達(dá)特異性帶尾親水型的AChE，這為腫瘤以及其他功能性疾病的檢測(cè)提供了新思路。

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