李變變

摘要 [目的]研究酸奶制作時(shí)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的分離純化、發(fā)酵性能、添加比例。[方法]使用選擇性培養(yǎng)基分離出保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，并對(duì)其發(fā)酵性能和傳代特性進(jìn)行測(cè)定，最終選擇出發(fā)酵性能較好的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌；將分離出來的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以不同比例在脫脂乳中進(jìn)行混合菌株發(fā)酵，確定制作酸奶時(shí)兩者的最佳添加比例。[結(jié)果]在酸奶發(fā)酵時(shí)，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的添加比例為1∶1時(shí)，發(fā)酵脫脂乳粉可以在4 h內(nèi)凝乳，發(fā)酵產(chǎn)品活菌數(shù)為5.4×107 CFU/ mL，酸度達(dá)到78.1°T，pH為4.50，發(fā)酵性能較好。[結(jié)論]該研究為乳酸菌在實(shí)際生產(chǎn)中更好的應(yīng)用提供理論。

關(guān)鍵詞 保加利亞乳桿菌；嗜熱鏈球菌；分離純化；菌種搭配；添加比例

中圖分類號(hào) TS252.54 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）17-0179-04

Abstract [Objective] The research aimed to study the separation， purification， fermentation performance and addition ratio of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus when making yogurt. [Method] Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus were isolated by selective medium， and their fermentation performance and passaging characteristics were determined. Finally， Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus with good fermentation performance were selected.The isolated Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus were mixed fermented in skim milk in different ratios， and the optimum addition ratio of the two was determined.[Result]During the fermentation of yoghurt， when the ratio of Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus was 1∶1， the fermented skim milk powder could be curd within 4 h， the viable cell count of the fermented product was 5.4×107 CFU/ mL， and the acidity reaches 78.1 °T， pH was 4.50， and the fermentation performance was better.[Conclusion]This study provides a theoretical basis for better application of Lactobacillus in actual production.

Key words Lactobacillus bulgaricus；Streptococcus thermophilus；Separation and purification；Matching of bacteria；Proportion of addition

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）是乳酸菌類的益生菌，也是人體腸道中的重要微生物，二者作為發(fā)酵乳制品重要的發(fā)酵劑菌種而被廣泛應(yīng)用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和研究價(jià)值[1]。菌種的選擇和發(fā)酵劑的制備不僅影響酸奶和發(fā)酵乳飲料的產(chǎn)品質(zhì)量，而且還直接影響酸奶和發(fā)酵乳飲料的產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)效益[2]。有研究表明，保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌存在互惠共生作用，將不同的乳酸菌進(jìn)行組合可以發(fā)揮其不同的發(fā)酵性能[3]。因此，選擇發(fā)酵性能好的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，并掌握生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酸奶和發(fā)酵乳飲料的最佳添加比例是一個(gè)關(guān)鍵。

普通乳酸菌發(fā)酵劑的特點(diǎn)是菌種純正，發(fā)酵性能穩(wěn)定，發(fā)酵產(chǎn)物除了乳酸外，還有一定量的風(fēng)味物質(zhì)、維生素、抗菌物質(zhì)等[4]。該試驗(yàn)采用梯度稀釋涂布法從酸奶中分離純化

乳酸菌，選擇出發(fā)酵性能好的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，將分離出來的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以不同比例在脫脂乳中進(jìn)行混合菌株發(fā)酵，依據(jù)發(fā)酵性能確定制作酸奶時(shí)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最佳添加比例，為其在實(shí)際生產(chǎn)中更好的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。MRS固體培養(yǎng)基[5]；M17固體培養(yǎng)基[6]；復(fù)原脫脂乳培養(yǎng)基（菌種培養(yǎng)用）；滅菌生理鹽水（梯度稀釋用）；酚酞指示劑。

1.1.2 儀器與設(shè)備。

試管、移液管、培養(yǎng)皿、玻璃棒、玻璃珠、燒杯、三角瓶、載玻片、堿式滴定管、量筒、溫度計(jì)，具體型號(hào)規(guī)格和廠家見表1。

1.2 方法

1.2.1 基本工藝設(shè)計(jì)路線。

菌種分離純化→菌種的搭配→菌種的傳代→確定最終菌株及添加比例。最終依據(jù)發(fā)酵性能選擇一種比較好的普通乳酸菌發(fā)酵劑配方，發(fā)酵性能的好壞主要通過酸度和pH的測(cè)定。

1.2.2 菌種的分離。

首先，將市售的酸奶樣品進(jìn)行涂片、美藍(lán)染色鏡檢觀察，確定樣品中發(fā)酵劑含有保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌。然后用一支10 mL無菌移液管吸取10 mL酸奶樣品，放入盛有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，用微型旋渦混合器振搖30 s左右，使酸奶樣品與無菌水充分混合，將細(xì)菌分散。用一支1 mL無菌移液管吸取1 mL酸奶懸液，加入盛有9 mL無菌水的試管中充分混勻，再用一支無菌移液管從此試管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同稀釋度的酸奶溶液（注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管和移液管）。最后，取6個(gè)倒入MRS固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿分別貼上10-3、10-4、10-5 3個(gè)稀釋度各2個(gè)標(biāo)簽，用無菌吸管分別由10-3、10-4、10-5 3管酸奶稀釋液中吸取0.5 mL，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)皿表面中央位置。用無菌玻璃棒涂勻，右手拿無菌涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5～10 min，使菌液浸入培養(yǎng)基。同樣的操作加入M17固體培養(yǎng)基再做1次。

將培養(yǎng)皿放在37.5 ℃的數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，挑起單個(gè)典型菌落進(jìn)行鏡檢，以確保是否是單菌的菌落，若不是則反復(fù)進(jìn)行以上操作，直至得到單菌落；反之則進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

1.2.3 菌種的純化。

挑選典型的球菌和桿菌的單個(gè)菌落接種于脫脂乳中增菌復(fù)壯培養(yǎng)，然后再進(jìn)行平板分離，每個(gè)平板一般挑選5～7個(gè)典型菌落，凝固后鏡檢，檢驗(yàn)脫脂乳中是否有桿菌或球菌的增殖，剔除含污染菌的發(fā)酵管，選取較純的發(fā)酵乳管再經(jīng)梯度稀釋，涂布平板培養(yǎng)，以進(jìn)一步純化，并用脫脂乳發(fā)酵做凝乳試驗(yàn)并滴定酸度，選取發(fā)酵性能好的桿菌和球菌。

1.2.4 菌種的搭配。

分別在50 mL脫脂乳（經(jīng)過保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌凝乳發(fā)酵）中接入菌種，總接種量為3%，兩菌之比為1∶1，在42.5 ℃的數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。根據(jù)發(fā)酵特性，選出發(fā)酵效果較好、凝乳時(shí)間較短的組合。

1.2.5 菌種的傳代和穩(wěn)定性測(cè)試。

將挑選出來的發(fā)酵性能較好的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行傳代，用以檢測(cè)菌種的穩(wěn)定性。每次取3%的接種量加入到50 mL無菌的脫脂乳中，在42.5 ℃的數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)直至剛好凝乳，記錄凝乳時(shí)間，并測(cè)定pH和酸度。通過各項(xiàng)指標(biāo)確定菌種的穩(wěn)定性。

1.2.6 菌種的比例搭配。

將挑選出發(fā)酵效果好的組合，分別再次接入無菌的脫脂乳中（按照保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例為1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、2.0∶1.0、1.5∶1.0，總接種量為3%），在42.5 ℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵，凝乳后停止，進(jìn)行美藍(lán)染色并在顯微鏡下鏡檢，觀察凝乳后的脫脂乳中球菌和桿菌的比例。通過測(cè)定凝乳時(shí)間、酸度、pH等指標(biāo)來確定保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的最適添加比例。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目

1.3.1 酸度的測(cè)定。

采用滴定酸度法，以吉爾涅爾度表示（°T）。取10 mL牛乳，用20 mL蒸餾水稀釋，加入0.5%的酚酞指示劑0.5 mL，以0.1 mol/L溶液滴定，將所消耗的NaOH毫升數(shù)乘以10，即為中和100 mL牛乳所需的0.1 mol/L NaOH毫升數(shù)，每毫升為1°T，也稱1度[7]。

1.3.2 pH的測(cè)定。

采用兩點(diǎn)校正法，用實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)直接測(cè)定。

1.3.2.1 酸度計(jì)的校正。將電極放入緩沖液中，并按校準(zhǔn)鍵，開始校準(zhǔn)，校準(zhǔn)和測(cè)量圖標(biāo)將同時(shí)顯示，在信號(hào)穩(wěn)定后，儀表根據(jù)預(yù)選終點(diǎn)方式終點(diǎn)或按度數(shù)鍵終點(diǎn)。再用去離子水沖洗電極，將電極放入下一個(gè)校準(zhǔn)緩沖液中，并按校準(zhǔn)鍵開始下一點(diǎn)校準(zhǔn)。

1.3.2.2

樣液的測(cè)定。用無CO2蒸餾水淋洗電極，并用濾紙吸干，再用待測(cè)樣液沖洗電極，將電極插入待測(cè)樣液中，按下度數(shù)開關(guān)，穩(wěn)定1 min后，酸度計(jì)所顯示的數(shù)值即為待測(cè)樣液的pH。

1.3.3 凝乳時(shí)間的測(cè)定。

每次接種后的脫脂乳粉應(yīng)放入42.5 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至凝乳后取出，記錄時(shí)間。凝乳后的脫脂乳粉應(yīng)放在4 ℃的條件下保存。

1.3.4 菌種比例情況。通過顯微鏡涂片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的篩選

嗜熱鏈球菌在M17固體培養(yǎng)基上生長，形成卵圓形，表面光滑的黃色凸起菌落，菌落較大，菌落直徑為1～2 mm。由于pH 7.1不適合保加利亞乳桿菌的生長，所以M17固體培養(yǎng)基上基本沒有保加利亞乳桿菌，或形成模糊不清的羊毛狀菌落，易與嗜熱鏈球菌分開。

保加利亞乳桿菌在MRS固體培養(yǎng)基上生長，形成形狀不規(guī)則、表面粗糙的白色凸起菌落，菌落直徑為1～3 mm。由于5.4的pH不適合嗜熱鏈球菌的生長，所以MRS固體培養(yǎng)基上基本沒有嗜熱鏈球菌的菌落。

通過美藍(lán)染色在顯微鏡下觀察，嗜熱鏈球菌呈卵圓形，單個(gè)細(xì)菌直徑為0.7～0.9 μm，多個(gè)細(xì)菌組織形態(tài)一般成對(duì)或形成長鏈狀，無運(yùn)動(dòng)性。保加利亞乳桿菌無運(yùn)動(dòng)性，兩端鈍圓，細(xì)桿狀，多個(gè)細(xì)菌成單或成鏈，單個(gè)細(xì)菌在乳中長度是0.9～5.0 μm。

2.2 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的特性測(cè)定

分別挑取分離出的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌落各10株，經(jīng)復(fù)原脫脂乳初次培養(yǎng)，篩選出性能較好的4株球菌、2株桿菌，再分別以3%接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%復(fù)原脫脂乳培養(yǎng)基，42.5 ℃發(fā)酵至凝乳，觀察記錄凝乳時(shí)間、滴定酸度和pH。

從表2可以看出，4株球菌和2株桿菌的pH終點(diǎn)在5%水平上差異均不顯著。桿菌2的pH最大，球菌4的最小。

而滴定酸度球菌3的數(shù)值最大，球菌2的數(shù)值最小，它們之間存在著4.1°T的差異，且最小的滴定酸度66.9°T也滿足生產(chǎn)酸奶的需要。在酸度上，球菌1、桿菌2與球菌3、桿菌1差異顯著，球菌2與球菌3、球菌4、桿菌1差異也顯著。由此可見，以上各株菌種產(chǎn)酸活性都可以達(dá)到發(fā)酵性能優(yōu)良的要求，所以這6株都可以作為發(fā)酵劑的菌株來使用。

2.3 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的搭配發(fā)酵試驗(yàn)

酸奶是由保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵產(chǎn)生的，兩者具有良好的相互促進(jìn)生長的關(guān)系，兩者在一起的產(chǎn)酸速度高于兩者之中單一的產(chǎn)酸速度。保加利亞乳桿菌經(jīng)代謝活動(dòng)，分解乳蛋白質(zhì)產(chǎn)生不同的代謝物質(zhì)，主要是肽類和氨基酸類物質(zhì)，如甘氨酸和組氨酸等作為刺激因素，促進(jìn)了嗜熱鏈球菌的生長；同樣，嗜熱鏈球菌在生長過程中產(chǎn)生的一些物質(zhì)，主要是甲酸類化合物，促進(jìn)了保加利亞乳桿菌的生長。

選取發(fā)酵活力高的球菌（球菌1、球菌2、球菌3、球菌4）和桿菌（桿菌1、桿菌2），將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合起來進(jìn)行搭配試驗(yàn)。發(fā)酵溫度為42.5 ℃，總接種量為3%，起始pH相同，且桿菌與球菌的比例為1∶1。試驗(yàn)數(shù)據(jù)如表3所示。

比較表2和表3發(fā)現(xiàn)，在相同的凝乳條件下，桿菌1與各個(gè)球菌組合的混菌的凝乳時(shí)間比單一的桿菌1的凝乳時(shí)間多0.5 h，桿菌1+球菌3的pH終點(diǎn)（4.84）比桿菌1的pH終點(diǎn)（4.79）大0.05。桿菌2與各個(gè)球菌組合的混菌的凝乳時(shí)間比單一桿菌的凝乳時(shí)間縮短了0.5 h。從酸度上看，桿菌2與4株球菌的搭配都大于桿菌2單獨(dú)發(fā)酵的酸度。造成以上現(xiàn)象的原因是與不同的桿菌和球菌生長動(dòng)力學(xué)特異性有關(guān)。從pH上看，4種球菌和2種桿菌搭配之間差異均不顯著。從滴定酸度上看，桿菌2+球菌3、桿菌2+球菌4差異不顯著。從整體上來看，pH較好的為桿菌2+球菌1、桿菌2+球菌2，數(shù)值分別為4.69、4.70；滴定酸度較好的為桿菌2+球菌1、桿菌2+球菌2，分別為75.2、73.1 °T。所以選擇桿菌2和球菌1、球菌2的組合搭配。

通過對(duì)桿菌2+球菌1、桿菌2+球菌2兩組發(fā)酵乳涂片，并在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)桿菌與球菌的比例約為1∶1。

2.4 菌種的傳代試驗(yàn)

所謂菌種退化，主要是指生產(chǎn)菌或選育過程中篩選出來的較優(yōu)良菌株，由于菌種進(jìn)行接種傳代或保藏之后，會(huì)出現(xiàn)群體中的某些生理特征和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象[8]。集中表現(xiàn)在目的代謝物合成能力降低，產(chǎn)量下降。

菌種活性退化會(huì)對(duì)以后生產(chǎn)酸奶的過程有影響，菌種活性退化嚴(yán)重將限制以后生產(chǎn)酸奶時(shí)菌種的使用時(shí)間和次數(shù)，所以應(yīng)對(duì)桿菌2和球菌1、球菌2做傳代試驗(yàn)，研究這3株菌和桿菌與球菌搭配的2種混菌產(chǎn)酸活性退化是否嚴(yán)重。發(fā)酵條件是溫度37.5 ℃，接種量3%，混菌發(fā)酵桿菌與球菌比例為1∶1，起始pH相同。

從表4可以看出，桿菌2傳代前2次的pH相同，不存在顯著差異，從第3代起pH具有顯著性差異，滴定酸度與pH終點(diǎn)的變化差異基本相同，具有相同的趨勢(shì)。從整體上來看，不論是pH終點(diǎn)還是滴定酸度都存在顯著性變化，所以桿菌2有退化的現(xiàn)象。

從2株球菌的傳代數(shù)據(jù)（表5）來看，隨著傳代次數(shù)的增加，其pH終點(diǎn)和滴定酸度都發(fā)生了顯著性變化，但由于在第5代時(shí)2個(gè)菌種的滴定酸度還可以穩(wěn)定在60°T左右，表明它們的穩(wěn)定性比桿菌2好。這可能是由于桿菌的細(xì)胞大，在傳代過程中易變形所致。菌種退化不是突然變化的，而是從量變到質(zhì)變的逐步演變的過程。開始時(shí)，在群體細(xì)胞中僅出現(xiàn)產(chǎn)量下降的個(gè)別突變細(xì)胞，不會(huì)使群體菌株性能明顯改變。經(jīng)過連續(xù)傳代，負(fù)變細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量，在群體中占了優(yōu)勢(shì)，從整體菌株上反映產(chǎn)量下降及其相關(guān)的一些特性發(fā)生了變化，表現(xiàn)上便出現(xiàn)了退化。

從混菌發(fā)酵的傳代數(shù)據(jù)（表6）可以看出，比較桿菌2與球菌1和球菌2的搭配菌種活性退化趨勢(shì)與單菌種的退化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，混菌的傳代穩(wěn)定性較好，主要是pH和酸度的數(shù)值變化不大，傳代5次與第1次的pH和酸度相差不大。所以桿菌2+球菌1、桿菌2+球菌2的傳代性能較好。

分別對(duì)桿菌2+球菌1、桿菌2+球菌2的每一代進(jìn)行涂片觀察，發(fā)現(xiàn)在前2代桿菌與球菌的比例為1.0∶1.0～1.5∶1.0，隨著傳代次數(shù)的增加，桿菌所占的比例不斷增大。

2.5 保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的搭配比例試驗(yàn)

對(duì)于酸奶良好風(fēng)味的形成，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌在發(fā)酵過程中要保持大約相同的數(shù)量。當(dāng)酸度到達(dá)一定程度，球菌不再生長，相對(duì)而言，桿菌較為耐酸。球菌和桿菌的菌株特性必須要相互適配，并不是所有菌株的配合都是適宜的。

球菌和桿菌的比例在不斷變化，起始時(shí)由于桿菌產(chǎn)生的刺激因子，球菌生長較快，之后由于酸的積累，球菌生長緩慢；后來，由于球菌產(chǎn)生的甲酸和二氧化碳，桿菌快速生長，最后兩者比例達(dá)到初始發(fā)酵時(shí)的比例，接種量增大會(huì)加快產(chǎn)酸速度，這樣很快會(huì)使球菌生長停止，導(dǎo)致桿菌比例增高（在相同培養(yǎng)時(shí)間情況下）；接種量少，則相反。所以該試驗(yàn)對(duì)桿菌和球菌進(jìn)行了比例搭配試驗(yàn)，試驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)如表7所示。發(fā)酵的條件是溫度42.5 ℃，總接種量3%，起始pH相同。

從表7可以看出，桿菌2與球菌1和球菌2以1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、2.0∶1.0、1.5∶1.0的比例搭配時(shí)，pH均沒有顯著差異，桿菌2和球菌1、球菌2搭配的滴定酸度是有顯著性的。當(dāng)桿菌2與球菌1混合時(shí)，比例為1.0∶1.0時(shí)，它的滴定酸度是最大的，且pH最??；比例以1.0∶1.5混合時(shí)，滴定酸度次之。桿菌2與球菌1、球菌2在以2.0∶1.0混合時(shí)，滴定酸度均是同條件下不同菌種比例時(shí)的最低。另外保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例是1.0∶1.0時(shí)乳凝固狀態(tài)最好，故當(dāng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的比例是1.0∶1.0時(shí)兩菌共生效果較好，發(fā)酵酸奶時(shí)用此比例更適合。

對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌之比為1.0∶1.0且凝乳狀態(tài)最好的酸奶采用平板菌落計(jì)數(shù)法，測(cè)得活菌數(shù)為5.4×107CFU/mL。

3 結(jié)論

通過對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的特性測(cè)定，選擇出2株桿菌、4株球菌，它們的pH為4.73～4.83，酸度為66.9～71.1°T。

通過將桿菌1、桿菌2分別與球菌1、2、3、4按1∶1（總接種量為3%）的比例搭配發(fā)酵，選擇出凝乳時(shí)間均為4 h的桿菌2+球菌1、桿菌2+球菌2的兩組搭配，pH分別為4.69、4.70，酸度分別為75.2、73.1°T。

通過對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的搭配比例試驗(yàn)，得出保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌之比為1∶1時(shí)，兩菌共生效果好，更適合酸奶發(fā)酵。

綜上所述，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的添加比例為1∶1時(shí)，發(fā)酵脫脂乳粉可以在4 h內(nèi)凝乳，發(fā)酵產(chǎn)品活菌數(shù)為5.4×107 CFU/mL，酸度達(dá)78.1°T，pH為4.50，發(fā)酵性能較好。

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