孫小涵 寇興然　呂文平　王洪新

摘要 [目的]研究制備佛手精油納米乳的工藝及納米乳對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用。[方法]以佛手精油和MCT混合為油相，吐溫（Tween-80）為表面活性劑，通過(guò)高壓均質(zhì)法制備佛手精油納米乳（O/W型），并探討納米乳對(duì)HT-29細(xì)胞增殖的抑制作用。以粒徑大小和多分散性指數(shù)（PDI）為指標(biāo)優(yōu)選高壓均質(zhì)法參數(shù)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)納米乳對(duì)細(xì)胞增殖的抑制影響。[結(jié)果]油相質(zhì)量百分比10%（佛手精油和MCT質(zhì)量比4 ∶1），乳化劑的質(zhì)量百分比2.00%，在均質(zhì)壓力10 000 Psi，均質(zhì)次數(shù)3次的工藝條件下，得到的佛手精油納米乳粒徑為100～120 nm，PDI在0.3以下。[結(jié)論]佛手精油納米乳對(duì)HT-29細(xì)胞增殖有明顯抑制效果，且呈劑量依賴型。

關(guān)鍵詞 佛手精油；納米乳；抑制

中圖分類號(hào) S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）18-0144-06

Preparation of Jinhua Fingered Citron Essential Oil Nanoemulsion and Its Inhibitory Effect on Proliferation of HT29 Cells in vitro

SUN Xiaohan1，2，KOU Xingran1，2， L Wenping1，2 et al

（1. The State Key Laboratory of Food Science & Technology，Wuxi，Jiangsu 214000；2. School of Food Science & Technology， Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214000）

Abstract [Objective]To study the process of preparing fingered citron essential oil nanoemulsion，and the inhibitory effect of nanoemulsion on the proliferation of HT29 cells.[Method]This article studied the process of preparing fingered citronessential oil nanoemulsion （O/W type） by highpressure homogenization， using fingered citron essential oil and MCT mixed as oil phase and Tween80 as surfactant. The inhibitory effect of nanoemulsion on the proliferation of HT29 cells was explored. The parameters of highpressure homogenization method were used as the index of particle size and PDI， and the inhibitory effect of nanoemulsion on cell proliferation was detected by MTT assay. [Result]The mass percentage of oil phase was 10% （mass ratio of fingered citron essential oil and MCT was 4 ∶1）， the mass percentage of emulsifier was 2.00%， and it was obtained under the conditions of homogeneous pressure of 10 000 Psi and 3 times of homogenization.The fingered citron essential oil nanoemulsion had a particle size of 100-120 nm and a PDI less than 0.3.[Conclusion]The fingered citron essential oil nanoemulsion significantly inhibited the proliferation of HT29 cells in a dosedependent manner.

Key words Fingered citron essential oil；Nanoemulsion；Inhibition

佛手（fingered citron），學(xué)名Citrus medica L.var.Sarcodactylis Swingle，又名佛手香櫞、蜜柑、蜜羅柑、福壽柑、五指柑等，屬蕓香科柑橘屬香櫞的變種，為常綠小喬木或灌木[1]。金華佛手主產(chǎn)于金華市赤松鎮(zhèn)山口等地，其果揮發(fā)油含量高達(dá)1.6%，所得揮發(fā)油為無(wú)色透明液體，芳香撲鼻，香氣極為濃郁。有研究表明，佛手精油主要成分是萜烯類、倍半萜烯類以及高級(jí)醇類、醛類、酮類、酯類等多種生理活性物質(zhì)，具有較高的藥用價(jià)值，具有祛痰、止咳、平喘、抗焦慮、抗菌消炎和去除自由基等作用[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，植物精油具有廣泛的藥理活性，可有效抑制肝癌、子宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、人白血病細(xì)胞、人卵巢癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞增殖，是一類具有開發(fā)價(jià)值的抗腫瘤中藥[3-6]。

植物精油常溫下不穩(wěn)定，易揮發(fā)，在水中的溶解度極低。在儲(chǔ)藏過(guò)程中散失，導(dǎo)致其活性降低，該試驗(yàn)選擇納米乳為基質(zhì)，以提高其穩(wěn)定性和溶解度，且制備過(guò)程在室溫下進(jìn)行，有效地降低了精油損耗，從而達(dá)到緩釋的目的。

納米乳是一種液相以液滴形式分散于第二相的膠體分散體系，屬于非熱力學(xué)穩(wěn)定體系，顆粒粒度為50～200 nm[7-8]。納米乳因其納米級(jí)粒徑可防止聚集和重力引起的乳液分離，具有抗沉降和乳析的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定特性，精油納米級(jí)乳化體系可以提高精油的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度[9]。筆者研究了佛手精油納米乳的制備工藝及其對(duì)HT-29細(xì)胞體外增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮金華佛手（浙江金手寶生物科技有限公司）；聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯（Tween-80）（化學(xué)純，上海國(guó)藥集團(tuán)）；磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、無(wú)水硫酸鈉、二甲基亞砜（分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)）；亞甲基藍(lán)、蘇丹紅（指示劑，上海國(guó)藥集團(tuán)）；中鏈甘油三酯（MCT，上海慈太龍實(shí)業(yè)有限公司）；人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)）；綿羊血（無(wú)菌，杭州新銳生物工程有限公司）；RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素溶液、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

納米粒度及Zeta電位分析儀（Zetasizer nano ZS）（英國(guó)馬爾文公司）；高速剪切機(jī)（德國(guó)IKA公司）；NanoFast-15A型高壓均質(zhì)機(jī)（MORGEC公司）；HZT-A600型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；JEM-2010HT透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；DG250小型厭氧工作站（英國(guó)DWS公司）；生物安全柜（美國(guó)Labconco公司）；BD150L三氣培養(yǎng)箱（德國(guó)Bingd公司）；PYX-DHS隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；磁力攪拌器（德國(guó)IK-A公司）；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋公司）；通風(fēng)櫥（上海飛域公司）；Leica DM2000顯微鏡（德國(guó)Leica光學(xué)儀器公司）；HEPA Class 100型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛公司）；UV-2100紫外可見分光光度計(jì)（優(yōu)尼科上海有限公司）；5242R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；DK-S12恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SP-250生化培養(yǎng)箱（南京實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.3 佛手精油的制備

稱取適量的成熟新鮮金華佛手，洗凈切塊，經(jīng)高速組織搗碎機(jī)破碎后轉(zhuǎn)移至燒瓶中，加入適量的去離子水，加入沸石，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管。用電熱套緩緩并保持微沸約4 h。收集精油，加入適量的無(wú)水硫酸鈉，在6 000 r/min、4 min、25 ℃的條件下離心進(jìn)行油水分離，即可得到佛手精油產(chǎn)品。

1.4 佛手精油納米乳的制備

將MCT和佛手精油按比例混合即為油相，向其中加入適量的Tween-80，混合均勻后將混合液倒入磷酸緩沖液（pH=7，0.5 mmol）中，使樣品總質(zhì)量達(dá)50 g。用高速剪切機(jī)10 000 r/min剪切5 min，得粗乳，使用高壓均質(zhì)機(jī)10 000 Psi，均質(zhì)3次，即得佛手精油納米乳。

1.5 佛手精油納米乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.5.1 佛手精油納米乳類型的鑒定。

通過(guò)染色法[10]鑒定納米乳類型。分別將油溶性的蘇丹紅溶液和水溶性的亞甲基藍(lán)溶液滴到制備好的納米乳中，觀察2種染色劑在納米乳中的擴(kuò)散速度，如果蘇丹紅的擴(kuò)散速度大于亞甲基藍(lán)，該乳液為油包水型（W/O）；如果亞甲基藍(lán)的擴(kuò)散速度大于蘇丹紅，該乳液為水包油型（O/W）；二者擴(kuò)散速度相同則為雙連續(xù)型。

1.5.2 佛手精油納米乳形態(tài)觀察。

取適量的佛手精油納米乳樣品，用磷酸緩沖液稀釋100倍后，滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2.0%的磷鎢酸負(fù)染30 s，自然揮干，在透射電鏡下觀察納米乳的形態(tài)[11]。

1.5.3 佛手精油納米乳的穩(wěn)定性。

將制備好的納米乳裝入玻璃瓶中，密封，在4、25、40 ℃的條件下，放置0、5、10 d，取適量稀釋后的納米乳于離心管中，15 000 r/min離心20 min，觀察是否出現(xiàn)絮凝、聚結(jié)、分層絮凝現(xiàn)象。

1.6 佛手精油納米乳抑制HT29細(xì)胞體外增殖作用

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)。

將HT-29細(xì)胞加凍存液保存于液氮（-196 ℃）中。復(fù)蘇時(shí)，置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640細(xì)胞完全培養(yǎng)液，于5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，每2 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%，用0.25%胰酶-EDTA消化傳代，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，通常2 d更換培養(yǎng)液，4 d進(jìn)行傳代，傳代5次左右進(jìn)行試驗(yàn)。

1.6.2 精油及其納米乳對(duì)HT-29細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響的觀察。

將生長(zhǎng)融合至70%～80%的HT-29細(xì)胞進(jìn)行消化，調(diào)整濃度至2×105 個(gè)/mL，將無(wú)菌蓋玻片放置在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)懸液，于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層時(shí)，用PBS清洗3次，加入含有精油及其納米乳的RPMI-1640完全培養(yǎng)液（精油及其納米乳的濃度梯度為0、31.25、62.50、125.00、250.00 μg/mL），于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，取出蓋玻片后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.6.3 MTT法測(cè)定精油及其納米乳對(duì)HT-29細(xì)胞體外增殖的抑制。

采用0.25%胰酶-EDTA消化生長(zhǎng)融合至70%～80%的HT-29細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×104個(gè)/mL，每孔加入200 μL細(xì)胞培養(yǎng)懸液于96孔板中，5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)上清液，PBS清洗3次，加入含精油及其納米乳的RPMI-1640完全培養(yǎng)液（精油及其納米乳的濃度梯度為0、31.25、62.50、125.00、250.00 μg/mL），每種濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白納米乳和空白對(duì)照組，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去上清液，每孔加入DMSO150 μL，室溫置于微量振蕩器上振蕩10 min，自動(dòng)酶標(biāo)儀（570 nm）下測(cè)量各孔的吸光度值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：

檸檬精油納米乳同時(shí)被作為對(duì)照進(jìn)行了研究。由圖7可知，細(xì)胞在檸檬精油納米乳的最低濃度（31.25 μg/mL）下處理24 h后便體現(xiàn)出明顯的凋亡特征，其效果高于佛手精油納米乳。

2.3.2 MTT法測(cè)定佛手精油及其納米乳對(duì)HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可將四唑鹽類物質(zhì)（MTT）還原為紫色的結(jié)晶物，沉淀在細(xì)胞周圍，而死細(xì)胞無(wú)此功能，二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值，從而檢測(cè)到細(xì)胞增殖狀態(tài)，這種方法快速、靈活，是一種比較常用的檢測(cè)細(xì)胞增殖的手段。

由圖8可知，不同濃度的佛手精油和佛手精油納米乳（31.25、62.50、125.00、250.00 μg/mL）作用于HT-29細(xì)胞后，細(xì)胞抑制率分別為10.8%、20.4%、41.2%、53.7%和10.7%、35.9%、71.3%、78.3%?？瞻讓?duì)照組與空白納米乳組之間并無(wú)顯著性差異。這種現(xiàn)象說(shuō)明將佛手精油制成納米乳之后，在相同的濃度下，佛手精油納米乳抑制細(xì)胞增殖的效果大大增強(qiáng)，但是這種增強(qiáng)效果并不是由納米乳基質(zhì)造成的。通過(guò)和檸檬精油納米乳對(duì)比，佛手精油納米乳與檸檬精油納米乳對(duì)細(xì)胞的抑制率相似。

試驗(yàn)中佛手精油納米乳對(duì)細(xì)胞的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于佛手精油，可能是由于納米乳的顆粒小、比表面積大、吸附能力更強(qiáng)，可以很快地吸附在細(xì)胞表面。由于納米乳中表面活性劑的親水親油性，更有利于精油在水中的溶解。納米乳作為佛手精油的藥物載體，協(xié)助精油跨過(guò)細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度相對(duì)升高，明顯增強(qiáng)藥效。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡受阻可能是腫瘤發(fā)病的重要機(jī)制，治療腫瘤的新思路趨向于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。該試驗(yàn)研究了高壓均質(zhì)法制備佛手精油納米乳的最佳工藝：油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%（MCT ∶佛手精油為1 ∶4），乳化劑2.00%，用高速剪切機(jī)10 000 r/min剪切5 min，高壓均質(zhì)機(jī)10 000 Psi，均質(zhì)3次。并采用不同濃度的佛手精油及其納米乳作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29，MTT法檢測(cè)不同藥物對(duì)HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果表明62.50 μg/mL的佛手精油就可抑制HT-29細(xì)胞的增殖，同等濃度下，佛手精油納米乳的抑制效果遠(yuǎn)高于精油原液。試驗(yàn)測(cè)得3種納米乳的IC50分別為佛手精油201.039 μg/mL，檸檬精油納米乳98.159 μg/mL，佛手精油納米乳91.246 μg/mL。隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴型。說(shuō)明佛手精油及其納米乳對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞有一定的抑制作用，但抑制機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

有研究表明，佛手精油中的主要成分是萜類物質(zhì)檸檬烯和蒈烯。經(jīng)前期試驗(yàn)，佛手精油的主要成分為D-檸檬烯，檸檬精油的主要成分為（-）-檸檬烯，其相對(duì)含量分別占53.26%和79.27%。早在20世紀(jì)70年代，人們就發(fā)現(xiàn)檸檬烯具有抗腫瘤活性。檸檬烯抗癌機(jī)制主要有化學(xué)預(yù)防作用、抑制細(xì)胞周期與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等。近年來(lái)，人們對(duì)檸檬烯的抗癌活性進(jìn)行了廣泛的研究，并發(fā)現(xiàn)其抗癌功效具有廣譜性[16]，對(duì)乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等均具有抑制作用，并能減輕各種癌癥帶來(lái)的損傷[17]。麻艷芳等[18]研究結(jié)果表明，佛手揮發(fā)油具有抑制MDA-MB-435癌細(xì)胞增殖的作用，低、中濃度的佛手揮發(fā)油誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡且將細(xì)胞周期阻滯在S期和G2/M期，而高濃度的佛手揮發(fā)油引起細(xì)胞壞死。呂學(xué)維等[19]研究結(jié)果表明佛手揮發(fā)油可有效殺傷體外培養(yǎng)的小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞，低中劑量的佛手揮發(fā)油可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，高劑量的佛手揮發(fā)油可致細(xì)胞壞死。

該研究證實(shí)了佛手精油及其納米乳對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴型。說(shuō)明佛手精油及其納米乳對(duì)人類結(jié)腸癌細(xì)胞有一定的抑制作用，但抑制機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

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