邢海 聞秀娟 楊萌 智永祺 孫葉芳 宋錦

摘要 [目的]研究藍(lán)鏡玉露的離體培養(yǎng)與快速繁殖。[方法] 藍(lán)鏡玉露花蕾接種于不同培養(yǎng)基后，研究不同生長調(diào)節(jié)劑及其配比對其愈傷組織誘導(dǎo)、分化、增殖及植株再生的影響。[結(jié)果]適宜的外植體培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂 7 g/L，外植體脫分化速度快，愈傷組織質(zhì)量好；適宜的分化培養(yǎng)基為MS+6- BA 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂 7 g/L；適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.4 mg/L+TDZ 0.3 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂 7 g/L，增殖系數(shù)達(dá)5.0。對增殖后的組培苗無需生根處理直接煉苗，煉苗生根成活率高達(dá)95%以上。[結(jié)論]通過藍(lán)鏡玉露的花蕾再生及組培快繁可為工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 瓦葦屬；藍(lán)鏡玉露；多肉；組織培養(yǎng)

中圖分類號 S682.23文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）31-0042-03

Abstract [Objective] To study the in vitro culture and rapid propagation of Blue Mirror Jade Dew. [Method] After the flower buds of Blue Mirror Jade Dew was inoculated onto different culture mediums， we researched the effects of different growth regulators and their mixtures on callus induction， differentiation， proliferation and plant regeneration. [Result] The suitable explant culture medium was MS+6BA 1.0 mg/L+TDZ 0.3 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 7 g/L， and the explants dedifferentiated quickly and the callus quality was good under these conditions. The suitable differentiation medium was MS+6 BA 1 mg/L+TDZ 0.5 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 7 g/L. The suitable proliferation medium was MS+6BA 0.4 mg/L+TDZ 0.3 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 7 g/L， and the proliferation coefficient was 5.0 under these conditions. After the propagation of the tissue culture seedlings， no rooting treatment was needed， and the survival rate of the seedlings was as high as 95%. [Conclusion] The study of flower bud regeneration and tissue rapid propagation of Blue Mirror Jade Dew can provide a theoretical basis for largescale production.

Key words Haworthia；Blue Mirror Jade Dew；Succulent；Tissue culture

藍(lán)鏡玉露為百合科瓦葦屬中軟葉類多肉植物，原產(chǎn)非洲。其株型緊湊、矮壯，三角窗圓頂，有頂毛，葉片兩側(cè)有側(cè)毛，葉片背部有兩條背毛，皮色油亮，曬后呈現(xiàn)出深邃而內(nèi)斂的藍(lán)光，糯窗，這是該品種的典型特征，故名“藍(lán)鏡玉露”。由于多肉植物具有較高的觀賞價值，因此藍(lán)鏡玉露已成為園藝植物愛好者喜愛栽培的植物類型，但由于瓦葦屬植物具有自交不親和性[1-2]，因此大多采用分株、葉插等方法繁殖[3-4]，但這些繁殖方法容易損害母本，且繁殖系數(shù)小[5]、繁殖速度慢，因此無法滿足市場需求，價格居高不下[6]。離體組培繁苗是快速繁殖的最有效方法，目前國內(nèi)外對瓦葦離體組織培養(yǎng)已有報道，如藍(lán)鏡玉露同屬的康平壽[7]、克里克特壽[8]、西山壽[9]、美吉壽[10]和白銀壽[11]、冰燈玉露、黒肌玉露[6]、姬雜玉露[12]等。目前，對藍(lán)鏡玉露的的組織培養(yǎng)鮮見報道。鑒于此，筆者以瓦葦屬藍(lán)鏡玉露的花葶及幼嫩花蕾為外植體，研究了不同生長調(diào)節(jié)劑及其配比對藍(lán)鏡玉露愈傷組織誘導(dǎo)、分化、增殖及植株再生的影響，為多肉植物藍(lán)鏡玉露的離體快繁提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試藍(lán)鏡玉露由紹興市貓咪爪園藝場提供，選擇幼嫩花蕾為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初代培養(yǎng)。

外植體滅菌時間的篩選：將藍(lán)鏡玉露去除閉合花蕾的外苞片，再將花蕾連同花柄逐個切下。外植體經(jīng)流水沖洗 20 min 以上，用洗潔精浸泡 30 min后用自來水沖洗干凈，超凈臺上用75%乙醇沖洗 30 s，無菌水沖洗3～5次，用 0.1% HgCl2 溶液進(jìn)行滅菌處理6 min，并不停的攪拌使消毒更徹底，最后用無菌水清洗5～6次。將表面滅菌的材料浸泡在無菌水中待用。并將花柄切除 2～4 mm，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)基。

以 MS 培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，根據(jù)試驗(yàn)階段不同，分別添加不同濃度和配比的 TDZ、6-BA、KT 及 NAA。附加3.0%的蔗糖和 0.7 %的瓊脂，滅菌前pH調(diào)整為 5.8。

1.2.3 培養(yǎng)條件。

材料接種于不同培養(yǎng)基后，以（25±2）℃ 為培養(yǎng)溫度，光照強(qiáng)度約為 1 500～2 000 lx，光照時間為 12 h/d。

1.2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對外植體誘導(dǎo)的影響。

將藍(lán)鏡玉露外植體接種于不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（①M(fèi)S+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；②MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L；③MS+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.3 mg/L），每瓶接 2 個花蕾，每個處理接種 30 個花器官，重復(fù)3次。30 d 后統(tǒng)計愈傷組織形成率，并觀察其生長情況。

1.2.5 6-BA 和 TDZ 不同濃度組合對不定芽分化的影響。

6-BA/TDZ按 1∶0、1∶1、2∶1 比例；TDZ/6-BA 按 1∶0、1∶1、2∶1 比例分別添加到基本培養(yǎng)基中，觀察不同生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對藍(lán)鏡玉露不定芽分化的影響。每個處理接種 20 團(tuán)愈傷組織，重復(fù)3次，20 d 后統(tǒng)計不定芽分化情況。

1.2.6 不同 6-BA 濃度對藍(lán)鏡玉露不定芽增殖的影響。

6-BA 濃度分別設(shè)定為 0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L，TDZ 濃度為 0.3 mg/L。每瓶接種藍(lán)鏡玉露不定芽 3 個，每個處理 20個芽，重復(fù) 3 次。20 d 后觀察芽的增殖率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理對外植體誘導(dǎo)的影響

外植體接種 15 d 后開始膨大，30 d 后在邊緣產(chǎn)生較多淡綠色的瘤狀組織，并逐漸發(fā)展成為瘤狀突起的愈傷組織。40 d 時，大部分形成愈傷組織（圖1A、B）。由表1 結(jié)果可知，不同的植物生長調(diào)節(jié)劑均能誘導(dǎo)形成愈傷組織，但不同植物生長調(diào)節(jié)劑啟動速度和質(zhì)量存在較大差異。其中處理③形成愈傷組織能力最強(qiáng)，達(dá)到93.3%，說明花蕾外植體在該培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂旺盛（圖1B）。其次為處理②，而處理①誘導(dǎo)率偏低，說明該培養(yǎng)基不適宜作為外植體培養(yǎng)基。因此，處理③ MS+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.3 mg/L為最適的外植體培養(yǎng)基。

2.2 6-BA 和 TDZ 不同濃度組合對不定芽分化的影響

將在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了 40 d 的愈傷組織轉(zhuǎn)接到 5 種不同的分化培養(yǎng)基上：① MS+6-BA 1.0 mg/L，②MS+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L，③MS+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L，④ MS+TDZ 1.0 mg/L，⑤MS+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L。培養(yǎng)10 d左右開始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，芽點(diǎn)不斷生長，逐漸長成不定芽（圖 1C），培養(yǎng) 30 d 后統(tǒng)計芽的分化率。由表2可知，愈傷組織在不同培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)出不定芽，但不同生長調(diào)節(jié)劑濃度對其分化的影響存在較大差異。其中處理②分化率最高，而處理④分化率最低，即當(dāng)6-BA為0時，分化率最低。由此可見，6-BA 在不定芽分化過程中起決定性作用。比較處理①、②、③可知，當(dāng)不添加 TDZ時，分化率偏低；當(dāng) TDZ 過高時，玻璃化較嚴(yán)重，所以適當(dāng)?shù)?TDZ 濃度可以增加分化率。比較處理②和⑤可知，6-BA濃度高于TDZ時，分化率提高，當(dāng)TDZ比6-BA濃度低時，分化率下降。綜上所述，MS+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.5 mg/L為不定芽分化最適培養(yǎng)基。

2.3 不同 6-BA 濃度對藍(lán)鏡玉露增殖生長的影響

將分化的不定芽分別轉(zhuǎn)接到添加有不同濃度6-BA 及相同濃度TDZ的 MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖：① MS+TDZ 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L；② MS+6-BA 0.2 mg/L+TDZ 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L；③MS+6-BA 0.4 mg/L+TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L；④ MS+6-BA 0.6 mg/L+TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L；⑤MS+6-BA 0.8 mg/L+TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L。培養(yǎng) 45 d后，統(tǒng)計增殖幼苗的增殖系數(shù)及生長情況。

由表3可知，處理③的增殖系數(shù)最高，達(dá)到 5.0，但有較輕微的玻璃化現(xiàn)象；而處理①和②均無玻璃化現(xiàn)象，但其增殖系數(shù)較處理③低。此外，當(dāng) 6-BA 濃度繼續(xù)增加到 0.6和0.8 mg/L時，玻璃化程度越來越嚴(yán)重，分化出的叢生芽葉片細(xì)長、透明，且增殖系數(shù)也有所下降。綜合考慮，當(dāng) 6-BA濃度為 0.4 mg/L 時，增殖效果較好（圖 1D）。

2.4 煉苗移栽

將增殖后株高2～3 cm的藍(lán)鏡玉露組培苗取出，洗凈其基部的培養(yǎng)基，風(fēng)干3～4 d后移栽至混合基質(zhì)中（泥炭∶椰糠∶蛭石=5∶3∶2），15 d后即可生根。遮陰條件下生根成活率可達(dá)到70%，30 d后生根生活率可達(dá)95%。

3 結(jié)論與討論

在瓦葦屬藍(lán)鏡玉露組培快繁過程中，對于一些稀有、名貴的多肉品種，外植體通常選擇再生能力較強(qiáng)的花蕾，這樣既不影響母本植株的生長，又容易獲得無菌的外植體材料。在藍(lán)鏡玉露的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)階段，細(xì)胞分裂素 6-BA濃度為1.0 mg/L，TDZ濃度為 0.3 mg/L時有利于外植體的誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)933%。在愈傷組織分化階段，2種生長調(diào)節(jié)劑6-BA和TDZ與低濃度 NAA配合使用更有利于愈傷組織生長和叢生芽的分化，當(dāng)6-BA 1.0 mg/L、TDZ 05 mg/L、NAA 0.01 mg/L時，愈傷組織分化率達(dá)75%。在藍(lán)鏡玉露的增殖培養(yǎng)階段，MS+6-BA 0.4 mg/L+TDZ 0.4 mg/L+NAA 01 mg/L更利于藍(lán)鏡玉露的增殖，增殖系數(shù)達(dá)到5。

在玉露組培快繁過程中，愈傷組織和叢生芽的玻璃化現(xiàn)象比較嚴(yán)重[13-14]。該研究中，各個階段均出現(xiàn)了不同程度的玻璃化現(xiàn)象，主要原因是 6-BA 和TDZ 濃度過高。當(dāng) 6-BA 濃度達(dá)到 0.6 mg/L 時，葉片透明、細(xì)長、玻璃化現(xiàn)象較嚴(yán)重。而在低濃度 6-BA 條件下，盡管玻璃化程度較輕或無玻璃化現(xiàn)象，增殖速率也隨之下降，因此該試驗(yàn)中 6-BA濃度為 0.4 mg/L時較為適宜。當(dāng)TDZ濃度大于0.5 mg/L時，隨著濃度的增加，玻璃化現(xiàn)象變得越嚴(yán)重，因此TDZ 濃度在0.3～0.5 mg/L時較適宜。

藍(lán)鏡玉露作為一種新型的室內(nèi)景觀花卉，具有較高的觀賞價值和市場前景[15]。該試驗(yàn)以藍(lán)鏡玉露花蕾為外植體，對其離體培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)進(jìn)行了研究，建立了藍(lán)鏡玉露優(yōu)質(zhì)組培苗工廠化生產(chǎn)程序，同時省去組培苗生根階段，直接煉苗生根，在保證生根成活率的同時，大大縮短了繁苗進(jìn)程，為藍(lán)鏡玉露組培苗規(guī)?；a(chǎn)提供了參考依據(jù)。

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