俞璐云

[摘 要]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）提出至今已有20年時間，期間PCR已發(fā)展成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)和常規(guī)技術(shù)，極大地推動了生命科學(xué)各個領(lǐng)域的發(fā)展。本文簡單介紹了PCR技術(shù)原理、反應(yīng)過程并舉例了兩個具體實(shí)驗(yàn)中的PCR技術(shù)應(yīng)用，最后簡單介紹現(xiàn)今運(yùn)用廣泛的發(fā)展后的一些PCR技術(shù)，如熒光定量PCR技術(shù)等。

[關(guān)鍵詞]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；熒光定量PCR技術(shù)；PCR技術(shù)發(fā)展

[中圖分類號]F274 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

1 PCR技術(shù)簡介

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)，是體外酶促擴(kuò)增DNA或RNA序列的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時等特點(diǎn)。

它與分子克?。╩olecular cloning）、DNA測序（DNA sequencing）一起構(gòu)成了分子生物學(xué)的大主流技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)使人們能夠在數(shù)小時內(nèi)通過試管中的酶促反應(yīng)將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，給生命科學(xué)領(lǐng)城的研究手段中帶來了革命性的變化。由于PCR 技術(shù)的實(shí)用性和極強(qiáng)的生命力，PCR 技術(shù)成為生物科學(xué)研究的一種重要方法，極大地推動了分子生物學(xué)以及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

2 具體實(shí)驗(yàn)實(shí)例

2.1 PCR技術(shù)測定不同山核桃品種特定基因的實(shí)驗(yàn)

核桃價格歷來都比較昂貴，可利用PCR技術(shù)研究高產(chǎn)高品質(zhì)核桃品種基因從而在種植上挑選特定品種提高經(jīng)濟(jì)效益。

2.1.1 前期準(zhǔn)備

2.1.1.1 引物 每組引物都有相應(yīng)上游引物和下游引物

2.1.1.2 其他材料 200ul槍頭，10ul、50ul移液槍，50ul移液排槍 96孔板，擎科 PCR MIX

2.1.1.3 設(shè)備 PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，拍照儀

2.1.1.4 DNA模板樣品（來源于不同地區(qū)山核桃樹的芽、樹枝或樹葉）

2.1.2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1.2.1 反應(yīng)體系

Taq pcr主要混合物、前后引物再加上DNA模板，最后用無菌水定容，反應(yīng)體系共為15.0ul。

2.1.2.2 擴(kuò)增程序設(shè)定

PCR擴(kuò)增儀蓋105℃預(yù)熱，設(shè)定合適的定性溫度和時間、退火溫度與時間設(shè)定，還有延伸溫度和時間并確定合適延伸循環(huán)數(shù)。

為了防止實(shí)驗(yàn)人員離開而擴(kuò)增結(jié)束后溫度回升所帶來的不利后果，可再加上4℃保溫一段時間。

2.1.2.3 凝膠電泳

1.5%瓊脂糖配成凝膠90ml，EB染料8ul，樣品裝量5ul，DNA marker（DL2000 DNA marker）5ul，電壓150V，電流150A，時間20min

2.1.2.4 結(jié)果分析（紫外光拍照）

電泳結(jié)果圖片對比標(biāo)準(zhǔn)的DNA maker條帶長度就能知道電泳結(jié)果中，特異性條帶的長度，從而也可與實(shí)際引物理論長度作對比分析，PCR擴(kuò)增后顯示的特異性可用作原始DNA模板的篩選和基因鑒定。批量的測定不同引物序列在這些不同的山核桃DNA模板的擴(kuò)增結(jié)果，最后匯總可篩選出高產(chǎn)量和質(zhì)量的山核桃樹種，當(dāng)然這需要大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，本文只講述其中一次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 乳桿菌突變菌柱中H+-ATPase的調(diào)控機(jī)制實(shí)驗(yàn)PCR應(yīng)用

2.2.1 乳酸桿菌和H+-ATPase概述

乳酸菌是發(fā)酵糖類主要產(chǎn)生乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱。H+-ATPase是一種細(xì)胞膜蛋白，廣泛存在于乳酸菌體內(nèi)，它對乳酸菌的代謝和產(chǎn)酸具有重要影響。

H+-ATPase的主要功能是催化ATP的合成與水解，但在不同的生物中其功能有不同的體現(xiàn)。在含有呼吸鏈的真核生物中，通常是利用呼吸鏈途徑來合成ATP，同時又能水解ATP。但乳酸菌是原核生物，主要通過底物磷酸化途徑來合成ATP，所以對于乳酸菌而言，H+-ATPase只能水解ATP而不能合成ATP，同時，通過水解ATP釋放的能量來把胞內(nèi)H+運(yùn)出胞外，維持H+梯度。

2.2.2 PCR技術(shù)應(yīng)用的重要性

PCR技術(shù)常用于基因檢測序列，而在該實(shí)驗(yàn)中突變菌基因序列的對比，乳桿菌調(diào)控H+-ATPase編碼基因檢測是實(shí)驗(yàn)中必不可少的一部分，PCR技術(shù)的應(yīng)用極大地方便了實(shí)驗(yàn)中基因的測序，并且結(jié)合凝膠電泳紫外觀察電泳結(jié)果，更能清晰快速找出基因序列，為實(shí)驗(yàn)找到調(diào)控機(jī)制基因提供便利。

通過實(shí)時熒光定量 PCR 分析了親本菌以及兩種突變菌（TB-1、TB-2）的基因表達(dá)水平，同時對兩株突變菌的測序結(jié)果分析，分析酶活力下降的原因與基因突變的聯(lián)系。利用二環(huán)己基碳二亞胺（DCCD）和2，4-二硝基苯酚（DNP）兩種抑制劑對乳酸菌細(xì)胞膜上的H+-ATPase的抑制作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析乳酸菌的兩種不同突變菌種在代謝過程中的各類代謝物的含量差異，比較兩種突變菌中H+-ATPase的活性，進(jìn)而更加準(zhǔn)確地分析H+-ATPase在乳酸菌代謝過程中的調(diào)控機(jī)制。

3 發(fā)展后的一些PCR技術(shù)

3.1 定量PCR技術(shù)

3.1.1 熒光定量PCR技術(shù)研究現(xiàn)狀

在PCR對擴(kuò)增產(chǎn)物定性鑒別的基礎(chǔ)上，幾年前又發(fā)展起來對模板DNA片段進(jìn)行定量研究的方法，即定量 PCR（Quantitative PCR，Q-PCR）。目前應(yīng)用最多的為熒光定量 PCR（FQ-PCR），它是利用Taq酶的5' 3'外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個熒光標(biāo)記探針，經(jīng)激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積，從而達(dá)到定量目的。

實(shí)時熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)。它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號來實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進(jìn)行定量分析。它的特點(diǎn)是：（1）用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量。（2）熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或雙重標(biāo)記的序列特異性熒光探針或能量信號轉(zhuǎn)移探針等方法獲得，大大提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。（3）進(jìn)行實(shí)時動態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測，消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。與傳統(tǒng)的PCR相比，實(shí)時定量PCR更加快速、靈敏，并能有效地減少實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生污染的危險。

3.1.2 發(fā)展趨勢

定量PCR技術(shù)具有以下的發(fā)展趨勢：定量水平從粗略定量、半定量到精確定量、絕對定量；定量過程中參照物的選擇從單純外參照非競爭性定量到多種參照定量；檢測手段從擴(kuò)增樣本終點(diǎn)一次檢測到擴(kuò)增過程中動態(tài)連續(xù)檢測進(jìn)行定量；檢測方法由手工檢測、半自動檢測發(fā)展到成套設(shè)備檢測， 且檢測效率及自動化程度越來越高。

定量 PCR 技術(shù)在家蠶分子生物學(xué)研究中也起著相當(dāng)重要的作用。常規(guī) PCR法已廣泛用于家蠶基因的克隆與研究中 ，但是僅僅在定性方面檢測基因中核酸序列是否存在 ， 這是不夠的，還必須從量上確定標(biāo)本中的核酸 。

3.2 數(shù)字PCR技術(shù)

3.2.1 數(shù)字PCR技術(shù)簡介

數(shù)字 PCR 是近年來迅速發(fā)展起來的一種定量分析技術(shù)。與傳統(tǒng)定量 PCR技術(shù)不同的是數(shù)字PCR 不依賴于擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值（CT）進(jìn)行定量，受擴(kuò)增效率的影響，也不必采用看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實(shí)現(xiàn)絕對定量分析。

數(shù)字 PCR（也可稱單分子 PCR） 一般包括兩部分內(nèi)容，即 PCR 擴(kuò)增和熒光信號分析。在 PCR 擴(kuò)增階段，與傳統(tǒng)技術(shù)不同，數(shù)字 PCR 一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元中進(jìn)行反應(yīng)。不同于 qPCR 對每個循環(huán)進(jìn)行實(shí)時熒光測定的方法，數(shù)字 PCR 技術(shù)是在擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集。最后通過直接計數(shù)或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。

3.2.2 數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用

近年來隨著人類對癌癥的不斷研究和認(rèn)識，大量證據(jù)表明癌癥是一種基因（染色體）異常變化引起的疾病，普遍認(rèn)可的異常情況包括癌基因及抑癌基因的突變、插入或缺失等。不過，癌細(xì)胞通常與大量正常細(xì)胞同時存在，因此，如何從大量正常細(xì)胞的DNA 中檢測到少量的異?；虺蔀榘┌Y研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一。Vogelstein及其同事以KRAS基因突變?yōu)檠芯繉ο?，對腸癌患者的糞便樣品進(jìn)行了數(shù)字 PCR 分析，得到KRAS基因第12號密碼子點(diǎn)突變率約為4%。

另外數(shù)字PCR技術(shù)還常用于腫瘤早期研究和產(chǎn)前診斷，這都為人類的健康發(fā)展提供了許多便利。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 林彩琴，姚波.數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)展[J].化學(xué)進(jìn)展，2012（12）.

[2] 王偉杰.實(shí)時PCR技術(shù)及其在果樹研究中的應(yīng)用[A].中國園藝學(xué)會.中國園藝學(xué)會第七屆青年學(xué)術(shù)討論會論文集[C].中國園藝學(xué)會，2006.