李陳清 王珺 陳國華 梁業(yè)松 梁俊 海靖濤

摘要[目的]探究固定化四爿藻去除養(yǎng)殖廢水中氨氮（NH4+-N）、亞硝酸氮（NO2--N）和活性磷酸鹽（PO43--P）的效果。[方法]采用海藻酸鈉固定化包埋技術開展了四爿藻固定化培養(yǎng)，探究了藻球直徑、藻細胞包埋密度、海藻酸鈉濃度及氯化鈣濃度等條件對四爿藻固定化培養(yǎng)的影響。同時測定了固定化四爿藻去除養(yǎng)殖水體中NH4+-N、NO2--N、PO43--P的效果。[結果]四爿藻固定化培養(yǎng)的優(yōu)化條件為藻球直徑為4 mm、藻細胞包埋密度為1.82×104個/mL、海藻酸鈉質量濃度為10 g/L及氯化鈣濃度為20 g/L；在石斑魚養(yǎng)殖廢水中引入固定化四爿藻，試驗第3天，NH+4-N去除率達98.87% 、NO2--N去除率達98.33%和PO43--P去除率達83.70%。[結論]采用海藻酸鈉固定化包埋技術不影響四爿藻的生理活性；固定化四爿藻應用于凈化養(yǎng)殖水環(huán)境具有很好的前景。

關鍵詞四爿藻；固定化；氮；磷；去除率

中圖分類號X703文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）05-0081-04

Abstract[Objective]To investigate the effects of immobilized Tetraselmis chui on removing nitrogen（N） and phosphorus（P） from aquaculture wastewater. [Method]Embedding carry of sodium alginate was used to immobilize microalga Tetraselmis chui， and then studied the effects of embedded microalgal particle diameter， cell density of embedded microalgae， concentrations of sodium alginate and calcium chloride on the cultivation of immobilized Tetraselmis chui. [Result]The effects of immobilized Tetraselmis chui was with immobilized microalgal particle diameter of 4 mm，immobilized Tetraselmis chui on removing NH4+N， NO2-N and PO43-P from aquaculture wastewater were also investigated. The results showed that the optimal cultivation condition of 1.82×104 cells/mL embedded cell density， 10 g/L sodium alginate， and 20 g/L CaCl2. Furthermore， the immobilized Tetraselmis chui was also used for the treatment of grouper breeding wastewater，and the removal efficiencies of NH4+N、NO2-N and PO43-P reached 98.87%， 98.33%， and 83.70% on the third day， respectively. In conclusion， the immobilization technology with sodium alginate had no impacts on the physiological activity of Tetraselmis chui. [Conclusion]Thus， immobilized Tetraselmis chui has potential to be applied in the treatment of aquaculture wastewater.

Key wordsTetraselmis chui；Immobilization；N；P；Removal rate

細胞固定化技術是將游離的細胞固定或包埋在載體上，細胞同載體處于相對靜止狀態(tài)的一種化學處理工藝[1]。藻類固定化技術起始于20世紀80年代，早期主要應用于生化生產(chǎn)和能源提供[2]。在環(huán)境領域主要應用于廢水處理和生物監(jiān)測，具有反應速度快、固液分離效果好、運行穩(wěn)定性高等特點[3-4]。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，國內外已經(jīng)有較多研究。如孫杰等[5]在西施舌（Coelomactra antiquata）人工育苗中應用固定化海洋微藻可有效吸收降解養(yǎng)殖環(huán)境中的氨氮與亞硝酸氮，改善水質，提高苗種的成活率與生長量；黃翔鵠等[6-7]研究表明，固定化波吉卵囊藻和微綠球藻可改善凡納對蝦養(yǎng)殖水質，并提高對蝦抗病力。鄭蓮等[8]研究表明，固定化微綠球藻可有效降低對蝦養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸氮等有害因子的濃度，同時能抑制弧菌的生長，提高水中溶解氧含量，使水體長時間保持較好的動態(tài)平衡狀態(tài)。

四爿藻（Tetraselmis chui）隸屬于綠藻門綠藻綱團藻目衣藻科四爿藻屬，是一種增殖速度很快的單細胞綠藻，能進行光合放氧作用，并含有豐富的營養(yǎng)物質，是魚、蝦幼體和貝類的優(yōu)良餌料[9-10]。氮和磷是藻類細胞的主要營養(yǎng)成分，藻細胞通過吸收環(huán)境中的氮、磷等營養(yǎng)物質而不斷增殖[11]。因此，某種微藻的增殖與其吸收環(huán)境中的氮、磷成正比。影響固定化微藻生長和氮、磷去除效率的內部因素主要是藻種本身生理特征，外部因素主要包括溫度、光照、營養(yǎng)條件、藻球規(guī)格大小、藻細胞包埋量、藻球用量等方面[12]。筆者以四爿藻為藻種，采用海藻酸鈉包埋技術進行固定化，進行了不同藻球規(guī)格、接種密度、海藻酸鈉濃度及氯化鈣濃度等培養(yǎng)條件對固定化四爿藻生長及去除養(yǎng)殖廢水中氨氮（NH4+-N）、亞硝酸氮（NO2--N）和活性磷酸鹽（PO43--P）的效果，以期為固定化四爿藻應用于養(yǎng)殖廢水處理提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試四爿藻取自海南大學海洋學院，原種于2016年4月取自海南省陵水縣自然海區(qū)，經(jīng)過微吸管法分離、提純，擴大培養(yǎng)后備用。

1.2微藻培養(yǎng)條件

培養(yǎng)液采用“寧波大學3號”微藻培養(yǎng)液配方[13]；培養(yǎng)容器為1 000 mL“晶花牌”三角燒瓶；試驗用海水取自海口市白沙門自然海區(qū)，經(jīng)過400目篩絹網(wǎng)及脫脂棉過濾、煮沸、自然冷卻后使用。培養(yǎng)條件：溫度（26±2） ℃，鹽度為31.5，pH 8.04，光照度為4 000 lx，光暗周期14 h∶10 h，不充氣，每天搖瓶4次，提供碳源及氧氣，以保證微藻正常生長。該試驗選用石斑魚苗養(yǎng)殖廢水，各試驗均設3個平行組。

1.3試驗方法

1.3.1

固定化藻膠球的制備方法。稱取不同質量的海藻酸鈉，分別與500 mL蒸餾水混合，加入10 g氯化鈉，在 100 ℃ 水浴中分別溶解制成10%、20%和30%海藻酸鈉膠體溶液。將處于指數(shù)生長期的四爿藻與海藻酸鈉膠體溶液分別按1∶4混合均勻，然后用不同規(guī)格的注射器將其滴入常溫的2% CaCl2 溶液中，即形成不同直徑的四爿藻膠球，靜置1 h后，用消毒海水洗滌3次，備用。

1.3.2

固定化藻球脫固定化方法。在測定固定化藻細胞密度時需先脫固定化，將固定化四爿藻膠球加入盛有一定量5%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）化解液的小試管中，搖動，使固定化藻球完全溶解成懸浮狀，再用甲醛固定，然后用血球計數(shù)板計數(shù)藻細胞密度，每個樣品計數(shù)3次，取平均值。

1.4試驗設計

1.4.1

藻膠球直徑的篩選試驗。在實驗室無菌條件下，用不同規(guī)格的針頭滴成不同大小的藻球，膠球直徑大小分別為 2、3、4、5 mm。培養(yǎng)于500 mL三角瓶中，并加入300 mL培養(yǎng)液，接種400粒膠藻球進行固定化培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后測定其細胞密度。

1.4.2

藻細胞接種量密度試驗。在實驗室無菌條件下，制備海藻酸鈉與四爿藻混合液的終藻細胞密度分別為1.82×102、1.82×103、1.82×104和1.82×105個/mL。培養(yǎng)于500 mL三角瓶中，并加入300 mL培養(yǎng)液，接種400粒膠藻球進行固定化培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后測定其細胞密度。

1.4.3

海藻酸鈉與氯化鈣不同濃度的正交試驗。在前期預試驗的基礎上，選取藻球在海水中維持穩(wěn)定10 d以上的條件，設計海藻酸鈉與氯化鈣2因素3水平的正交試驗（表1），得出最佳的海藻酸鈉與氯化鈣濃度配比。培養(yǎng)于500 mL三角瓶中，并加入300 mL培養(yǎng)液，接種400粒膠藻球進行固定化培養(yǎng)，培養(yǎng)15 d后測定其細胞密度。

1.4.4

固定化四爿藻應用于凈化水質試驗。采用上述試驗得到優(yōu)化的固定化條件制作藻球，培養(yǎng)于盛有1 L石斑魚苗養(yǎng)殖廢水的2 L三角瓶中，每組投放藻球1 000粒，光照度為4 000 lx，光暗周期14 h∶10 h，水溫為（26±2） ℃。每天09：00—10：00定時取水樣，用0.45 μm 濾膜真空抽濾，測定各項指標。其中，氨氮（NH4+-N）含量采用次溴酸鈉氧化法測定；亞硝酸氮含量（NO2--N）采用重氮-偶氮法測定；活性磷酸鹽（PO43--P）含量采用磷鉬藍分光光度法測定。具體方法參見文獻[14]，共測定7 d。

1.5相關計算

1.5.1

藻膠球破碎率。將固定化四爿藻藻球接入廢水中培養(yǎng)，不通氣的情況下，每天數(shù)出破碎藻球的個數(shù)，破碎藻球與總球數(shù)之比即破碎率，培養(yǎng)計數(shù)10 d。

1.5.2

氮、磷去除率（R）。按下式計算：

R=（C0-Ct）/C0 ×100%

式中，C0為各種形態(tài)氮、磷的初始濃度（mg/L）；Ct為取樣時氮、磷濃度（mg/L）。

1.5.3

生長速率（K）。根據(jù)下式計算：

K=（lgBt-lgB0）/t

式中，B0為接種初始藻細胞密度；Bt為經(jīng)過t時間培養(yǎng)后的藻細胞密度；t為培養(yǎng)時間（d）。

1.6統(tǒng)計分析

運用Excel 2007軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖表生成，運用SPSS 17.0軟件進行方差分析，并采用Duncan進行多重比較。

46卷5期李陳清等固定化四爿藻的制備及其去除養(yǎng)殖廢水中氮·磷的效果

2結果與分析

2.1膠球直徑對固定化四爿藻培養(yǎng)的影響

由表2可知，4種不同藻球直徑的生長率分別為0.142、 0.146、0.148、0146，直觀分析可知直徑為4 mm的藻球生長率最高。利用SPSS 17.0軟件對其進行單因子方差分析，結果表明該試驗設計的藻球直徑對固定化四爿藻生長的影響不顯著（P>005）。

2.2接種量對固定化四爿藻培養(yǎng)的影響

由表3可知，四爿藻接種量越大，其最終生長量也越大，但生長速率隨著接種量的增大而減小。使用SPSS 17.0軟件對其進行單因子方差分析，結果表明，不同接種量對固定化四爿藻生長的影響極顯著（P<0.01）。綜合考慮生長量及生長速率，選用藻細胞密度為1.82×104個/mL為固定化培養(yǎng)的初始密度。

2.3海藻酸鈉和氯化鈣濃度對四爿藻培養(yǎng)的影響

由表4可知，在接種量相同的情況下，當海藻酸鈉濃度為10 g/L、氯化鈣濃度為20 g/L時，固定化四爿藻培養(yǎng)15 d后的藻細胞

生長量最大，達1.26×107個/mL，生長率也最高，達0168。

對數(shù)據(jù)進行單因子方差分析，結果表明，海藻酸鈉和氯化鈣濃度對四爿藻生長的影響極顯著（P<0.01）。

2.4水質因子測定結果

2.4.1NH4+-N含量。

由圖1可知，固定化四爿藻對水體中的NH4+-N具有很強的去除力，從培養(yǎng)第2天開始，加藻球試驗組水體中的NH4+-N含量急劇降低，第3天NH4+-N去除率達98.87%，而對照組在整個試驗過程中NH4+-N變化較小。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結果表明，固定化四爿藻對水體中NH4+-N濃度有極顯著影響（P<0.01）。

2.4.2

NO2--N含量。

從圖2可以看出，固定化四爿藻對水體中NO2--N具有很強的去除力，從試驗第2天

開始NO2--N含量急劇降低，第3天試驗組中NO2--N的去除率達9833%，而對照組中的NO2--N含量變化不大。方差分析表明，固定化四爿藻對水體中NO2--N含量有極顯著影響（P<0.01）。

2.4.3PO43--P的測定結果。

從圖3可以看出，固定化四爿藻對水體中的PO43--P具有很強的去除力，試驗第3天，試驗組對水體中PO43--P的去除率達83.70%，第4天去除率達92%，對照組的PO43--P在整個試驗過程中波動不大。

3討論

3.1固定化藻膠球的研制

固定化四爿藻膠球的制作工藝對四爿藻的生長及污水處理密切相關。該試驗結果表明，藻球直徑為 4 mm 時固定化四爿藻的生長量最大，生長率也最大。這與梁晶晶等[15]的研究結果相似，微綠球藻直徑為3.5 mm時，生長率最大，藻球生長量呈先升高后降低趨勢。經(jīng)方差分析可知，在該條件下，膠球直徑對固定化四爿藻生長的影響不顯著（P>0.05）。鄭蓮等[16]研究表明，藻球直徑為4.5 mm時，生長率最大，方差分析可知，3種藻球直徑（25、3.5和4.5 mm）對固定化波吉卵囊藻細胞生長的影響不顯著（P>0.05）。

不同藻細胞包埋密度對固定化四爿藻生長率影響顯著，隨著藻細胞包埋密度的增大，生長率逐漸降低，包埋密度為 1.82×102個/mL時，生長率為0.144，藻細胞生長量僅增加了4.82×103個/mL；包埋密度為1.82×104個/mL時，生長率為0.130，藻細胞增長量最大，達3.47×105個/mL；包埋密度增加為1.82×105個/mL時，生長率下降為0.044，藻細胞增長量為3.17×105個/mL?？梢?，當藻細胞密度增加為5個數(shù)量級后，生長率急劇下降且藻細胞增長量降至第2。這是由于隨著藻細胞密度的增大，一方面，藻球傳質阻力增加，CO2 、O2 及營養(yǎng)鹽在藻球中的擴散速度降低；另一方面，藻細胞密度較大的藻球，藻細胞互相遮擋光線，藻球通透性降低而影響藻細胞生長[15]。因而，選擇包埋密度為 1.82×104個/mL，而且這個藻細胞密度在一般培養(yǎng)時容易達到，不需要離心濃縮。經(jīng)多重比較，接種密度對固定化四爿藻生長有顯著性差異（P<0.05）。因此，在試驗和生產(chǎn)上應根據(jù)實際情況選擇合適的接種量。

在藻膠球直徑為4 mm，包埋藻細胞終密度為 1.82×104個/mL，海藻酸鈉濃度為10 g/L（海藻酸鈉∶藻液=4∶1），氯化鈣濃度為20 g/L的條件下，固定化四爿藻培養(yǎng)15 d后的藻細胞生長量最大，達1.26×107個/mL，生長率也最高。經(jīng)多重比較，表明不同濃度的海藻酸鈉、氯化鈣對四爿藻的生長均有極顯著影響。

在預試驗中，進行了質量濃度分別為10、20 g/L海藻酸鈉與藻液不同配比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）試驗，結果表明，10 g/L海藻酸鈉∶藻液=1∶1 時，不成球；10 g/L海藻酸鈉∶藻液=2∶1時，形狀不規(guī)則，破碎率10%；10 g/L海藻酸鈉∶藻液=4∶1時，藻球圓形，破碎率1.5%，藻球生長良好；20 g/L海藻酸鈉∶藻液=1∶1 時，藻球圓形，破碎率1.0%，藻細胞生長良好；20 g/L海藻酸鈉∶藻液=4∶1 時，破碎率為0，藻細胞生長緩慢。 即在一定濃度范圍內，保證膠藻成球的情況下，低濃度比高濃度的海藻酸鈉具有更好的生長效率，因此選擇相對低濃度的海藻酸鈉。原因是較低濃度的海藻酸鈉形成膠球的強度較低，在形成網(wǎng)狀結構時對可以活動的四爿藻的束縛能力不強，與水體的營養(yǎng)鹽交換也更容易，有利于微藻細胞的分裂增殖。此外，還需要強調的是不同廠家生產(chǎn)的海藻酸鈉制作膠藻球所需的質量濃度不同，經(jīng)過試驗篩選，該試驗選用上海麥克林生化公司生產(chǎn)的海藻酸鈉。楊海波等[17] 研究表明，氯化鈣濃度越高，形成藻球的時間越短，藻球表面硬度越大，不利于藻生長。該試驗也證實了這一觀點。

3.2固定化藻膠球去除氮、磷的效果

在養(yǎng)殖廢水中引入固定化四爿藻，試驗第3天，NH4+-N去除率達98.87%，NO2--N去除率達 98.33%，PO43--P去除率達83.7%。試驗組養(yǎng)殖廢水中NH4+-N、NO2--N、PO43--P濃度極顯著低于對照組（P<0.01）。這是由于試驗組中的固定化四爿藻吸收了水體中的NH4+-N、NO2--N、PO43--P，用于生長繁殖。這與前人的研究結果[18-20]一致，固定化微藻可有效降低水環(huán)境中的NH4+-N與NO2--N濃度，改善水質 。因此，可以認為固定化四爿藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖、育苗等凈化水質領域具有很好的應用前景。

4結論

（1）固定化四爿藻培養(yǎng)的優(yōu)化條件為藻球直徑為4 mm、藻細胞包埋密度為1.82×104個/mL、海藻酸鈉質量濃度為10 g/L 及氯化鈣濃度為20 g/L。

（2）固定化四爿藻去除養(yǎng)殖廢水中的NH4+-N、NO2--N和PO43--P的效果極顯著。

（3）采用海藻酸鈉固定化包埋技術不影響四爿藻的生理活性，固定化四爿藻可以應用于凈化養(yǎng)殖水環(huán)境。

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