李梅香 李海明 宋發(fā)軍 張麗 張蕊 孟艷艷

摘要[目的]探究外源一氧化氮（NO）處理對(duì)七葉一枝花種子萌發(fā)及其相關(guān)生理指標(biāo)的影響。[方法]檢測(cè)了不同濃度硝普鈉（NO供體）對(duì)七葉一枝花種子萌發(fā)的促進(jìn)效果，并在此基礎(chǔ)上，探討了最適濃度硝普鈉處理后七葉一枝花種子萌發(fā)過(guò)程中淀粉、可溶性蛋白以及可溶性糖等含量的變化情況。[結(jié)果]100 μmol/L硝普鈉促進(jìn)七葉一枝花種子的萌發(fā)效果最為明顯；與對(duì)照相比，不同時(shí)間段下硝普納處理組種子中，NO含量在45～90 d顯著高于對(duì)照組；可溶性糖含量總體上高于對(duì)照，且在15～45 d有顯著差異；淀粉含量在15～45 d顯著低于對(duì)照組；β淀粉酶活力在萌發(fā)早期顯著高于對(duì)照組，且總淀粉酶活力的變化與β淀粉酶活力變化趨勢(shì)一致；可溶性蛋白含量分析中，處理組與對(duì)照組無(wú)顯著差異，都有隨萌發(fā)推進(jìn)而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。[結(jié)論]100 μmol/L硝普鈉促進(jìn)七葉一枝花種子的萌發(fā)可能是通過(guò)提高種子萌發(fā)早期淀粉酶的活性，促進(jìn)淀粉的水解和可溶性糖的產(chǎn)生，以及提高萌發(fā)期間種子內(nèi)源NO的含量而實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞七葉一枝花；一氧化氮；種子萌發(fā)；影響

中圖分類(lèi)號(hào)S567.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）05-0058-04

Abstract[Objective] The research aimed to study the effects of exogenous nitric oxide（NO） on the germination and the related physiological indices of seeds in Paris polyphylla.[Method] The effects of different concentration of sodium nitroprusside （NO donor） on seed germination in Paris polyphylla was detected.And on the basis of this，the changes of starch，soluble protein and soluble sugar in the process of seed germination of Paris polyphylla were tested by the optimal concentration of sodium nitroprusside.[Result]The effect of 100 μmol/L sodium nitroprusside on seed germination was the most obvious.Comparison with the control，in the nitroprusside group under different time periods，NO content in 45-90 d was significantly higher than the control group；The soluble sugars content were higher than that in the control，and there was a significant difference between 15 and 45 days.Starch content was significantly lower than that in the control group in 15-45 days.The activity of β-amylase in the early stage of germination was significantly higher than that in the control group，and the change of total amylase activity was in accordance with the change trend of amylase activity.Soluble protein content analysis，the treatment group and the control group had no significant difference，on the whole showed a downward trend with the germination and progress.[Conclusion]100 μmol/L sodium nitroprusside promoting germination effect of Paris polyphylla may be achieved by increasing the activity of amylase in the early stage of seed germination，promoting the hydrolysis of starch and producing the soluble sugar，and improving the contents of endogenous NO during germination.

Key wordsParis polyphylla var.chinesis；Nitric oxide；Seed germination；Effect

七葉一枝花（Paris polyphylla var.chinensis）又名重臺(tái)草、草河車(chē)等，是百合科重樓屬多年生草本植物[1]，其根莖具有止血化痰、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗細(xì)胞毒素、抵制腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[2]。 因此，七葉一枝花可作為云南白藥、宮血寧片、三七血傷寧膠囊、止痛抗癌丸和抗病毒沖劑等多種中成藥的重要原料[3]。目前，七葉一枝花主要來(lái)自于野生資源，但其根莖生長(zhǎng)十分緩慢，逐年大量采挖使野生七葉一枝花資源面臨枯竭的危險(xiǎn)，人工栽培已經(jīng)勢(shì)在必行[4]。七葉一枝花的人工繁育包括根莖繁育和種子繁育[5]，其中種子繁育具有繁殖系數(shù)大、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但也存在休眠水平高、自然萌發(fā)率低、 “二次發(fā)育”等生理后熟現(xiàn)象[6]。因此，人工打破種子休眠期、縮短種子的萌發(fā)周期并提高發(fā)芽率是實(shí)現(xiàn)利用種子大量繁育七葉一枝花的關(guān)鍵。

一氧化氮（NO）在種子的萌發(fā)過(guò)程中起重要作用，其常用的供體為硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）。SNP分子中的亞硝基基團(tuán)在植物體內(nèi)半胱氨酸、谷胱甘肽或其他2SH類(lèi)化合物的存在作用下，或通過(guò)細(xì)胞色素P450/NADPH系統(tǒng)的催化，會(huì)逐步分解釋放出NO[7]。有研究表明，外源SNP處理后能顯著提高黃連種子的發(fā)芽率及其活性[8]。章玉平等[9]研究發(fā)現(xiàn)SNP處理對(duì)鳳仙花、千日紅、孔雀草的萌發(fā)有調(diào)控作用，還有黑麥的種子在SNP處理的情況下，其萌發(fā)進(jìn)程也顯著縮短[10]。然而，NO對(duì)七葉一枝花等重樓屬植物種子的萌發(fā)影響鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者通過(guò)對(duì)不同濃度的SNP溶液（50～150 μmol/L）處理下種子的萌發(fā)情況進(jìn)行觀察，并在此基礎(chǔ)上分析最適SNP濃度處理后七葉一枝花種子萌發(fā)過(guò)程中NO含量、淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白以及α、β、總淀粉酶的活力變化，探索外源NO對(duì)七葉一枝花種子萌發(fā)的生理生化影響，為實(shí)現(xiàn)人工快繁和深入研究重樓種子萌發(fā)的內(nèi)在機(jī)制提供參考。

1材料與方法

1.1材料所用材料為2016年秋季采集于武陵山區(qū)試驗(yàn)田的3年生七葉一枝花的成熟種子。種子采收后，去除穎殼和外種皮，室溫晾干后裝入透氣袋，置于4 ℃冰箱處理備用。

1.2浸種處理 挑選籽粒健康、飽滿的七葉一枝花種子，先用清水泡2 d，使種子吸漲發(fā)白，然后將處理后的種子分別置于不同濃度的SNP溶液（50、80、100、120、150 μmol/L），以清水處理作為對(duì)照組。此外為了考察SNP的促萌效果，還增加了黃珍等[11]研究發(fā)現(xiàn)的促萌效果較好的GA3（500 mg/L）溶液也作為參照。所有種子置于25 ℃恒溫條件下浸種48 h。

1.3萌發(fā)培養(yǎng)浸種結(jié)束后，分別將各處理組的種子先用清水洗5遍，然后用75%乙醇消毒30～40 s，無(wú)菌水沖洗后再用0.1%的升汞消毒10～12 min，最后用無(wú)菌水沖洗干凈。隨后將種子轉(zhuǎn)移至鋪有3層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行暗培養(yǎng)，每皿150粒，每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度（19±2） ℃，濕度70%。

1.4取樣培養(yǎng)期間定時(shí)補(bǔ)充水分以確保種子處于濕潤(rùn)狀態(tài)，并分別于培養(yǎng)的第0、15、30、45、60、75、90天觀察種子的萌發(fā)形態(tài)、統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，同時(shí)分別取樣150粒，貯存于-80 ℃冰箱用于生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.5生理指標(biāo)測(cè)定該研究用的試劑盒有植物淀粉含量試劑盒、植物可溶性糖含量試劑盒、植物淀粉酶含量試劑盒、植物NO含量試劑盒、植物可溶性蛋白含量試劑盒，均采購(gòu)于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，分別用以測(cè)定重樓種子內(nèi)淀粉含量、可溶性糖含量、α 淀粉酶和 β 淀粉酶活力、NO含量以及可溶性蛋白含量。所有步驟均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。不同萌發(fā)階段的各個(gè)生理生化指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析利用Microsoft Excel 2010、Sigma Stat等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、作圖和分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度SNP處理下種子的萌發(fā)狀態(tài)

由圖1可知，

100 μmol/L SNP處理的七葉一枝花種子萌發(fā)速度最快。萌

發(fā)培養(yǎng)的第30天已有胚根突破種皮，比CK（清水處理）的萌

發(fā)時(shí)間（第60天）要早30 d左右，同時(shí)比500 mg/L GA3處理

組（第45天萌發(fā)）也提前了15 d左右。種子萌發(fā)培養(yǎng)的第45天開(kāi)始，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，盡管其他處理組的種子也陸續(xù)有萌發(fā)現(xiàn)象，但是100 μmol/L SNP處理?xiàng)l件下，其胚根的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于其他試驗(yàn)組。

2.2不同濃度SNP處理下種子的萌發(fā)率

從表1可以看出，100 μmol/L SNP溶液處理下，萌發(fā)培養(yǎng)的第30天，七葉一枝花種子的萌發(fā)率為3.67%，其余處理組均為0。第45天開(kāi)始，500 mg/L GA3、80和120 μmol/L SNP 3個(gè)處理組中，也有種子開(kāi)始萌發(fā)，但其萌發(fā)率均低于7.00%，而100 μmol/L SNP處理組中，其萌發(fā)率高達(dá)15.00%，顯著高于CK（0）和500 mg/L

GA3（6.67%）

處理組。萌發(fā)第60天，100 μmol/L SNP處理組

中，已經(jīng)有超過(guò)50%的種子萌發(fā)；萌發(fā)第75天時(shí)，100 μmol/L SNP處理組的種子萌發(fā)率已經(jīng)達(dá)到90.00%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他試驗(yàn)組。此外，80和120 μmol/L SNP處理后的種子萌發(fā)時(shí)間早于CK，且同時(shí)期120 μmol/L SNP處理組種子的萌發(fā)率高于CK；80 μmol/L SNP處理組種子只在75 d的萌發(fā)率略低于CK，其他時(shí)間內(nèi)，其萌發(fā)率均高于對(duì)照組。表明80和120 μmol/L SNP對(duì)七葉一枝花種子的萌發(fā)也具有一定的促進(jìn)作用。而50和150 μmol/L SNP處理組中，不同時(shí)期種子萌發(fā)率均低于CK，表明外源NO濃度過(guò)高或者過(guò)低均抑制七葉一枝花種子的萌發(fā)。結(jié)合圖1和表1的結(jié)果可知，100 μmol/L SNP溶液處理后，對(duì)七葉一枝花種子的萌發(fā)促進(jìn)效果最好，因此該研究后續(xù)試驗(yàn)中主要探討了100 μmol/L SNP處理組中相關(guān)生理指標(biāo)的變化。

2.3NO含量的變化從圖2可看出，SNP組中NO含量隨著種子萌發(fā)率的提高而逐漸增高，在第45天時(shí)達(dá)到峰值（0.318 μmol/g），隨后NO的含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，直到第90天。對(duì)照組中NO含量變化趨勢(shì)與SNP處理組類(lèi)似，都有先升高后降低的趨勢(shì)。與對(duì)照相比，SNP處理組的NO含量在整個(gè)萌發(fā)期間基本上都高于對(duì)照，其中種子萌發(fā)的45～90 d，NO含量均顯著或極顯著高于對(duì)照組。

2.4可溶性糖的含量變化由圖3可知，SNP處理組中，種子內(nèi)的可溶性糖含量在萌發(fā)的第15天顯著升高，隨后趨于平穩(wěn)的變化趨勢(shì)，而CK組中種子的可溶性糖水平直到第60天才出現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì)，其最大值出現(xiàn)在萌發(fā)的第90天（209.119 mg/g）。萌發(fā)前期（第15～45天），SNP處理組中種子的可溶性糖含量顯著或極顯著高于對(duì)照組。

2.5淀粉含量的變化由圖4可知，100 μmol/L SNP處理組的種子在萌發(fā)第0～45天，其淀粉含量迅速下降，而同時(shí)期的對(duì)照組種子中淀粉含量顯著或極顯著高于處理組。萌

發(fā)培養(yǎng)的第60～90天， SNP處理組種子的淀粉含量不再呈

下降趨勢(shì)，其含量水平趨于平穩(wěn)。對(duì)照組中，淀粉含量在萌發(fā)的第60天開(kāi)始迅速下降，萌發(fā)培養(yǎng)的后期SNP處理組與對(duì)照組的淀粉含量無(wú)顯著差異。

2.6淀粉酶活力的變化由圖5可知，整個(gè)萌發(fā)期間α淀粉酶活力變化中，除了萌發(fā)第30天和第60天對(duì)照組的淀粉酶活力和100 μmol/L SNP處理組差異顯著外，其余各時(shí)期中，對(duì)照組和處理組的α淀粉酶活力差別都不明顯。100 μmol/L SNP處理組的β淀粉酶活力，在萌發(fā)前期（0～30 d）顯著高于對(duì)照組，隨后略有下降，處理組內(nèi)不同時(shí)期的β淀粉酶整體變化趨勢(shì)不大；對(duì)照組中的β淀粉酶則呈現(xiàn)出前期變化不大（0～30 d），后期（45～90 d）逐漸升高的趨勢(shì)，并且在萌發(fā)的第60～90天其含量顯著高于SNP處理組。100 μmol/L SNP處理組的總淀粉酶活力，在萌發(fā)前期（0～30 d）顯著高于對(duì)照組，隨后略有下降，但是整體變化的趨勢(shì)不明顯；對(duì)照組中的總淀粉酶則呈現(xiàn)前期變化不大（0～30 d），后期（45～90 d）逐漸升高的趨勢(shì)，并且在萌發(fā)的第60～90天其含量顯著高于SNP處理組。由圖5b和圖5c對(duì)比觀察得知，β淀粉酶的變化趨勢(shì)與總淀粉酶的變化趨勢(shì)類(lèi)似。

2.7可溶性蛋白含量的變化由圖6可知，SNP處理后，種子在萌發(fā)過(guò)程中可溶性蛋白含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，其中最高值出現(xiàn)在第0天（58.043 mg/g），第15天含量迅速降低，而第15～90天可溶性蛋白含量變化較平穩(wěn)。對(duì)照組的種子可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)與SNP處理組類(lèi)似，最高值也出現(xiàn)在第0 天（60.392 mg/g），第15～90天變化較為平穩(wěn)。在整個(gè)萌發(fā)期間，SNP處理組和對(duì)照組的可溶性蛋白含量差異不明顯。

3結(jié)論與討論

一氧化氮是植物體內(nèi)廣泛存在的內(nèi)源調(diào)節(jié)分子，目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它對(duì)植物呼吸作用、光形態(tài)建成[12]、種子萌發(fā)[13]、根和葉片的生長(zhǎng)發(fā)育[14]、氣孔運(yùn)動(dòng)[15]各種脅迫的響應(yīng)以及預(yù)防反應(yīng)等生理過(guò)程都有一定的作用[16]。該研究表明，不同濃度（50～150 μmol/L）SNP對(duì)七葉一枝花種子的萌發(fā)產(chǎn)生了不同的影響，其中100 μmol/L SNP溶液處理后，可以顯著提高七葉一枝花種子的萌發(fā)率，縮短七葉一枝花種子的發(fā)芽周期，而濃度過(guò)高（150 μmol/L）或過(guò)低（50 μmol/L）的SNP則降低七葉一枝花種子的萌發(fā)率。

該研究表明，SNP處理組種子在第45～90天種子快速萌發(fā)階段，處理組的NO含量迅速升高且顯著高于對(duì)照組，暗示著外源NO處理后，可以顯著增加種子內(nèi)的NO含量，而種子內(nèi)源NO含量的升高，是否會(huì)使得種子萌發(fā)的抑制物質(zhì)如ABA激素等的含量降低[17]，從而使得種子萌發(fā)率升高，有待進(jìn)一步深入研究。

種子萌發(fā)過(guò)程中，淀粉在淀粉酶的作用下分解為小分子糖，為萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)。淀粉酶主要包括α淀粉酶和β淀粉酶，其中α淀粉酶能夠?qū)⒌矸劢到獬杉s6個(gè)葡萄糖單位的還原性糊精，然后再分解為麥芽糖和葡萄糖[18]。而β淀粉酶可使淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖[19]。該研究表明，SNP處理組和對(duì)照組種子內(nèi)α淀粉酶在整個(gè)萌發(fā)期差異不大，而處理組的β淀粉酶在種子萌發(fā)前期（第0～30天）顯著高于對(duì)照組，后期（第60～90天）變化平穩(wěn)，而對(duì)照組的β淀粉酶則在萌發(fā)后期（第60～90天）才逐漸升高；總淀粉酶的變化趨勢(shì)與β淀粉酶的變化趨勢(shì)類(lèi)似。該研究結(jié)果暗示，β淀粉酶能快速地響應(yīng)外源NO的誘導(dǎo)，而α淀粉酶則不受外源NO的誘導(dǎo)，這與小麥中的研究結(jié)果相似[20]。此外，該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種子內(nèi)β淀粉酶的顯著升高和各自淀粉含量的降低以及種子開(kāi)始萌發(fā)的時(shí)間節(jié)點(diǎn)密切吻合，暗示該酶活性的升高是淀粉水解和促進(jìn)萌發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵因素。

該研究還發(fā)現(xiàn)SNP處理后，七葉一枝花種子的可溶性糖含量總體上高于對(duì)照，并且在第15～45天差異達(dá)到顯著水平，表明SNP在種子萌發(fā)初期加速了淀粉分解為可溶性糖的速率，為種子的快速萌發(fā)提供可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨著種子的萌發(fā)，以及胚乳中的淀粉被不斷分解，可溶性糖的含量不再顯著增加，其變化較??；此外胚根突破種皮后，可溶性糖的增長(zhǎng)速率變緩慢，這可能是由于在種子進(jìn)入萌發(fā)階段后，種子的呼吸作用增強(qiáng)，利用可溶性糖的速率增加。與此相對(duì)應(yīng)的是，SNP處理后種子萌發(fā)早期（0～45 d）淀粉的含量也顯著低于對(duì)照組，而對(duì)照組的淀粉分解的速率是在45 d以后才大幅度增加，此過(guò)程表明外源NO處理，可以在種子萌發(fā)期間通過(guò)提高種子胚乳內(nèi)β淀粉酶的活性促使淀粉水解為麥芽糖等可溶性糖而促進(jìn)種子的萌發(fā)。

該試驗(yàn)中，種子可溶性蛋白含量測(cè)定的研究結(jié)果表明，SNP處理組和對(duì)照組中可溶性蛋白含量均為逐漸降低的趨勢(shì)，但是不同處理組間差異都不明顯，這與萵苣種子萌發(fā)過(guò)程后，SNP處理后可溶性蛋白的變化趨勢(shì)類(lèi)似[21]。該結(jié)果暗示，盡管淀粉酶類(lèi)的可溶性蛋白在不同處理組之間有顯著變化，但是總的可溶性蛋白并未受到SNP的影響。種子萌發(fā)過(guò)程中涉及到的一系列生理活動(dòng)，包括呼吸加強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)動(dòng)員、貯藏mRNA的利用等，無(wú)一例外的涉及到大量相關(guān)蛋白質(zhì)的調(diào)動(dòng)和功能執(zhí)行[22]。因此，SNP處理后促進(jìn)種子萌發(fā)的過(guò)程中，還有哪些蛋白受到誘導(dǎo)或調(diào)控，有待于進(jìn)一步研究。

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