張學超 龔靜

摘要以隨機采集的新鮮牛奶和培養(yǎng)的K562細胞為基礎，配制不同細胞含量的待測奶樣，并在10～1 000 Hz低頻測試區(qū)域內使用多頻電容測試技術對配制的不同奶樣進行測試。結果表明，微通道傳感器的牛奶細胞數(shù)檢測下限可達40萬個/mL；細胞體積電容值與細胞含量之間具有一定的線性相關性，細胞體積電容參數(shù)可以作為一個檢測細胞含量的重要指標。

關鍵詞微通道傳感器；電容；細胞檢測；牛奶

中圖分類號S854.4+3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）05-0010-02

AbstractBased on randomly collected fresh milk and cultured K562 cell，some milk samples with different cell contents were prepared，and tested by multifrequency capacitance testing technology within 10-1 000 Hz.Results showed as followed：the determination low limit of milk cell number of microchannel sensor could reach 200 thousand individuals per milliliter；the cell volume capacitance had certain linear relationship with cell content，so the cell volume capacitance could be as an important index for determining cell content.

Key wordsMicrochannel sensor；Capacitance；Cell determination；Milk

牛奶體細胞數(shù)是評價奶牛乳腺炎患病等級的重要標準之一，是預測新鮮牛奶產量和質量的重要量化指標[1]。因此，準確、快速地檢測新鮮牛奶中的體細胞數(shù)非常重要。然而，在體細胞數(shù)的所有檢測方法中，電檢測法被公認為是同時具有檢測成本低、快速準確、操作簡單等眾多優(yōu)點的檢測方法[2]。因此，研發(fā)具有檢測準確、使用便捷、樣品消耗少、能實現(xiàn)在線檢測的微通道傳感器有著很好的市場前景。

細胞具有完整的膜結構，當其被置于外電場中時，細胞膜內的自由離子在受到電場力的作用下會在細胞膜表面堆積，從而使細胞表現(xiàn)出微小的電容效應[3-4]。崔傳金等[5]研究表明，乳汁的電容作為預測乳腺炎的新型參數(shù)是完全可行的。鑒于此，筆者采用微流控技術構建兩電極微通道傳感器，測取了不同細胞含量奶樣的電容值，以達到診斷奶牛乳腺炎疾病的目的。

1材料與方法

1.1儀器美國GAMRY REFERENCE 600電化學工作站；美國HERA CELL 150i二氧化碳培養(yǎng)箱；日本OLYMPUS CKX301倒置顯微鏡；79-1磁力加熱攪拌器（北京科偉永興儀器有限公司）；DC-0515低溫恒溫槽（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；BCD-219SKDE冷藏柜等。

1.2測試試驗

1.2.1奶樣采集。

奶樣采自正常生理期內的同一頭黑白花奶牛。采樣時先用溫開水擦拭乳頭，然后用75%乙醇對乳頭進行消毒，并用干凈的醫(yī)用棉簽擦干，且棄去前2次擠出的牛奶，再進行奶樣采集。每個乳區(qū)的牛奶分別擠入50 mL干凈的帶有編號的玻璃瓶內密封，在運輸?shù)倪^程中放入裝有冰袋的隔熱泡沫塑料盒內進行保鮮。最后將當天采集的奶樣帶回實驗室測試，無法立刻測試的奶樣需在4 ℃條件下冷藏保存，防止牛奶變質而影響測試效果。

1.2.2測試奶樣的配制。

將采集回來的奶樣放入低溫恒溫槽中，在40 ℃恒溫條件下恒溫15 min后取出[6]，用磁力加熱攪拌器攪拌3 min，將奶樣置入5 μm干凈砂芯中進行負壓過濾，去除新鮮牛奶中的雜質和原有體細胞，得到無細胞含量的奶樣。

試驗所需的體細胞用培養(yǎng)后的K562細胞進行替代[3]。將培養(yǎng)好的K562細胞與過濾后的無細胞奶樣分別配制為40萬、80萬、160萬、320萬、640萬個/mL的待測奶樣，并進行碘酊染液染色、細胞計數(shù)板計數(shù)。測試時，同一奶樣重復鏡檢計數(shù)3次，取其平均值作為最終細胞值含量。并根據(jù)加利福尼亞CMT標準[7]，將奶樣劃分為5個等級（表1）。

1.2.3微通道傳感器的構建。采用光刻剝離工藝制備兩電極微通道傳感器，同時考慮微通道結構、通道尺寸、電極形狀和尺寸、電極位置、電極材料、管體材料、奶樣進樣口布局等方面，將設計好的圖紙由博奧公司進行加工。微通道傳感器的實物如圖1、2所示。

1.2.4多頻奶樣容抗值的測量。

因為溫度對牛奶的容抗值影響較大，故在進行試驗測試時將奶樣測試溫度固定在25 ℃左右。將配制好的奶樣注入到半圓柱形電極面積為60 μm×60 μm，長3 mm、寬和深均為100 μm的兩電極微通道傳感器中。最后用電化學工作站完成多頻奶樣容抗值的測量。每個奶樣測試完畢后，所用注射器和傳感器都必須用蒸餾水沖洗干凈，并用下一個待測奶樣沖洗3次。所有的奶樣均在采集后的12 h內測試完畢。

2結果與分析

2.1多頻奶樣容抗值通過在微通道傳感器的兩電極上加測試電信號，使用電化學工作站的測得的不同細胞含量奶樣的多頻容抗譜（圖3）。不同細胞含量的容抗譜自上而下排列，測試奶樣的細胞含量分別為640萬、320萬、160萬、80萬、40萬個/mL的奶樣。由此可知，不同細胞含量奶樣的容抗譜排列整齊、區(qū)分明顯，初步判定傳感器的細胞數(shù)檢測下限可達40萬個/mL。

2.2容抗譜分析由圖3的容抗譜可知，隨著測試頻率的增加，容抗會迅速地減小然后基本保持在一個基本恒定的值上，說明在1 000 Hz以上頻率段，牛奶電容形成的容抗對總阻抗的影響很小，在這些頻率段電阻是總阻抗的主要貢獻者。而在10～1 000 Hz，牛奶電容形成的容抗對總阻抗的影響較大，說明低頻電容是總阻抗的主要貢獻者。因此，確定容抗譜測試不同細胞奶樣的有效測試頻率范圍。

兩電極微通道傳感器的通道寬度和高度只有100 μm，通道寬度與管道長度、通道高度與管道長度的比值均只有1∶30。因此，在進行奶樣細胞測試試驗時，可以近似認為奶樣中的細胞在傳感器的微通道內整體呈現(xiàn)串聯(lián)排列形式，從而使得細胞含量越高的奶樣樣本的電容值越小，即容抗值較大，所以奶樣細胞含量高的測試樣本分布在其他容抗譜的上部。

2.3微通道傳感器等效電路模型

斯特恩界面雙電層模型是針對電極/溶液界面處形成的雙電層結構電容而言的，是一種經典的電極/溶液界面模型[8]。該研究將斯特恩模型應用于兩電極測試試驗體系，并結合兩電極微通道傳感器的實際物理結構，考慮溶液電阻（奶體電阻）和界面電阻對整個電化學測試體系的作用，經合理等效簡化后得到如圖4所示的等效電路圖。其中，Ri為界面電阻（傳感器測試電極與奶體界面之間形成的電阻），Ci為界面電容（傳感器測試電極與奶體界面之間形成的電容），Rm為奶體電阻（奶體本身形成的電阻），Cm為奶體電容（奶體中的細胞所形成的電容）。

2.4等效電路模型結果分析

根據(jù)等效電路模型求得的不同細胞含量奶樣的奶體電容值與細胞含量之間的線性關系如圖5所示。結果表明，不同細胞含量的奶體電容值與奶樣細胞含量之間的線性相關性只有R=0.72，絕對系數(shù)R2=0.52。這說明奶體電容值可以在一定程度上反映不同細胞含量的奶樣，但其相關性并不顯著；決定系數(shù)R2也偏低，表明奶體電容值并未很好地反映奶樣細胞數(shù)的變化。產生這種結果的原因是兩電極微通道傳感器在檢測牛奶細胞數(shù)方面還存在進一步改進的空間，如進一步減小界面電容對奶體電容造成的測試干擾。

3結論與討論

通過構建兩電極微通道傳感器，使用電化學工作站在10～1×106Hz頻率對不同細胞含量的奶樣進行測試試驗。從測得的10～1 000 Hz頻率段奶樣容抗值可以初步確定具有該結構參數(shù)的傳感器細胞數(shù)檢測下限可達40萬個/mL；又分析了傳感器的等效電路結構，提取出不同細胞含量奶樣的奶體電容值，進一步分析奶體電容值與細胞含量之間的線性關系，發(fā)現(xiàn)兩者之間具有一定的線性相關性，確定奶體電容值可以作為細胞含量檢測的一個重要指標。最后提出兩電極微通道傳感器的結構還有待進一步的優(yōu)化，例如，如何減小界面電容對奶體電容造成的干擾、如何設計更加合理的等效電路模型來準確提取奶體電容值等，以此來提高傳感器的牛奶細胞數(shù)檢測下限和奶體電容值作為細胞含量檢測指標的準確度。

參考文獻

[1]

DOS REIS C B M，BARREIRO J R，MORENO J F G，et al.Evaluation of somatic cell count thresholds to detect subclinical mastitis in Gyr cows[J].J Dairy Sci，2011，94（4）：4406-4412.

[2] 崔傳金，陳至坤，張學超，等.基于體細胞數(shù)的奶牛乳腺炎檢測方法研究進展[J].中國乳品工業(yè)，2013，41（7）：44-47.

[3] SENGUPTA S，BATTIGELLI D A，CHANG H C.A microscale multifrequency reactance measurement technique to detect bacterial growth at low bioparticle concentrations[J].Lab on a Chip，2006（5）：682-692.

[4] CLAES J E，VAN LMPE J F.Online estimation of the specific growth rate based on viable biomass measurements：Experimental validation[J].Bioproc Eng，1999，21（5）：389-395.

[5] 崔傳金，古少鵬，左月明.基于電參數(shù)與神經網絡的奶牛乳腺炎檢測方法[J].農業(yè)機械學報，2011，42（1）：193-197.

[6] SIERRA D，SANCHEZ A，LUENGO C，et al.Temperature effects on fossomatic cell counts in goat milk[J].Int Dairy J，2006，16（4）：385-387.

[7] 劉峰，遲玉杰.乳房炎乳的檢測方法[J].現(xiàn)代食品科技，2005，21（1）：129-131.

[8] 李荻.電化學原理[M].3版.北京：北京航空航天大學出版社，2008.