潘絨 黃京京 趙玉立 程鑫 李發(fā)壯 胡曉倩

摘要 [目的]分析資源植物玉葉金花葉中揮發(fā)油的有效成分并評價(jià)其體外抗氧化活性。[方法]通過水蒸氣蒸餾法提取玉葉金花葉中的揮發(fā)油，采用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)分析其化學(xué)組成。以VC作為對照，以總還原力和對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力為評價(jià)指標(biāo)，研究玉葉金花揮發(fā)油的體外抗氧化活性。[結(jié)果]玉葉金花葉揮發(fā)油中共鑒定出49個(gè)有效成分，占其總量的68.19%，其中包括極具研究和應(yīng)用價(jià)值的N-甲基吡咯（37.37%）和葉綠醇（7.34%）。且在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，玉葉金花揮發(fā)油的總還原力以及對DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥基自由基、ABTS自由基的清除能力均隨濃度的增大而增大。[結(jié)論]玉葉金花揮發(fā)油具有良好的體外抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 玉葉金花；水蒸氣蒸餾法；揮發(fā)油；自由基；抗氧化劑；GC-MS

中圖分類號(hào) S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）01-0173-05

Abstract [Objective] The aim was to analyze chemical components of volatile oils from Mussaenda esquirolli Lévl. and evaluate their antioxidant activity. [Method] The volation oil was extracted by steam distillation， and GC-MS analysis was used to analyze its chemical composition. Compared with VC， the antioxidant activity of volatile oil in vitro was evaluated by total reducing power and scavening effect of superoxide radical， hydroxyl radical， DPPH radical and ABTS radical. [Result] The 49 effective components were identified from the volatile oil in the leaves of Mussaenda esquirolli Lévl. with the GC-MS， accounting for 68.19%， including N-methylpyrrolidine （37.37%） and phytol （7.34%）. And the total reducing power of volatile oil from Mussaenda esquirolli Lévl. and the scavenging capacity of DPPH， superoxide anion， hydroxyl radical and ABT were increased with the increasing concentration. [Conclusion] The volatile oils from Mussaenda esquirolli Lévl. show good antioxidant activity in vitro.

Key words Mussaenda esquirolli Lévl.；Steam distillation；Volatile oil；Free radical；Antioxidation；GC-MS

玉葉金花（ Mussaenda esquirolli Lévl.），又名山甘草、野白紙扇等，是茜草科玉葉金花屬（ Mussaenda ）的一種資源植物[1]。玉葉金花的花葉普遍呈白色，是萼片瓣化形成的，花冠呈黃色，有毛附在其表面和內(nèi)部，花柱較短[2]，極具綠化觀賞價(jià)值。玉葉金花具有清熱解暑，涼血解毒，治療風(fēng)濕骨痛、咽喉炎和止渴的功效，由其制成的保健茶，短期飲用具預(yù)防流感疾病和提高免疫力等效果，長期飲用可促進(jìn)微循環(huán)，極具藥用保健價(jià)值[3]。玉葉金花具適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快、萌芽力強(qiáng)等特點(diǎn)，多用于綠化環(huán)境、凈化空氣、涵養(yǎng)水源、改善環(huán)境等方面，極具生態(tài)價(jià)值[4]。

活性自由基，如超氧陰離子（O-2）、羥自由基（·OH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（ABTS·），能夠引起機(jī)體損傷病變，通過抗氧化物質(zhì)及早防止和清除自由基，是治療由自由基導(dǎo)致的疾病的關(guān)鍵。因此，從植物中提取天然抗氧化物質(zhì)，如多糖、揮發(fā)油和總黃酮等，并研究其抗氧化活性已成為研究熱點(diǎn)[5]。

目前，對玉葉金花的研究多集中在形態(tài)和分類方面，對玉葉金花功能成分的提取和活性研究涉及甚少[6]。筆者通過水蒸氣蒸餾法提取玉葉金花葉的功能成分揮發(fā)油，通過GC-MS技術(shù)對其化學(xué)成分進(jìn)行檢測分析，并通過測定其總還原力以及清除DPPH·、超氧陰離子、羥自由基、ABTS·的能力來評價(jià)其體外抗氧化活性，以期為玉葉金花藥用價(jià)值的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。玉葉金花葉片采自安徽省黃山市屯溪區(qū)黃山學(xué)院南校區(qū)，由黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院張慧沖副教授鑒定。

1.1.2 主要試劑。石油醚、無水硫酸鈉、無水乙醇、95%乙醇、甲醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、過硫酸鉀、維生素C（VC）等，均為分析純。

1.1.3 主要儀器。

SXT-02揮發(fā)油提取裝置（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器有限公司）；DGX-9073B-2電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；PL203型號(hào)電子精密天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；HP5890ⅡGC-HP5972A MSD 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；TDL-5臺(tái)式低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV754紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；pH酸度計(jì)（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取。

按照《中國藥典》2010年版附錄XD揮發(fā)油測定法測定。將采摘的新鮮玉葉金花葉片洗凈，置于電鼓風(fēng)干燥箱（42 ℃）內(nèi)烘干并研磨成粉末狀。取30 g干燥玉葉金花葉片粉末并加入150 mL蒸餾水，42 ℃水浴鍋內(nèi)恒溫水浴加熱30 min，按照料液比1∶15倒入1 L圓底燒瓶中，連接揮發(fā)油提取裝置，蒸餾6 h收集揮發(fā)油，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后置冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GC-MS測定條件。

1.2.2.1 GC-MS色譜條件。VARIANVF-5 ms石英毛細(xì)管柱，柱起始溫度60 ℃下保持2 min，然后以5 ℃/min的速度升溫至120 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min的速度升溫至280 ℃；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為高純He，載氣流速1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，采用不分流方式進(jìn)樣；溶劑延遲3 min。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件。電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，掃描質(zhì)量范圍30～500 amu。

1.2.2.3 檢索譜庫。對總離子流圖中的各峰經(jīng)過質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索、Wiley L質(zhì)譜庫檢索人工圖譜解析和查對有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合質(zhì)譜圖中基峰、質(zhì)荷比以及相對豐度與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的比較，各化學(xué)成分的相對含量按峰面積歸一化法計(jì)算并確認(rèn)[1]。

1.2.3 玉葉金花揮發(fā)油的總還原力測定。采用普魯士藍(lán)法[7]。

以濾膜過濾提取的揮發(fā)油作為母液。

取8支規(guī)格相同的10 mL加蓋試管，向各試管中分別加入不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）的揮發(fā)油各2 mL，再加入0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.6）2.5 mL，隨后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的鐵氰化鉀2.5 mL，吸打混勻后放在50 ℃水浴鍋中20 min，快速冷卻后，再加入2.5 mL體積分?jǐn)?shù)1%的三氯乙酸，混勻后，3 000 r/min離心10 min，吸取2.5 mL上清液放在新備的試管中，再向新試管中加入2.5 mL蒸餾水以及0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵，充分混勻，室溫下靜置10 min，在700 nm波長處測其吸光度并記錄。

用VC做對照試驗(yàn)，分別進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，記錄各次試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.4 玉葉金花揮發(fā)油對DPPH·清除能力的測定。采用DPPH 法[7-11]。

稱取20 mg DPPH，加適量95%乙醇使其溶解并定容于500 mL容量瓶中，避光保存待用。

取8支規(guī)格相同的10 mL加蓋試管，取2 mL不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）的揮發(fā)油于試管中，加入2 mL配制好的DPPH溶液，充分吸打混勻，避光反應(yīng)40 min后，在517 nm波長處測其吸光度，記為 Ai 。用95%乙醇溶液代替DPPH溶液，其他條件保持不變，在517 nm波長處測其吸光度，記為 Aj 。以95%乙醇溶液和DPPH溶液反應(yīng)作為參照，其他條件保持不變，在517 nm波長處測其吸光度，記為 A0 。

用VC做對照試驗(yàn)，分別進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，記錄各次試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

清除率（K）=1-（Ai-Aj）/A0×100%

式中，Ai 為各樣品溶液與 DPPH溶液混合液的吸光度；

Aj 為各樣品溶液與95%乙醇溶液混合液的吸光度；

A0 為 DPPH溶液與95%乙醇溶液混合液的吸光度。

1.2.5 玉葉金花揮發(fā)油對超氧陰離子清除能力的測定。采用鄰苯三酚自氧化法[7，12-13]。

取8支規(guī)格相同的10 mL加蓋試管，取4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 8.2），置于25 ℃水浴20 min，分別加入不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）各1 mL及25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，再加入1 mL 8 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng)，在425 nm波長處測其吸光度，記為 Ai 。以Tris-HCl作為參比，空白對照以蒸餾水代替樣品，吸光度記為 Aj 。

用VC做對照試驗(yàn)，分別進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，記錄各次試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

清除率（K）=（Aj-Ai）/Aj×100%

式中，Ai 樣品吸光度； Aj 為空白組吸光度。

1.2.6 玉葉金花揮發(fā)油對羥自由基清除能力的測定。采用Fenton體系產(chǎn)生·OH，水楊酸法檢測羥基及樣品清除·OH的能力的方法[12，14] 。

取1 mL不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）的揮發(fā)油，加入1 mL 9 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，再加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，充分混勻，37 ℃水浴30 min，在510 nm波長處測其吸光度，記為 Ai ，取平均值?？瞻捉M以蒸餾水代替水楊酸，在510 nm波長處測其吸光度，記為 Aj 。對照組以1 mL蒸餾水代替揮發(fā)油溶液，在510 nm波長處測定吸光度，記為 A0 。

用VC水溶液代替樣品做對照試驗(yàn)，分別進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，記錄各試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

清除率（K）=1-（Ai-Aj）/A0×100%

式中，Ai為樣品吸光度；Aj為空白組吸光度；A0 為對照組吸光度。

1.2.7 玉葉金花揮發(fā)油對ABTS清除能力的測定[7，12，15]。

將20 mL 7 mmol/L ABTS和352 μL 140 mmol/L過硫酸鉀混合，靜置過夜14 h形成ABTS+儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成工作液[要求在30 ℃、734 nm波長處測得吸光度為（0.7±0.02）]，取0.1 mL不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）揮發(fā)油以及5 mL ABTS工作液，充分混勻，避光反應(yīng)10 min，在734 nm波長處測其吸光度（ Ai ）?？瞻捉M用甲醇代替樣品，測其吸光度（ A0 ） 。用甲醇代替ABTS 與樣品反應(yīng)，測其吸光度（ Aj ）。

用VC做對照試驗(yàn)，分別進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，記錄各次試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

清除率（K）=1-（Ai-Aj）/A0×100%

式中，Ai 為各樣品溶液與ABTS溶液混合液的吸光度；

A0 為甲醇與ABTS溶液混合液的吸光度；

Aj 為各樣品溶液與甲醇混合液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉葉金花葉中揮發(fā)油的提取率

在對玉葉金花揮發(fā)油的提取過程中，水浴時(shí)間為30 min，料液比為1∶15，蒸餾時(shí)間為6 h，得出玉葉金花葉中揮發(fā)油出油率為0.21%。

2.2 玉葉金花葉中揮發(fā)油化學(xué)成分分析

在對玉葉金花葉揮發(fā)油各成分的相對含量按峰面積歸一化法計(jì)算并確認(rèn)，其總離子流見圖1。通過檢測譜庫并結(jié)合質(zhì)譜圖中基峰、質(zhì)荷比以及相對豐度與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的比較，玉葉金花葉揮發(fā)油中共鑒定出有效成分49個(gè)組分（表1），占比為68.19%。其中，吡咯烷酮類占37.86%，飽和烷烴占12.35%，醇類化合物占9.22%，有機(jī)酸類占5.23%，酯類化合物占2.05%，烯烴類化合物占1.13%，酮類化合物占0.23%，其他化合物占0.12%，其中包括極具研究和應(yīng)用價(jià)值的N-甲基吡咯（37.37%）、葉綠醇（7.34%）、角鯊烯（0.32%）、十六烷酸（4.83%）、亞油酸乙酯（0.43%）、二氫獼猴桃內(nèi)酯（0.05%）。

2.3 玉葉金花揮發(fā)油的總還原力

由圖2可知，隨著玉葉金花揮發(fā)油濃度的增大，其總還原力也不斷增大，溶液中揮發(fā)油含量與其抗氧化性呈正相關(guān)。與對照VC相比，當(dāng)揮發(fā)油和VC的濃度（0.5～1.5 mg/mL）較低時(shí)，揮發(fā)油與VC的總還原力相當(dāng)；隨著濃度的增加，兩者的總還原力都呈增大趨勢，但揮發(fā)油總還原力增加的幅度低于VC。因此，在誤差允許的范圍內(nèi)，從整體來看，玉葉金花揮發(fā)油具有一定的抗氧化性，且其總還原力與VC的總還原力相當(dāng)。

2.4 玉葉金花揮發(fā)油對DPPH·的清除能力

由圖3可知，玉葉金花揮發(fā)油對DPPH·有一定的清除能力，而且這種清除能力在誤差允許的范圍內(nèi)，隨著揮發(fā)油濃度的升高呈不斷提高的趨勢。與對照相比較，VC對DPPH·的清除能力比揮發(fā)油對DPPH·的清除能力強(qiáng)，并且隨著濃度的逐漸增大，清除率逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)。另外，當(dāng)揮發(fā)油濃度較低時(shí)，其清除能力遠(yuǎn)不及VC的清除能力，但當(dāng)揮發(fā)油濃度逐漸升高，達(dá)到3.5 mg/mL左右時(shí)，揮發(fā)油對DPPH·的清除能力接近于VC的清除能力。

2.5 玉葉金花揮發(fā)油對超氧陰離子的清除能力

由圖4可知，玉葉金花揮發(fā)油對超氧陰離子有清除作用，并且隨著揮發(fā)油濃度的升高，清除能力不斷增強(qiáng)。當(dāng)揮發(fā)油濃度為0.5 mg/mL時(shí)，其清除率僅為63.9%；當(dāng)濃度達(dá)3.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)71.2%，作用效果極其明顯。在對照試驗(yàn)中，VC對超氧陰離子的清除作用也隨著VC濃度的升高而更加明顯。

2.6 玉葉金花揮發(fā)油對羥自由基的清除能力

由圖5可知，玉葉金花揮發(fā)油對羥自由基有一定的清除能力，并且隨著揮發(fā)油濃度的升高，其清除效果越來越明顯。當(dāng)揮發(fā)油濃度為0.5 mg/mL時(shí)，清除率較低，隨著濃度的升高，在誤差允許的范圍內(nèi)，揮發(fā)油對羥自由基的清除能力總體呈逐漸增強(qiáng)趨勢。在VC的對照試驗(yàn)中，在濃度低于1.5 mg/mL時(shí)，VC的清除效果比揮發(fā)油好，但隨著濃度的升高，玉葉金花揮發(fā)油對羥基自由基的清除能力與VC相當(dāng)。

2.7 玉葉金花揮發(fā)油對ABTS自由基的清除能力

由圖6可知，揮發(fā)油對ABTS自由基有較好的清除效果，隨著揮發(fā)油濃度的升高，清除效果越來越明顯。且隨著濃度的升高，揮發(fā)油ABTS的清除能力總體呈逐漸增強(qiáng)趨勢。與VC的對照試驗(yàn)相比，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，玉葉金花揮發(fā)油對ABTS自由基的清除效果基本與VC相近。

3 結(jié)論與討論

該研究主要采用水蒸氣蒸餾法提取玉葉金花的揮發(fā)油，通過GC-MS分析了玉葉金花葉揮發(fā)油的化學(xué)組成，其中存在多種有益成分，如N-甲基吡咯可作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特效藥物痛滅定的中間體，具有抑菌性，工業(yè)上也可作為防腐劑；葉綠醇不僅是動(dòng)物機(jī)體氧化代謝的重要能量來源，而且還可以作為信號(hào)分子調(diào)控糖脂代謝、脂肪細(xì)胞分化[16]；葉綠醇還是合成VK及VE的原料[5]。

角鯊烯能從血液中攝取氧而活化成氧化鯊烯，改善、增強(qiáng)機(jī)體組織的生物氧化還原反應(yīng)[10]，且具有抗氧化作用，能夠保護(hù)細(xì)胞不受自由基侵害，在對小鼠癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)角鯊烯具有一定的抗癌性[11]；亞油酸乙酯能降低膽固醇和血脂，可預(yù)防或減輕脈粥樣硬化癥，目前臨床上有亞油酸乙酯丸劑作為預(yù)防和治療高血壓及冠心病的藥物[12]。

該研究顯示，玉葉金花揮發(fā)油具有較好的體外抗氧化性，對自由基有一定的清除效果，且隨著揮發(fā)油濃度的升高，清除效果呈不斷增強(qiáng)的趨勢，且在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的高濃度區(qū)域，玉葉金花揮發(fā)油對羥基自由基和ABTS的清除能力都高于VC。

該試驗(yàn)研究了玉葉金花葉中揮發(fā)油化學(xué)成分的組成、含量和體外抗氧化的活性，為資源植物玉葉金花的綜合開發(fā)利用，如作為天然抗氧化劑的來源應(yīng)用于保健品、食品、化妝品等的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

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