陸楊輝

摘 要 以有刺黑樹(shù)莓葉柄、葉片及莖段為外植體，接種在附加不同濃度和種類的生長(zhǎng)素（NAA、IBA、

2，4-D）及細(xì)胞分裂素（KT、6-BA）的MS基本培養(yǎng)基上，探討植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及外植體部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：當(dāng)選葉柄、葉片作為外植體時(shí)，誘導(dǎo)形成愈傷的最佳生長(zhǎng)素為NAA，濃度分別為1.0 mg·L-1、0.2～0.5 mg·L-1；當(dāng)選莖段作為外植體時(shí)，宜用IBA誘導(dǎo)形成愈傷，濃度為3.0 mg·L-1。經(jīng)比較分析，篩選出的誘導(dǎo)愈傷形成的最佳外植體為葉柄，培養(yǎng)基為MS+NAA 1.0 mg·L-1。

關(guān)鍵詞 樹(shù)莓；愈傷組織；誘導(dǎo)分析

中圖分類號(hào)：S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.17.074

樹(shù)莓屬于薔薇科懸鉤子屬，半灌木果樹(shù)，近年來(lái)在國(guó)際市場(chǎng)走俏，正在成為果樹(shù)行業(yè)增長(zhǎng)熱點(diǎn)之一。樹(shù)莓不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且有些品種抗旱、抗寒、耐瘠薄，在西北地區(qū)可大面積推廣種植。樹(shù)莓所采用扦插、根蘗、壓條等傳統(tǒng)繁殖方法，其繁殖系數(shù)低、速度慢，影響了優(yōu)良品種的推廣速度，采用組織培養(yǎng)技術(shù)可以快速繁殖樹(shù)莓的優(yōu)良品種[1-3]。在植物組織培養(yǎng)中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物外植體形態(tài)產(chǎn)生的影響報(bào)道很多[4-6]，但有關(guān)多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)黑樹(shù)莓不同外植體誘導(dǎo)形成愈傷的影響報(bào)道卻很少?；诖?，探討了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及不同外植體部位對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，從而找出適于黑樹(shù)莓形成愈傷的最佳培養(yǎng)基和最佳外植體，為更快、更好地繁育樹(shù)莓奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用的材料為有刺黑樹(shù)莓，來(lái)自園藝系組培室。試驗(yàn)所用外植體葉片、葉柄和莖段均取自離體培養(yǎng)獲得的無(wú)菌苗。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

試驗(yàn)所用的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，通過(guò)在MS培養(yǎng)基上添加不同種類及濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，研究其對(duì)樹(shù)莓不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響。各培養(yǎng)基中蔗糖的濃度為30 g·L-1，瓊脂為7 g·L-1，pH值為5.6～5.8。培養(yǎng)室溫度為22～24 ℃，光強(qiáng)為2 500 lx，每天光照14 h。

1.3 方法

在無(wú)菌條件下，從黑樹(shù)莓芽誘導(dǎo)形成的無(wú)菌苗上直接切取0.5～1.0 cm的葉柄、1.0 mm莖段及3.0 mm×

4.0 mm葉片（葉片有一邊保持完好狀態(tài)，接種時(shí)將其完好的一邊朝向瓶壁）接到誘導(dǎo)愈傷形成的培養(yǎng)基上。葉片、葉柄、莖段每個(gè)處理分別接3瓶、3瓶、4瓶，每瓶接種7塊外植體。

接種后每天觀察記錄外植體形態(tài)變化及愈傷組織增殖動(dòng)態(tài)，接種14 d時(shí)統(tǒng)計(jì)形成愈傷組織的塊數(shù)，并計(jì)算出每種組合及每種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織塊數(shù)/接種外植體塊數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)素對(duì)樹(shù)莓形成愈傷的誘導(dǎo)

2.1.1 單一生長(zhǎng)素的影響

2.1.1.1 NAA的影響

當(dāng)以葉柄作為外植體時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨NAA濃度的增加而升高，當(dāng)NAA濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最高值100%，隨后則隨NAA濃度的增加而下降。由表1還可看出，形成愈傷的時(shí)間隨NAA濃度的增加而縮短；當(dāng)以葉片作外植體時(shí)，隨NAA濃度的增加誘導(dǎo)率逐漸降低，形成愈傷的時(shí)間則越來(lái)越長(zhǎng)，這說(shuō)明NAA對(duì)于葉片誘導(dǎo)愈傷效果不顯著，試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的NAA濃度可能過(guò)高；當(dāng)以莖段作外植體時(shí)，隨NAA濃度的增加誘導(dǎo)率升高，當(dāng)濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)最高值82.1%，隨后則隨濃度升高而誘導(dǎo)率下降，開(kāi)始形成愈傷的時(shí)間沒(méi)有表現(xiàn)出規(guī)律性變化?？傮w來(lái)說(shuō)，不同外植體誘導(dǎo)愈傷對(duì)NAA濃度有不同要求。當(dāng)以NAA作為外源激素添加到MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)樹(shù)莓形成愈傷時(shí)，其濃度宜設(shè)為1.0 mg·L-1，選用葉柄作為外植體。

2.1.1.2 2，4-D的影響

由表2可以看出，以葉柄作外植體時(shí)，濃度為0.2～1.0 mg·L-1，愈傷組織誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的增加而升高，最高值為68.2%，當(dāng)2，4-D濃度超過(guò)1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率隨濃度的增加而降低。由此可知，當(dāng)用葉柄誘導(dǎo)愈傷時(shí)，2，4-D的濃度宜設(shè)為1.0 mg·L-1；當(dāng)以葉片作外植體時(shí)，濃度為0.2～1.0 mg·L-1，愈傷組織誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的增加而降低，當(dāng)濃度超過(guò)1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率開(kāi)始回升；當(dāng)以莖段作外植體時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率則隨濃度的升高而降低，這說(shuō)明對(duì)莖段而言，試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的2，4-D濃度有可能過(guò)高，應(yīng)進(jìn)一步降低濃度，確定能使莖段達(dá)到最高愈傷組織誘導(dǎo)率的2，4-D的濃度范圍。

2.1.1.3 IBA的影響

由表3知，無(wú)論是以葉柄、葉片外植體，還是以莖段作外植體，愈傷組織誘導(dǎo)率均是隨IBA濃度的增加而升高，說(shuō)明試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的IBA濃度有可能過(guò)低。當(dāng)濃度為3.0 mg·L-1，選莖段作外植體時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為92.9%，形成愈傷的時(shí)間也很短，在接種后的第5 d便形成了白色、致密的愈傷組織。所以當(dāng)選用IBA作為外源激素添加到MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)樹(shù)莓形成愈傷時(shí)，宜選莖段作為外植體。

2.1.1.4 NAA、2，4-D、IBA對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率作用效果的比較

由表1、表2、表3可知，當(dāng)NAA、2，4-D、IBA處于低濃度狀態(tài)0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1時(shí)，除當(dāng)它們的濃度為0.2 mg·L-1，均選用莖段作為外植體時(shí)所得到的誘導(dǎo)率外，均是NAA的作用效果最好，誘導(dǎo)率最高達(dá)81%，2，4-D的作用次之，IBA的作用效果最差，誘導(dǎo)率僅為14.3%-34.3%。當(dāng)激素處于高濃度狀態(tài)1.0 mg·L-1、

3.0 mg·L-1時(shí)，IBA的作用效果得到加強(qiáng)，愈傷組織誘導(dǎo)率為19.0%～92.9%，與NAA的作用效果不分上下，2，4-D的作用效果最差，愈傷組織誘導(dǎo)率最高僅達(dá)68.2%。

2.1.2 不同種類生長(zhǎng)素配合使用對(duì)誘導(dǎo)愈傷的影響

由于各種生長(zhǎng)素對(duì)樹(shù)莓不同部位外植體的愈傷組織誘導(dǎo)效果不同，形成的愈傷在形態(tài)和數(shù)量上均存在一定的差異，為了更進(jìn)一步確定生長(zhǎng)素在樹(shù)莓愈傷誘導(dǎo)方面的作用，以MS為基本培養(yǎng)基，配合添加了不同種類及濃度的生長(zhǎng)素，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，當(dāng)NAA、2，4-D、IBA的濃度均處于0.2 mg·L-1時(shí)，NAA與2，4-D配合使用對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的作用效果強(qiáng)于NAA與IBA配合使用時(shí)的效果。而當(dāng)3者的濃度均處于0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1時(shí)，NAA與IBA組合的效果要優(yōu)于NAA與2，4-D組合的效果，其中以NAA 0.5 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1配合使用效果最好，愈傷組織誘導(dǎo)率為71.4%～95.2%。

2.2 細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素配合使用對(duì)誘導(dǎo)愈傷的影響

由表5可知，單獨(dú)使用IBA，愈傷組織誘導(dǎo)率為14.3%～34.3%，當(dāng)培養(yǎng)基中再添加6-BA時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率下降為0%～19%，這說(shuō)明6-BA對(duì)愈傷形成有抑制作用。當(dāng)IBA與KT配合使用時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率明顯提高，葉片的誘導(dǎo)率可達(dá)100%，莖段的誘導(dǎo)率可達(dá)96.5%，然而美中不足的是，葉片形成的愈傷量少且十分緊密，莖段形成的愈傷則呈現(xiàn)褐色。

3 主要結(jié)論

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響外植體形成愈傷的最主要因素之一，不同生長(zhǎng)素對(duì)樹(shù)莓葉柄、葉片、莖段形成愈傷的促進(jìn)作用不同，有報(bào)道指出，在某些植物中，不同種類的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)適宜搭配所產(chǎn)生的效果要比單獨(dú)使用時(shí)的效果好[7]。而本試驗(yàn)研究的結(jié)果則與之相反，無(wú)論是不同種類生長(zhǎng)素之間配合使用，還是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素配合使用，它們對(duì)形成愈傷的效果均不如使用單一生長(zhǎng)素時(shí)好，如以NAA 1.0 mg·L-1，選用葉柄作為外植體，形成愈傷的效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)到100%。2，4-D的作用效果居中，因?yàn)樗赡軐?duì)人體健康不利，有可能與細(xì)胞癌變有關(guān)，所以實(shí)際應(yīng)用中，在培養(yǎng)基選擇方面還是應(yīng)盡量選用不含2，4-D或2，4-D含量較低的培養(yǎng)基。在利用樹(shù)莓外植體形成愈傷組織時(shí)，雖然IBA與KT配合使用會(huì)得到較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，然而形成的愈傷組織質(zhì)量不好，所以在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)盡量避免添加細(xì)胞分裂素KT和6-BA。

在安偉等[8]做的關(guān)于紅寶玉樹(shù)莓的莖段培養(yǎng)及試管繁殖的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)莖段極易褐變死亡，這一現(xiàn)象在本次研究所用的材料——有刺黑樹(shù)莓中的表現(xiàn)也很明顯，這可能是因?yàn)榍o段酚類物質(zhì)含量和酚氧化酶活性較高。在以后的試驗(yàn)中，可預(yù)先在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，如維生素C、聚乙烯吡咯烷酮等，也可利用活性炭吸附有毒醌類物質(zhì)。

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（責(zé)任編輯：劉昀）