唐彩琰 陳建康

上期回顧：上期主要介紹了硒與動物繁殖力之間的關系、哺乳動物精液的脂肪酸組成以及精液的脂質(zhì)過氧化反應。

中圖分類號：S816.72 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）08-0058-04

4 公豬精液的抗氧化系統(tǒng)

在進化過程中，生物體會形成眾多特殊的抗氧化保護機制來應對活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）的作用。因此，正是有了這些天然抗氧化劑才使生物體能在富氧的環(huán)境中存活（Halliwell，1994）。這些機制被統(tǒng)稱為“抗氧化系統(tǒng)”。抗氧化系統(tǒng)種類多樣，主要負責保護細胞免受自由基的作用。Surai（2006）將這些系統(tǒng)概括為：

● 天然的脂溶性抗氧化劑（如維生素E、類胡蘿卜素、泛醌等）；

● 水溶性抗氧化劑（如抗壞血酸、尿酸、?；撬岬龋?/p>

● 抗氧化酶：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）；

● 由谷胱甘肽系統(tǒng)（谷胱甘肽、谷胱甘肽還原酶、谷氧還蛋白、谷胱甘肽過氧化物酶）和硫氧還蛋白系統(tǒng)（硫氧還蛋白、硫氧還蛋白過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶）組成的硫醇氧化還原系統(tǒng)。

保護性抗氧化劑化合物位于細胞器、亞細胞組分或細胞外，為細胞提供最大程度的保護作用。因此，活細胞的抗氧化系統(tǒng)包括3個重要的防御水平（Surai，2002，2006）。

第一級防御通過消除自由基的前體物或通過失活催化劑來防止自由基的形成，它由3種抗氧化酶即SOD、GSH-Px和CAT+金屬結(jié)合蛋白組成。由于超氧自由基是在細胞正常生理條件下產(chǎn)生的重要自由基（Halliwell，1994），因此，SOD（EC 1.15.1.1）被認為是細胞第一級抗氧化防御的主要成分。

目前，研究人員在哺乳動物中鑒定出了3種不同的SOD亞型，并給出了它們的基因組結(jié)構、cDNA序列和蛋白質(zhì)結(jié)構（Zelko等，2002）。應該注意的是，SOD1或銅（Cu）–SOD/鋅（Zn）-SOD是該家族首個被描述特征的酶，它是一種含有Cu和Zn的同源二聚體，幾乎只存在于細胞質(zhì)中。SOD1以32 kDa同源二聚體形式存在，存在于每一種被檢測細胞的細胞質(zhì)和細胞核中（Zelko等，2002）。該家族的第2個成員（SOD2）需要錳（Mn）作為輔因子，因此也被稱為Mn-SOD。研究表明，SOD2是一種96 kDa的同源四聚體，只存在于線粒體基質(zhì)中，而這里是超氧自由基生成的主要部位（Halliwell和Gutteridge，1999）。Mn-SOD是一種誘導型酶，其活性受細胞因子和氧化應激的影響。1982年，Marklund和其同事發(fā)現(xiàn)了第3種SOD同工酶，由于其只位于細胞外而被稱為細胞外超氧化物歧化酶（Extracellular Superoxide Dismutase，EC-SOD）。EC-SOD是一種分子量為135 000 kDa的糖蛋白，對肝素具有很高的親和力。EC-SOD的表達模式高度受限于特定的細胞類型和組織，其活性可能超過Cu-SOD、Zu-SOD或Mn-SOD。

超氧化物歧化酶按如下反應將超氧自由基歧化：

式中，SOD為超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）。

由SOD反應形成的過氧化氫可以被GSH-Px或CAT消除，并按如下反應模式還原為水：

式中，GSH-Px為谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase）；Catalase為過氧化氫酶。

過渡金屬離子還可加速脂質(zhì)過氧化物分解成細胞毒性產(chǎn)物，如醛類、烷氧基自由基和氫過氧自由基：

式中，LO*為脂質(zhì)自由基（Lipid free radical），LOO*為脂質(zhì)過氧化自由基（Lipid peroxyl radical），LOOH為脂質(zhì)過氧化物（Lipid hydroperoxide）。

因此，金屬結(jié)合蛋白（轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白、結(jié)合珠蛋白、血液結(jié)合素、金屬硫蛋白、血漿銅藍蛋白、鐵蛋白、白蛋白、肌紅蛋白等）也屬于第一級防御系統(tǒng)。

不幸的是，細胞的第一級抗氧化防御不足以完全阻止自由基的形成，一些自由基從第一級抗氧化系統(tǒng)的預防性安全篩選中逃逸出來，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用并對DNA和蛋白質(zhì)造成損傷。第二級防御系統(tǒng)由斷鏈抗氧化劑（維生素E、泛醌、類胡蘿卜素、維生素A、抗壞血酸、尿酸）和其他抗氧化劑組成。谷胱甘肽和硫氧還蛋白系統(tǒng)在第二級抗氧化防御中也有重要作用。斷鏈抗氧化劑將鏈增長反應中的鏈長度保持在盡可能小的程度來抑制過氧化作用。因此，Surai（2002）認為，斷鏈抗氧化劑是通過清除鏈反應中的過氧化自由基中間體來防止脂質(zhì)過氧化的增長過程：

式中，LOO*為脂質(zhì)過氧化自由基（Lipid peroxyl radical），Toc為生育酚（Tocopherol）；Toc*為生育酚自由基（Tocopherol radical）；LOOH為脂質(zhì)過氧化物（Lipid hydroperoxide）。上述反應中形成的過氧化氫可由GSH-Px清除。

然而，實際上細胞中的第二級抗氧化防御也不能阻止ROS和活性氮對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的破壞。在這種情況下，第三級防御是以可以消除或修復受損分子的系統(tǒng)為基礎。這一級抗氧化防御包括脂肪分解（脂肪酶）、蛋白水解[肽酶或蛋白酶（內(nèi)肽酶，Protease）]和其他酶[DNA修復酶、連接酶、核酸酶、聚合酶、蛋白酶（外肽酶，Proteinase）、磷脂酶和多種轉(zhuǎn)移酶]。

公豬精液的第一級抗氧化防御是由SOD、CAT和GSH-Px組成的（Strzezek等，1999；Kowalowka等，2008；Koziorowska-Gilun等，2011）。最初，從用冷凍公豬精液制備的上清液經(jīng)純化和定性后得到的SOD對氰化物敏感，其分子量為31 000，結(jié)構中含有Cu和Zn。

事實上，Kowalowka等（2008）對從公豬精漿中得到的細胞外分泌型SOD（EC-SOD）進行了純化同質(zhì)。SOD的分子性質(zhì)和特異性證實，這種純化的酶是公豬精漿中的細胞外Cu/Zn-SOD。從公豬精漿和精子中分離得到的SOD的抗原決定簇彼此相似（Orzolek等，2013）。公豬精漿中還含有CAT和谷胱甘肽（Koziorowska- Gilun等，2011）。然而，公豬精液中CAT的含量似乎相當?shù)?，尤其是與血液中的CAT濃度相比時。CAT在哺乳動物精液抗氧化防御中的保護作用值得懷疑（主要是在H2O2濃度遠高于生理水平時發(fā)揮功能）（Vernet等，2004）。

我們應該注意，在精子形成過程，含有CAT的過氧化物酶體會從生殖細胞中清除掉（Nenicu等，2007）。豬精液中有關抗氧化酶的數(shù)據(jù)是可變的。例如，在公豬精子中可以檢測到SOD活性，但檢測不到GSH-Px活性（Cerolini等，2001）。相反，這兩種酶的活性在精漿中都可以檢測到。SOD活性在不同公豬精子中差異很大，精子和精漿中每毫克蛋白質(zhì)的活性范圍分別為167.7 IU～926.6 IU和3.32 IU～13.8 IU （Cerolini等，2001）。

生殖道分泌的抗氧化劑能夠保護精子在射精后免受ROS的毒性作用。Koziorowska-Gilun等（2011）證明，清除精漿的氧化能力依賴于公豬生殖道中各種液體所含的不同抗氧化劑的作用。他們還指出，精子在附睪尾部表現(xiàn)出較高的SOD活性和相對較低的PH-GSH-Px活性。附睪尾部精子中GSH-Px活性、谷胱甘肽還原酶活性和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性可以忽略不計，而CAT的活性檢測不到。附睪尾部和前列腺液中SOD的活性更高。此外，前列腺液似乎是精漿中CAT活性的主要來源，而附睪尾部液體中GSH-Px的活性最高（Koziorowska-Gilun等，2011）。

精子和精漿中CAT的濃度很低，因此谷胱甘肽和GSH-Px是清除已生成的過氧化氫的主要成分（Surai，2006）。小鼠精子中的GSH水平相對較高，而豬精子僅含痕量的GSH（Luberda，2005）。此外，公豬精子中的GSH-Px活性以及谷胱甘肽還原酶的活性都很低或無法檢測到（Li，1975）。然而，公豬精漿含有極高水平的GSH （Strzezek等，1999；Strzezek，2002）。

據(jù)推測，公豬精子難以抵抗誘導型ROS的毒性作用（Strzezek等，2005），因為精漿中SOD水平相當?shù)颓胰狈SH-Px。該作者認為，L-谷胱甘肽、L-麥角硫因和L-維生素C是負責精漿抗氧化功能的主要化合物。然而，公豬精漿僅含有中等濃度的抗壞血酸（Audet等，2004）。有趣的是，Audet等（2004）未能在公豬精漿中測到維生素E；且公豬精子中的維生素E濃度比血漿維生素E水平低10%（Audet等，2009）。然而，由于處理過程中精細胞產(chǎn)生的ROS增多，在人工繁育行業(yè)，保護精細胞免受氧化損傷特別重要（Bathgate，2011）。

向公豬精液中添加抗氧化劑可提高精子質(zhì)量的觀察結(jié)果間接證明了ROS對精子功能具有破壞作用。Cerolini等（2000）的研究證明公豬精子的活性在儲存過程中逐漸降低，而當向稀釋劑中添加維生素E后可顯著抑制這種趨勢。特別是添加維生素E可顯著降低過氧化作用（精子產(chǎn)生的硫代巴比妥酸）。儲存在處理稀釋劑中的精子隨著培養(yǎng)基中維生素E含量的降低會快速地富集α-生育酚。在精子儲存期間，向稀釋液中加入α-生育酚能顯著有效地防止發(fā)生對照組精子磷脂中22：6n3水平顯著降低的那種情況。精液冷凍保存會增加ROS的產(chǎn)生，導致精子膜受損（Buhr等，1994；Chatterjee等，2001）。向解凍培養(yǎng)基中添加GSH可減少獲能的活精子數(shù)；隨著膜蛋白中巰基的變化，精子數(shù)量減少；ROS產(chǎn)生減少；染色質(zhì)濃縮較低；卵母細胞體外滲透能力增強；精子頭解凝比例升高（Gadea等，2005）。與對照相比，在添加亞硒酸鈉（Sodium Selenite，SS）、硒代蛋氨酸（Selenomethionine，SeMet）和維生素E（分別為5.5 μg/L和1.0 mM）的稀釋液中，公豬精子的運動性、活力和頂體反應均顯著增強（Tareq等，2012）。此外，在含有300 μM氨的稀釋液中，用SeMet和SeMet + 維生素E處理精子也能導致相同精液質(zhì)量參數(shù)的顯著增加。顯然，有必要進一步闡明公豬精液抗氧化防御系統(tǒng)的組成和功效。

盡管通常來說ROS過量產(chǎn)生對精子有害，但越來越多的證據(jù)表明低水平的ROS會參與控制哺乳動物精子的一系列生理功能（Surai，2006）。因此，各種試圖在公豬精液儲存過程中通過向稀釋劑中添加各種抗氧化劑來減少精液中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化作用的嘗試都應該非常小心，因為ROS可以通過多種信號傳導途徑（如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑）調(diào)節(jié)公豬精子的獲能，該途徑可以根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量對其進行不同的磷酸化（Awada等，2009；Awda和Buhr，2010）。事實上，這些作者證明，暴露于ROS產(chǎn)生系統(tǒng)以及隨后在獲能培養(yǎng)液中孵育時的公豬精子，其頂體反應的百分比隨時間的推移顯著增加。通常來說，低水平的ROS可誘導精子超活化、獲能、精子-卵細胞融合和頂體丟失，而高濃度的ROS可抑制精子-卵細胞融合，降低精子的運動性，并會損害精子的DNA（Surai，2006）。

通過營養(yǎng)手段提高精子的抗氧化能力可以為提高雄性動物繁殖能力提供重要的機會。有效防止脂質(zhì)過氧化作用的有益結(jié)果可能是由兩種相關的機制引起的（Surai，2006）。首先，抗過氧化損傷的防御措施對于防止精子磷脂功能上重要的C20-22 PUFA水平下降以及維持精子結(jié)構的完整性至關重要。其次，盡可能減少脂質(zhì)過氧化作用可防止過氧化作用的有毒產(chǎn)物的積累。對于在精液冷凍保存期間使用抗氧化劑來改善精子活力我們還可以設想存在其他可能性。

考慮到含硒蛋白在細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中的重要作用以及在應對各種應激時含硒蛋白表達增加（Surai，2006），很明顯，精液的抗氧化防御和公豬最佳硒營養(yǎng)的重要性想要高估也困難。

（待續(xù)）

原題名：Selenium in pig nutrition and reproduction： boars and semen quality - a review（英文）

原作者：Peter F. Surai（匈牙利）和Vladimir I. Fisinin（俄羅斯）