王全文 劉亞丹 王海珍 宋鵬康 王媛媛 郭曉紅 曹果清 李步高 高鵬飛

摘 要：為了研究MYH10在豬不同類型肌肉中的表達變化趨勢，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-time Polymerase Chain Reaction，Real-time PCR）技術(shù)檢測了3個發(fā)育日齡的大白豬和山西黑豬三種肌肉組織中MYH10基因的表達變化。結(jié)果表明，MYH10基因在兩個品種的背最長肌和腰大肌中的表達存在相似的變化趨勢。在25日齡的背最長肌和腰大肌中的表達量最高，在70 d時表達量降到最低水平，而后背最長肌表達量逐漸升高，但腰大肌的表達量仍然保持在低水平。兩個品種不同組織間的表達結(jié)果相似，在25 d和70 d時MYH10在腰大肌中表達極顯著高于背最長肌和股二頭?。≒<0.01），而在發(fā)育后期背最長肌和股二頭肌中的表達量逐漸升高，150 d時極顯著高于腰大肌的表達量（P<0.01）。本研究的結(jié)果充分說明，MYH10在肌纖維發(fā)育與分化過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：山西豬；大白豬；MYH10；發(fā)育性表達

中圖分類號：S831 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2018）05-0030-04

哺乳動物的肌肉組織大約占該動物機體組織的50%，它不但是主要的運動器官，而且是家養(yǎng)動物重要的經(jīng)濟性狀[1]。肌球蛋白在肌肉的生長發(fā)育、運動收縮過程起重要作用。肌原纖維由粗絲和細絲組成，其中肌纖維粗絲的主要成分為肌球蛋白，在不同物種中肌球蛋白的基本結(jié)構(gòu)是一致的，都是由兩條肌球蛋白重鏈和四條肌球蛋白輕鏈構(gòu)成[2-4]。其中肌球蛋白輕鏈作為結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白在肌纖維發(fā)生分化、肌肉運動和代謝等過程中發(fā)揮重要生理功能。肌球蛋白重鏈是骨骼肌收縮蛋白的重要組成成分，其主要功能是參與肌肉收縮功能[5-6]。雷蒙特等揭示了它的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在肌球蛋白的頭部含有肌動蛋白和核苷酸的結(jié)合位點，具有三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）酶活性，通過ATP水解，將化學能轉(zhuǎn)化為機械能，產(chǎn)生肌肉收縮[2，7]。

肌球蛋白10（Myosin-10）基因也稱為MYH10，為肌球蛋白超家族中的一員，是一種在脊椎動物中表達的非傳統(tǒng)肌球蛋白，它參與細胞增殖、黏附、遷移及吞噬等運動行為，是通過與微絲、微管相互作用來調(diào)控的[8-11]。MYH10存在于肌細胞，具有收縮功能，在非肌細胞中的功能也與肌球蛋白有關(guān)[12]。

新山西黑豬是在原山西黑豬（血源為馬身豬、內(nèi)江豬和巴克夏豬）與杜洛克豬進行雜交選育而成的品種，具有產(chǎn)仔數(shù)高、肉品質(zhì)好、抗逆性強等優(yōu)點[13]。本研究將山西黑豬和大白豬作為對照的動物模型，選擇25日齡、70日齡和150日齡三個不同生長階段，采用實時定量PCR技術(shù)對MYH10基因在兩個品種中的時序性表達變化趨勢以及表達差異進行分析，為研究豬肌肉發(fā)育的分子機理提供理論參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗樣本采集

本試驗的試驗動物為大白豬和山西黑豬，飼養(yǎng)于山西省鄉(xiāng)寧縣永新康生態(tài)養(yǎng)殖有限公司，同期組建試驗豬群，飼養(yǎng)管理條件相同。在兩個品種仔豬的25 d、70 d和150 d分別屠宰3頭，共18頭，屠宰后取背最長肌、腰大肌、股二頭肌等組織，用焦碳酸二乙酯水洗去表面血液，立即投入液氮，后在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與耗材

Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；PrimeScriptTMRT Reagent kit with gDNA Eraser、SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit購買于大連寶生物工程有限公司；乙醇、異丙醇等常規(guī)生化試劑均為分析純。

1.3 總RNA的提取與cDNA第一條鏈的合成

總RNA的提取按照Trizol（Invitrogen）試劑手冊進行操作，取2 μL提取的RNA于ND1000核酸蛋白測定儀測定純度及濃度，要求OD260/280值在1.9～2.1之間。反轉(zhuǎn)錄按照gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄（TaKaRa）說明書進行。

1.4 引物設(shè)計與合成

參考NCBI數(shù)據(jù)庫中豬MYH10的序列信息，以18S為內(nèi)參基因，選用Primer Premier 5.0結(jié)合Oligo 6.0軟件進行引物設(shè)計，引物序列信息見表1。引物委托上海生物工程有限公司合成。

1.5 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化

根據(jù)SYBR?PrimeScriptTM RT-PCR Kit試劑盒說明書建議的反應(yīng)條件，以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA進行常規(guī)梯度PCR擴增，分別篩選內(nèi)標基因和目的基因引物的最佳退火溫度、cDNA模板濃度，確定引物退火溫度后，進行Real-time PCR檢測相應(yīng)引物擴增熔解曲線、目的基因和內(nèi)標基因的擴增效率。

1.6 標準曲線的制作

由反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，5倍稀釋5個濃度梯度，根據(jù)篩選優(yōu)化結(jié)果，進行Real-time PCR反應(yīng)，建立標準曲線。

借助MXPro-MX3000P軟件（Stratagene公司）分析導出內(nèi)標基因和目的基因標準曲線方程、擴增效率R2以及直線方程系數(shù)，并分析各基因之間的擴增效率。用優(yōu)化確定的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行目的基因的相對定量分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

Real-time PCR結(jié)果應(yīng)用MXPro-MX3000P軟件（Stratagene公司）導出。采用-△△Ct方法獲得目的基因的相對表達量。用SPSS 22.0軟件對同一品種不同時間點或不同組織進行單因素方差分析，并用鄧肯氏法進行多重比較；用獨立樣本t檢驗分析兩個品種間同一基因的表達差異。采用GraphPad Prism 5進行圖表的繪制與輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA樣本濃度與純度的檢測結(jié)果

用核酸蛋白測定儀測定各樣本RNA的濃度及純度，根據(jù)所測結(jié)果計算反轉(zhuǎn)錄時所需的RNA量。經(jīng)過檢測，所有樣本RNA的OD260/280值都在1.9～ 2.1之間，濃度在311 ng/μL～3 183 ng/μL。質(zhì)量良好，可以進行后續(xù)試驗。

2.2 實時熒光定量PCR擴增動力學曲線

本試驗以18S rRNA為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因和目的基因擴增曲線拐點清楚，基線平直，曲線良好。試驗樣本的擴增溶解曲線見圖1。18S和MYH10基因的擴增產(chǎn)物的Tm值都為單峰值，表明擴增過程中沒有二聚體生成，擴增效果較好。

2.3 不同時期MYH10 mRNA的表達檢測結(jié)果

圖2是MYH10基因在大白豬和山西黑豬三個時間點的表達趨勢檢測結(jié)果。以25日齡大白豬腰大肌中MYH10的表達值作為對照。圖2-A是背最長肌中的表達檢測結(jié)果。從結(jié)果可知，MYH10基因在兩個品種中都具有先降低后升高的表達趨勢。MYH10基因在25 d和150 d表達量極顯著高于70 d的表達量（P<0.01）。在三個采樣點對兩個品種間的表達量進行比較發(fā)現(xiàn)，25 d和70 d大白豬的表達量極顯著高于山西黑豬（P<0.01），而150 d時大白豬和山西黑豬的背最長肌中的表達量無顯著差異（P>0.05）。

MYH10基因在腰大肌中的表達檢測結(jié)果見圖2-B。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，大白豬和山西黑豬腰大肌中MYH10基因在前期表達較高，隨著日齡的不斷增加，表達量出現(xiàn)極顯著的下降（P<0.01）。大白豬中，25 d腰大肌MYH10的表達水平極顯著高于70 d和150 d，而70 d和150 d的表達量差異不顯著（P>0.05）。在山西黑豬中，25 d和70 d腰大肌中MYH10的表達量不存在差異，但極顯著高于150 d的表達量。

與背最長肌和腰大肌相比，股二頭肌中MYH10的表達并沒有發(fā)生顯著的時序性變化，結(jié)果見圖2-C。25 d和150 d大白豬和山西黑豬MYH10表達差異顯著（P<0.05），而70 d的大白豬和山西黑豬表達無顯著差異（P>0.05）。

兩個品種不同組織間的表達結(jié)果相類似，在發(fā)育前期（25 d）MYH10在腰大肌中表達極顯著高于背最長肌和股二頭?。≒<0.01），而在發(fā)育后期背最長肌和股二頭肌中的表達量逐漸升高，150 d時極顯著高于腰大肌中的表達量（圖3）。

3 討論

仔豬出生至斷奶一段時間內(nèi)，運動量比較小，肌肉主要由Ⅰ型肌纖維組成，隨后逐漸被Ⅱ型肌纖維取代，其中隨著日齡的增加，Ⅰ型肌纖維顯著下降，Ⅱb型肌纖維顯著升高，Ⅱa和Ⅱx型肌纖維先降低再升高[14-15]。胡帥帥等[16]研究得出在家兔中MYH6基因與肌纖維發(fā)育相關(guān)。在本次試驗中兩個品種的背最長肌和腰大肌中MYH10基因在斷奶時（25日齡）的表達量高于在其他日齡時的表達量，而后隨著生長發(fā)育，表達量逐漸降低，在保育期結(jié)束時（70日齡）降到最低水平，而后背最長肌表達量逐漸升高，但腰大肌的表達量仍然保持在低水平，可能是由于這三種肌肉的肌纖維類型發(fā)育不同造成的，說明MYH10在肌纖維發(fā)育與分化過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

通過對大白豬和山西黑豬不同日齡不同組織中MYH10基因mRNA發(fā)育性表達的檢測，MYH10對不同肌肉中肌纖維的類型存在重要的調(diào)節(jié)作用，本研究結(jié)果可為深入研究肌纖維的發(fā)育提供理論參考。

參考文獻：（16篇，略）