劉彥希　王碩　韓黎　韓雪琳　孫群

摘要：為明確煙曲霉感染肺上皮細(xì)胞過程中宿主與病原菌煙曲霉之間的相互作用，該研究探究在煙曲霉孢子內(nèi)化侵入肺上皮細(xì)胞過程中細(xì)胞表面dectin-1受體的表達(dá)隨時間的變化規(guī)律及其與侵入孢子的空間位置關(guān)系。通過RT-PCR的方法檢測煙曲霉孢子刺激Ⅱ型肺上皮細(xì)胞A549后不同時間的mRNA水平變化，以及利用熒光顯微鏡觀察煙曲霉孢子侵入A549細(xì)胞后其周圍dectin-1的分布情況。結(jié)果表明：在該侵入過程中，A549細(xì)胞中dectin-1的mRNA表達(dá)水平無顯著性變化，但其可在孢子周圍形成“吞噬環(huán)”。因此，在煙曲霉內(nèi)化侵入肺上皮細(xì)胞的過程中，dectin-1的表達(dá)不發(fā)生變化，這與人支氣管上皮細(xì)胞中dectin-1的誘導(dǎo)型表達(dá)增加現(xiàn)象不同；但在煙曲霉孢子周圍，dectin-1發(fā)生聚集，這種模式識別受體在病原體周圍的聚集可能會促進(jìn)吞噬。關(guān)鍵詞：A549細(xì)胞；dectin-1；煙曲霉；吞噬

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-5124（2018）05-0058～05

0引言

煙曲霉在環(huán)境中廣泛存在，營腐生生活，是一種重要的條件性致病真菌。由于煙曲霉分生孢子顆粒微小，可飄浮在空氣中，極易通過呼吸道進(jìn)入人體引起肺部感染。雖然人們每天都會吸入煙曲霉孢子，但正常的免疫系統(tǒng)可快速有效地應(yīng)答并阻止真菌的生長和侵襲，然而在免疫系統(tǒng)有缺陷的病人中，煙曲霉感染造成的侵襲性曲霉病的死亡率高達(dá)90%。

在煙曲霉進(jìn)入肺部的過程中，首先接觸到是呼吸道上皮細(xì)胞，如支氣管上皮細(xì)胞或肺泡上皮細(xì)胞。這些人體上皮細(xì)胞是抵御病原微生物入侵的第一道防線，在機(jī)體天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，但與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等淋巴細(xì)胞相比，上皮細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。煙曲霉孢子顆粒微小，能誘導(dǎo)細(xì)胞骨架發(fā)生改變而內(nèi)化侵入肺上皮細(xì)胞，并引起炎癥因子釋放、呼吸暴發(fā)等一系列天然免疫反應(yīng)，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制和可能觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍不清楚。

在煙曲霉與肺部細(xì)胞相互作用的過程中，細(xì)胞表面的模式識別受體如c型凝集素樣受體（dectin-1，dectin-2，甘露糖受體等）、toll樣受體（TLR2，TLR4，TLR6等）、NOD樣受體（NLRP3，NLRP4，NOD2等）發(fā)揮了重要的作用。這些模式識別受體可以識別各種真菌的組分，如β-葡聚糖、甘露糖、甘露糖蛋白、幾丁質(zhì)以及真菌來源的RNA和未甲基化的DNA。與配體結(jié)合后，模式識別受體將啟動各種信號級聯(lián)反應(yīng)形成免疫應(yīng)答，再通過吞噬、細(xì)胞因子產(chǎn)生和活性氮（氧）產(chǎn)生導(dǎo)致真菌內(nèi)化。

dectin-1是一種II型跨膜受體，從胞外到胞內(nèi)依次是C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域、莖、跨膜結(jié)構(gòu)域和免疫受體酪氨酸激酶活化基序。最開始人們認(rèn)為dectin-1是樹突狀細(xì)胞（dendritic cell）上的特異性受體，后其被證實在其他細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和一些T細(xì)胞中也有表達(dá)。dectin-1是髓樣細(xì)胞表面識別真菌細(xì)胞壁組分β-1，3葡聚糖的主要受體，可識別包括煙曲霉和白色念珠菌在內(nèi)的多種真菌，在天然免疫過程中發(fā)揮重要作用。

目前關(guān)于dectin-1的研究主要集中于免疫細(xì)胞，對于上皮細(xì)胞表面dectin-1的相關(guān)研究較少。本課題組前期通過流式細(xì)胞儀和蛋白質(zhì)免疫印跡法發(fā)現(xiàn)在II型肺泡上皮細(xì)胞A549中有dectin-1的表達(dá)。在此研究的基礎(chǔ)上，本文對煙曲霉感染肺上皮細(xì)胞A549過程中細(xì)胞表面dectin-1的表達(dá)規(guī)律和其與煙曲霉侵入孢子的空間位置關(guān)系進(jìn)行研究，旨在為煙曲霉侵染肺上皮細(xì)胞的感染過程及其機(jī)制提供理論及實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1細(xì)胞系

腺癌人類肺泡基底上皮細(xì)胞系（人肺泡上皮細(xì)胞）A549為本實驗平臺自主保存。

1.1.2菌株

可表達(dá)GFP綠色熒光蛋白的煙曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCCl3073菌株，受贈于Margo M.Moore教授（加拿大Simon Fraser University）。

1.1.3試劑

dectin-1（N-16）抗體，驢抗山羊IgG-FITC抗體（美國Santa Cruz Biotechnology）；RPMI 1640（1×）細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清（德國Gibco）；胰蛋白酶（美國Amresco）；多聚甲醛，Triton X-100，TRIzol（美國Sigma）；RNA提取試劑盒（美國Promega）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒（中國Takara）；青霉素，鏈霉素（中國浙江丹康）；BSA（中國上海愛必信）。

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SD）：蛋白胨10g，葡萄糖40g，蒸餾水定容至1 L并121℃高壓滅菌20min。

沙氏葡萄糖固體培養(yǎng)基（SDA）：蛋白胨10g，葡萄糖40 g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1 L并121℃高壓滅菌20min。

磷酸鹽緩沖液PBS（pH 7.4）：氯化鈉8 g，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.44g，磷酸二氫鉀0.24g，雙蒸水900mL，調(diào)節(jié)pH至7.4，雙蒸水定容至1 000mL，121℃高壓滅菌20 min。

雙抗：青霉素400萬U，鏈霉素400萬U，PBS（pH 7.4）40 mL，完全溶解后過濾除菌（1 000倍稀釋使用）。

4%多聚甲醛：多聚甲醛4g，PBS（pH 7A）100mL，完全溶解后過濾除菌。

0.1%Triton X-100：Triton X-100 0.1 mL，無菌雙蒸水100mL。

5%BSA：BSA 0.25g，PBS（pH 7.4）5mL。

1.1.4引物

本研究所用引物由Pubmed和Primer premierv5.0設(shè)計，由華大基因公司合成（如表1所示），其中甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因。

1.2儀器與設(shè)備

CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱（F013TIa Series II），生物安全柜（1300 SeriesA2），美國Thermo公司；電熱恒溫水槽（DK-SD），上海精宏實驗設(shè)備有限公司；臺式冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5418R），微量移液器，德國Ep-pendoff公司；臺式高速冷凍離心機(jī)（Allegra X-22R），漩渦混合器，美國Benchmark公司；倒置熒光顯微鏡（DMIRE2），德國Leiea公司；正置熒光顯微鏡（BX51），日本OLYMPUS公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿舨（35ram，24孔板，96孔板），美國Co～ar公司；PCR擴(kuò)增儀9700，美國ABI公司；實時熒光定量PCR儀（Rad-IQ5），美國Bio-Rad公司；RT-PCR用96孔板、熱蓋膜，美國Axygen公司：激光共聚焦顯微鏡A1R+/A1，日本Nikon。

1.3方法

1.3.1煙曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073孢子膨脹

取1×10⁸個煙曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCCl3073休眠孢子于5 mL沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，放置在37℃搖床，200 r/min，膨脹4h；膨脹結(jié)束后，室溫下5 000r/min，離心5 min，得膨脹孢子沉淀，使用適量PBS洗3遍，血球計數(shù)板計數(shù)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2煙曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073膨脹孢子作用A549細(xì)胞

將1×10⁶個A549細(xì)胞種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿/六孔板（用于RT-PCR實驗）或激光共聚焦專用皿（用于免疫熒光實驗）中培養(yǎng)20h后，37℃、PBS潤洗細(xì)胞兩次，加入1 mL 1x107+/mL的煙曲霉（Aspergillus furnigatus）ATCCl3073膨脹孢子-1640完全培養(yǎng)基混合液分別作用0，0.5，1，2h，其中0h作為空白組即不加入膨脹孢子刺激，且每個實驗組設(shè)置3個平行皿；作用結(jié)束后，PBS清洗細(xì)胞3遍。

1.3.3RT-PCR

按照1.3.2刺激結(jié)束后棄培養(yǎng)上清液，用無菌PBS洗滌細(xì)胞3次以去除分生孢子，向每皿加入1 mLTRhol，獲得每個皿中A549細(xì)胞的總RNA。根據(jù)RNA提取試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟，提取分離并獲得每個樣品的總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR擴(kuò)增儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后按照熒光定量PCR試劑盒標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟操作，所用的引物如表1所示，內(nèi)參基因為GAPDH，在實時熒光定量PCR儀中按照以下循環(huán)條件進(jìn)行熒光定量PCR：首先95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，55℃退火30 s，此預(yù)變性一變性一退火過程共40次循環(huán)；再以95℃變性1min，55℃退火1min；最后從55℃以0.5～C/s緩慢變性至95℃。

所得Ct值數(shù)據(jù)采用2^-⊿⊿Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：⊿Ct=Ct（dectin-1）-Ct（GAPDH）；-⊿⊿Ct=⊿Ct（對照組）-⊿Ct（實驗組），其中對照組為Oh組，實驗組為0.5，1，2h組，且-⊿⊿Ct（對照組）為0；計算2^-⊿⊿Ct，其中對照組的2^-⊿⊿Ct為1：所得數(shù)據(jù)使用GraphPadPrism 5.0分析作圖，數(shù)據(jù)均以均值±sD表示，誤差線表示均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。使用t檢驗比較組間差異，并且P<0.05被認(rèn)為具有顯著性差異。

1.3.4免疫熒光

按照1.3.2作用結(jié)束的A549細(xì)胞用預(yù)冷70%甲醇在4℃下固定細(xì)胞15 min，0.1%Triton X-100透化細(xì)胞5 min，5%BSA室溫封閉30 min后避光條件室溫孵育一抗（dectin-1抗體1：50稀釋）2 h，濕盒避光孵育二抗（驢抗山羊IgG-FITC抗體1：200稀釋），DAPI染色液染色3～5 min，滴加抗熒光淬滅封片液后甘油封片，最后激光共聚焦顯微鏡鏡下觀察拍片。

2結(jié)果與分析

2.1

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073膨

脹孢子作用肺上皮細(xì)胞A549不同時間后

dectin-1的表達(dá)情況

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073膨脹孢子分別作用肺上皮細(xì)胞A549不同時間（0，0.5，1，2h）后，提取每份樣品細(xì)胞的總RNA，然后通過RT-PcR探究肺上皮細(xì)胞中是否有dectin-1的表達(dá)及其隨膨脹孢子侵入時長變化的表達(dá)規(guī)律。本實驗結(jié)果如圖1所示，肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞中有dectin-1的表達(dá)；當(dāng)煙曲霉（AspergiZlus fumigatus）ATCC13073膨脹孢子作用肺上皮細(xì)胞0.5，1 h及2h時，dectin-1的mRNA表達(dá)水平雖然有上升趨勢，但并沒有顯著差異（P>0.05）。這一結(jié)果進(jìn)一步佐證了早期本實驗室通過流式細(xì)胞術(shù)及Western Blot的方法證明A549細(xì)胞表面存在dectin-1的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞表面dectin-1表達(dá)量不隨煙曲霉（AspergiUus fumigatus）ATCC13073膨脹孢子侵入時間而變化，但其空間位置分布是否發(fā)生變化需下一步證明。

2.2煙曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCC13073膨脹孢子作用肺上皮細(xì)胞A549不同時間后dectin-1的空間分布情況

煙曲霉（Aspergillus fumigatus）ATCCl3073膨脹孢子分別作用肺上皮細(xì)胞A549不同時間（0，0.5，1，2h，其中0h作為對照組）后，采用免疫熒光法進(jìn)一步驗證肺上皮細(xì)胞中dectin-1的表達(dá)及探究其與煙曲霉的空間關(guān)系。結(jié)果如圖2所示，肺上皮細(xì)胞A549中的確有dectin-1的表達(dá)：并且當(dāng)煙曲霉膨脹孢子作用細(xì)胞時，肺上皮細(xì)胞A549表面dectin-1會聚集在孢子周圍形成“吞噬環(huán)”（圖2中紅色箭頭表示），但不同時間內(nèi)的表達(dá)無差異。

3結(jié)束語

在煙曲霉和肺上皮細(xì)胞相互作用的過程中，dectin-1可以介導(dǎo)煙曲霉內(nèi)化侵入肺上皮細(xì)胞中，雖然沒有發(fā)現(xiàn)煙曲霉可以使A549細(xì)胞中dectin-1的表達(dá)升高，但是通過dectin-1的特異性染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察到了煙曲霉膨脹孢子周圍有“吞噬環(huán)”，這更加直觀地證明了dectin-1在煙曲霉內(nèi)化侵入肺上皮細(xì)胞A549過程中，細(xì)胞表面的dectin-1會響應(yīng)煙曲霉孢子的侵入過程，空間上聚集在侵入孢子周圍，促進(jìn)肺上皮細(xì)胞A549對煙曲霉孢子的吞噬，也有可能更加快速準(zhǔn)確地引起細(xì)胞內(nèi)下游信號通路（如吞噬、炎癥因子釋放等）的激活，以響應(yīng)煙曲霉孢子的侵入過程。這一空間分布的變化說明了dectin-1在煙曲霉孢子侵入肺上皮細(xì)胞A549的進(jìn)程中起著重要作用。有研究表明dectin-1在人支氣管上皮細(xì)胞中表達(dá)水平較低，但是在煙曲霉孢子刺激下，dectin-1的表達(dá)會明顯上調(diào)，并且該過程依賴TLR2tm。這與我們的結(jié)果不同，可能是由于使用的細(xì)胞不同，也可能是由于使用孢子的感染比，以及其刺激時間長達(dá)6h和18h，在此狀態(tài)下，煙曲霉已經(jīng)萌發(fā)出芽并形成菌絲。膨脹孢子與已長出菌絲的孢子表面暴露的病原相關(guān)分子模式的種類及其含量是不同的。

一種病原體進(jìn)入宿主細(xì)胞是非常復(fù)雜的過程，會有多種模式識別受體識別一種病原相關(guān)分子模式，也會有其他種類的模式識別受體識別細(xì)胞表面其他病原相關(guān)分子模式。不同的模式識別受體可能相互依賴相互協(xié)調(diào)，也可能具有拮抗作用。能介導(dǎo)煙曲霉進(jìn)入細(xì)胞的主要受體除了dectin-1，還有CR3，而這兩種受體之間的相互關(guān)系仍不清楚，兩種受體下游的信號通路是否存在交叉也會在下一步實驗中進(jìn)行闡明。

（編輯：莫婕）