蔡春霞 李茂業(yè) 陳德鑫 潘敬 劉明科 齊禹哲 肖麗娜 任春燕 刁朝強 徐傳濤 沈祥祥 鄧雙躍

摘 要：為明確田間自然罹病煙蚜僵蟲上的真菌種類和篩選出對煙蚜的高毒力菌株，將采集的煙蚜僵蟲經過常規(guī)分離、純化，進行了菌落生長、產孢量、形態(tài)觀察、ITS序列測定、系統發(fā)育樹構建以及對室內煙蚜毒力測定的研究。結果表明，從煙蚜僵蟲體上分離純化出8株菌株，經生物學特性觀察、ITS序列對比和構建系統發(fā)育樹準確鑒定出這8株菌株均是蠟蚧輪枝菌。綜合生物學培養(yǎng)和毒力測定結果，得出菌株V4為優(yōu)良菌種，具有產孢量高（1.89×109個/皿），生長速率快（15 d菌落直徑達到68.78 mm），對煙蚜毒力強（第7天的校正死亡率為84.99%，LT50為4.51 d）的特性，具備田間持續(xù)控制煙蚜的潛力。

關鍵詞：蠟蚧輪枝菌；煙蚜；生物學特性；系統發(fā)育樹；致病性

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）05-0086-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.012

Abstract： The objectives of this study are to identify the species of fungi collected from naturally diseased Myzus persicae（Sulzer） aphids in the field and to screen the highly virulent strains against M. persicae aphids. After conventional isolation and purification of the collected diseased M. persicae aphids， the strains were used for colony growth， sporulation， morphological observation， ITS sequence analysis， phylogenetic tree construction and indoor toxicity determination. The results showed that： 8 strains were isolated systematically from diseased M. persicae aphids which were Verticillium lecanii through identification by biological characteristics， ITS sequence comparison and phylogenetic tree construction. Strain V4 was selected based on biological culture and virulence test. Strain 4 showed more sporulation yields （1.89×109 / dish）， fast growth rate （reached 68.78 mm at 15 days）， batter pathogenicity to M. persicae aphids （7 day corrected mortality was 84.99% and the LT50 was 4.51 d） which has the potential to control the M. persicae aphids continuously in the field.

Keywords： Verticillium lecanii； Myzus persicae aphids； biological characteristics； phylogenetic tree； pathogenicity

大面積使用化學農藥導致環(huán)境污染、農藥殘留和昆蟲產生抗藥性等問題日益突出[1]，近年來以生物防治為主的害蟲防治策略受到廣泛重視[2]。在眾多的微生物殺蟲劑中，昆蟲病原真菌具有易侵染寄主、擴散范圍廣、宿存時間長、寄主不易產生抗性、易進行規(guī)?；a等優(yōu)勢[3]，因此，昆蟲病原真菌在控制害蟲種群數量方面起著至關重要的作用[4]，被認為是化學殺蟲劑的重要輔助品或者替代品[5-6]。

相關研究表明，在自然界中，真菌流行病引起昆蟲死亡率達到60%，可以看出昆蟲病原真菌對控制害蟲種群消長的作用非常大[7]。王清海等[8]報告，我國已發(fā)現的昆蟲病原真菌涉及40多屬405種；國際上登記注冊的真菌殺蟲劑主要有球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）、金龜子白僵菌（Metarhizium anisopliae）、玫煙擬青霉（Paecilomyces furmosoroseus）和蠟蚧輪枝菌（Verticillium lecanii）等[9]。ZHANG等[10]從紅脂大小蠹中篩選出12株白僵菌，其中致病性最強的菌株Bb202，當它的分生孢子濃度為1.0×107孢子/mL時，LT50為4.60 d。張松影等[11]從褐飛虱罹病蟲體上分離出一株黃綠綠僵菌Mf82，將該菌株以1.0×108孢子/mL的孢子液接種到褐飛虱成蟲體表上，累計校正死亡率達83.8%，LT50為4.47 d?？篆偟萚12]研究蚜蟲上分離出的蠟蚧輪枝菌對月季長管蚜的致病性會隨著孢子濃度的增加而增強，當濃度為2.0×108孢子/mL對月季長管蚜感染致死的LT50=（4.69±0.16）d，第8天的死亡率達93.6%。從自然界的僵蟲上可以分離出多個菌株，但是不同的昆蟲病原真菌菌株間的差異性較大，因此在鑒定出菌株種類后需要進一步對菌株的致病性進行研究。

本文從貴州煙田采集自然罹病煙蚜，分離純化出真菌，通過菌落生長培養(yǎng)、產孢量測定、顯微觀察進行形態(tài)鑒定；通過ITS序列測定以及系統發(fā)育樹構建進行分子鑒定，以準確鑒定僵蟲上真菌的種類。將分離鑒定出來的菌株對煙蚜進行室內毒力測定，以明確菌株致病性，為煙蚜以及其他農業(yè)害蟲的生物防治提供基礎，以減少化學農藥的使用對環(huán)境的污染和天敵昆蟲的藥害。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

八個菌株分別編號為V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8，均分離純化自貴州省貴陽市開陽縣煙田煙草植株上自然罹病的煙蚜蟲體。

1.2 供試昆蟲

煙蚜飼養(yǎng)于安徽農業(yè)大學植物保護學院溫室內種植的煙草。

1.3 培養(yǎng)基

SDAY培養(yǎng)基：10%酵母浸出粉、40% 葡萄糖、10% 蛋白胨、20% 瓊脂、pH為6.0±0.1。

L-broth培養(yǎng)基：1% 蛋白胨、0.5% NaCl、0.3%酵母浸出粉、2%蔗糖、2%瓊脂。

PDA培養(yǎng)基（購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司）成分：6 g/L馬鈴薯浸粉、20 g/L葡萄糖、20 g/L瓊脂、pH值為5.6±0.2。

1.4 分離與保存

將罹病蚜蟲從煙葉上挑下，表面消毒后，直接放到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經過多次培養(yǎng)后，純化出8個菌株，并將8個菌株做成試管斜面保存于4 ℃冰箱，進行定期轉管保存，同時，制作成甘油菌，進行長期保存。

1.5 菌株系統鑒定

形態(tài)鑒定：將分離純化后的菌株配成孢子懸液，吸取2.5 μL接在直徑9 cm的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)觀察。每個菌株使用3種培養(yǎng)基培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基3個重復。放置在光照16 h∶黑暗 8 h，溫度為25 ℃的恒溫箱內培養(yǎng)。在菌落長出后每天下午16：00用十字交叉法測量菌落的直徑，連續(xù)測量15 d，觀察菌株的生長形態(tài)并拍照。在第15天測定菌株的產孢量。

光學顯微鏡標本的制作：在載玻片上滴一滴無菌水，用接種針挑取一定的菌苔，蓋上蓋玻片，反置在顯微鏡下進行觀察。

分子鑒定：結合LIU等[13]的方法提取菌株的DNA。選用通用引物ITS-4（5′-TCCTCCGCTTAA AG-ATATGC-3′）和ITS-5（5′GGAAGTAAAAGTC-G TAACAAGG-3′），引物由安徽通用生物系統有限公司合成。PCR擴增的反應體系為25 μL，反應組分為：2×Es Taq MasterMix （Dye） 12.5 μL，10 μmol/L的上游引物 0.5 μL，10 μmol/L的下游引物0.5 μL， 模板DNA提取液0.5 μL，ddH2O 11 μL。混合液在PCR儀上進行擴增，反應程序為：94 ℃預變性2 min， 進入循環(huán)，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸18 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸2 min，25 ℃保溫5 min。取5 μL擴增產物于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色后，于紫外燈下觀察，并于凝膠成像系統上檢測。利用引物ITS-4對PCR產物進行直接測序，測序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。將測序結果與NCBI中的GenBank基因數據庫的菌株序列進行對比[14]。根據測序序列，利用Mega 7.0.26軟件構建系統發(fā)育樹。

1.6 對煙蚜致病力測定

采用微量點滴法。將分生孢子配制成濃度約為 1.0×107孢子/mL的孢子懸液。挑選長勢一致、健康的無翅煙蚜，用50 μL注射器滴在煙蚜前胸及背面，每種菌株3次重復，每個重復20頭煙蚜，同時以0.05%吐溫-80做對照。將處理后的煙蚜放在用濾紙鋪底保濕具新鮮煙葉的培養(yǎng)皿（直徑為9 cm）中，用保鮮膜封口并用針扎孔通氣，做好標記，放在常溫下培養(yǎng)觀察。每24小時觀察一次存活情況，記錄死亡數，觀察期間適量加蒸餾水保濕。煙蚜的死亡判斷以毛筆觸足和觸角完全不動為標準，以后期長出菌絲為有效死亡。

1.7 數據分析

用Abbott公式計算校正死亡率：

數據分析采用DPS數據處理系統軟件完成，用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結 果

2.1 八株菌株產孢量及在3種培養(yǎng)基上的生長速率

由表1看出，8株菌株在PDA培養(yǎng)基上第15天的產孢量間有極顯著差異（F=521.40，P=0.00；n1=7， n2=17），產孢量的高低分別是：菌株V4產孢量最高，為1.89×109個/皿，與其他菌株的產孢量呈現極顯著差異。產孢速率快慢為：菌株V4>V7>V2> V5>V3>V6>V1>V8，菌株V8產孢量最小，為1.08×107個/皿。除了菌株V1、V8，其他6個菌株間存在顯著差異（p<0.05）。

由表2看出，8株菌株在PDA、SDAY、L-broth 3種培養(yǎng)基上均能迅速生長，其中菌落在SDAY（F=31.80， P=0.00；n1=7， n2=16）、L-broth（F=30.40， P<0.01；n1=7， n2=16）培養(yǎng)基上生長較快，在PDA（F=39.30， P=0.00；n1=7， n2=16）培養(yǎng)基上生長較慢。在第15天中，V3、V7在3種培養(yǎng)基中生長的菌落直徑呈現極顯著差異，菌落V3（F=412.00，P<0.01；n1=2， n2=5）在3種培養(yǎng)基上的生長速率為L-broth>SDAY>PDA；菌株V7（F=133.60，P=0.0013；n1=2， n2=5）在3種培養(yǎng)基上的生長速率為L-broth﹥SDAY﹥PDA；菌株V2在3種培養(yǎng)基上的生長速率無明顯差異。菌株V1、V5、V6在SDAY、L-broth和PDA培養(yǎng)基中的生長速率呈現極顯著差異，在3種培養(yǎng)基上生長速率為SDAY、L-broth>PDA；菌株V1、V4、V6、V8在SDAY培養(yǎng)基上生長速率較快，菌株V2、V3、V5、V7在L-broth培養(yǎng)基上生長速率較快。

2.2 八株菌株在3種培養(yǎng)基上的生長形態(tài)

八株菌株在L-broth、SDAY、PDA 3種培養(yǎng)基上的形態(tài)存在相似性。相同點為8株菌落正面均為白色，具同心輪紋。不同點為8株菌株的同心輪紋形狀各不相同，菌株V8菌落與其他7個菌株有明顯的區(qū)別，V8菌落呈絮狀且凸起，背面呈紅色，菌株V1到菌株V7的菌落均不凸起，呈微粉狀，背面呈白色（圖1、2、3）。

2.3 光學顯微鏡下八種菌株的形態(tài)

八株菌株的分生孢子均是透明的，表面光滑，孢子呈柱狀，末端圓而對稱，幾乎為單胞，少見雙胞（圖4）。

2.4 測序結果

菌株V1、V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8的核糖體DNA-ITS長度分別為614、563、572、576、577、553、571和578 bp（圖5）。

將序列提交到NCBI GenBank數據庫，經Blast比對鑒定為蠟蚧輪枝菌（ Verticillium lecanii ），得到同源性最高的蠟蚧輪枝菌ITS序列登記號分別為NR_111101.1、KU612379.1、KU612378.1、KJ160143.1、LC035041.1、JQ901939.1、AB378513.1、AB160994.1。

利用8株菌株序列在NCBI的GenBank庫進行比對并下載相應菌株的ITS序列，一并用MEGA7.0.26軟件的Alignment程序進行多重對位排列，通過系統發(fā)育分析構建出系統進化樹。經鑒定這8株菌株均為蠟蚧輪枝菌屬（Lecanicillium），其中菌株V3與Torrubiella在進化關系上極為密切，可能為有性態(tài)[15]（圖6）。

2.5 八株菌株對煙蚜的致病性

將8株菌株都配制成1.0×107孢子/mL的孢子懸液進行接種，生物學測定結果表明（表3），空白對照的成蟲在第7天的平均累計自然死亡率為6.67%。各菌株處理在第7天的累計校正死亡率為33.37%～ 84.99%。不同菌株間差異顯著（F=7.54，P<0.01；n1=7， n2=17）。其中，煙蚜校正累計死亡率最低的菌株為V7，為33.37%，最高的為菌株V4，達到84.99%。

LT50可反映出菌株對目標害蟲的致病力，LT50越短致病力越強。8株菌株中有6株菌株的LT50<10 d，其中表現出對煙蚜較強毒力的2株菌株V4、V6的LT50<7 d，V4最短，為4.51 d（95% CI：3.82～5.78）；LT50>10 d的菌株有2個（V3、V7），表明它對煙蚜的致病性較差。

3 討 論

本研究從貴州煙田里采集的自然罹病煙蚜通過分離純化出真菌后，經過形態(tài)鑒定、分子鑒定為8株蠟蚧輪枝菌，由毒力測定表明這些菌株對煙蚜具有致病性，并篩選出一株對煙蚜具有高毒力的菌株。這與蠟蚧輪枝菌作為寄主種類繁多的昆蟲病原真菌并且對蚜類[16-18]具有防治效果這些報道一致。

不同培養(yǎng)基是影響真菌生長和產孢量的重要原因，有研究表明蟲生真菌可以在多種營養(yǎng)條件下生長，但是適宜的營養(yǎng)條件不僅可以促進生長還能增強菌株的殺蟲活性。GAO等[19]研究表明當培養(yǎng)基中添加酵母浸出粉作為氮源時，有利于菌株的菌絲生長和孢子的產孢。劉春來等[20]發(fā)現葡萄糖跟酵母浸出粉是有利于蠟蚧輪枝菌生長的碳源、氮源。在本研究中，蠟蚧輪枝菌在SDAY、L-broth 培養(yǎng)基上的生長速度明顯快于PDA培養(yǎng)基，這與已有報道相符。VARELA等[21]研究白僵菌對咖啡蛀蟲的防治試驗表明，孢子萌發(fā)率越高和菌絲生長速度越快的菌株對咖啡蛀蟲的毒力較強。李茂業(yè)等[22]研究表明綠僵菌菌絲生長快，產孢量大，對褐飛虱的毒力強。本試驗中菌株V4的生長速度、產孢量均明顯優(yōu)于其他7株菌株，其對煙蚜的毒力也較強。

LATCH[23]和POPRAWSKI等[24]認為高毒力的真菌菌株分離于原寄主或原寄主的親緣種僵蟲。李國霞[25]從白粉虱蟲體上分離出11個菌株，生物測定出4號菌株對白粉虱的致病性最強。林華峰[26]從田間褐飛虱罹病蟲體分離的一株綠僵菌對褐飛虱的室內致死率達84%以上。本實驗從自然罹病煙蚜上分離出8株蠟蚧輪枝菌，菌株V4對煙蚜的校正累計死亡率達到84.99%。但是這些菌株之間是否有協同增效作用還需要進一步研究。

4 結 論

從貴州煙田采集的自然罹病蚜蟲上分離出了8株菌株，在L-broth、SDAY、PDA 3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察它們的生物學特性，通過系統鑒定后確定皆為蠟蚧輪枝菌。對煙蚜進行室內生物學培養(yǎng)和毒力測定實驗發(fā)現，菌株V4的產孢量最高，生長速率最快，致病性最強，具有進一步開發(fā)對煙蚜田間防治或者其他農業(yè)害蟲生物防治的潛力。

參考文獻

[1] 楊普云. 農藥環(huán)境影響指數（EIQ）在農作物病蟲害防治工作中的應用[J]. 植物保護，2008，34（3）：136-139.

YANG P Y. Application of pesticide environmental impact quotient（EIQ）to corp pest management[J]. Plant Protection， 2008， 34（3）： 136-139.

[2] GURR G M， YOU M S. Conservation biological control of pests in the molecular Era： new opportunities to address old constraints[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 12（6）： 1-9.

[3] 李增智，樊美珍. 真菌生物技術與真菌殺蟲劑的發(fā)展（微生物農藥及其產業(yè)化）[M]. 北京：科技出版社，2002：115-121.

LI Z Z， FAN M Z. Fungal biotechnology and the development of fungal insecticides（Microbial pesticides and industrialization）[M]. Bejing： Science and Technology Press， 2002： 115-121.

[4] GILLESPIE A T， CLAYDON N. The use of entomogenous fungi for pest control and the role of toxins in pathogenesis[J]. Pesticide Science， 1989， 27： 203-215.

[5] HAJEK A E. Ecology of terrestrial fungal entomopathogens[J]. Advances in Microbial Ecology， 1997， 15： 193-249.

[6] TSENG M N， CHUNG P C， TZEAN S S. Enhancing the stress tolerance and virulence of an entomopathogen by metabolic engineering of dihydroxynaphthalene melanin biosynthesis genes[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2011， 77： 4508-4519.

[7] NICOLAI V M， EILENBERG J. Ecology of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae in temperate agroecosystems： potential for conservation biological control[J]. Biological Control， 2007， 43： 145-155.

[8] 王清海，萬平平，黃玉杰，等. 蟲生真菌在害蟲生物防治中的應用研究[J]. 山東科學，2005，18（4）：37-39.

WANG Q H， WAN P P， HUANG Y J， et al. Application of entomogenous fungus in biocontrol of pest[J]. Shandong Science， 2005， 18（4）： 37-39.

[9]FARIA M R， WRAIGHT S P. Mycoinsecticides and Mycoacaricides： A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types[J]. Biological Control， 2007， 43： 237-256.

[10]ZHANG L W， LIU Y J， YAO J， et al. Evaluation of Beauveria bassiana （Hyphomycetes） isolates as potential agents for control of Dendroctonus valens[J]. Insect Science， 2011， 18： 209-216.

[11]張松影，林華峰，李茂業(yè)，等. 幾種蟲生真菌菌株的培養(yǎng)性狀及其對褐飛虱的毒力[J]. 應用昆蟲學報，2011，48（5）：1407-1411.

ZHANG S Y， LIN H F， LI M Y， et al. Culturing characteristics of entomogenous fungi strains and their virulence to Nilaparvata lugens[J]. Chinese Journal of Applied Entomology， 2011， 48（5）： 1407-1411.

[12]孔瓊，袁盛勇，張宏瑞，等. 蠟蚧輪枝菌對月季長管蚜的毒力測定[J]. 植物保護，2009，35（3）：161-162.

KONG Q， YUAN S Y， ZHANG H R， et al. Virulence of Verticillium lecanii viegas to Macrosiphum rosivorum Zhang in laboratory[J]. Plant Protection， 2009， 35（3）： 161-162.

[13] LIU D， COLOS S， BAIRD R， et al. Rapid mini-preparation of fungal DNA for PCR[J]. Journal of clinical microbiology， 2000， 38（1）： 471.

[14] 高崇，吳國賀，李柏霖，等. 延邊煙區(qū)煙草菌核病病原菌鑒定及抗性種質篩選[J]. 中國煙草科學，2018，39（2）：69-74.

GAO C， WU G H， LI B L， et al. Identification of tobacco Sclerotinia Rot in Yanbian and screening for resistant germplasms[J]. Chinese Tobacco Science， 2018， 39（2）： 69-74.

[15] 黃云，徐志宏. 園藝植物保護學[M]. 北京：中國農業(yè)出版社，2015.

HUANG Y， XU Z H. Horticultural plant conservation[M]. Beijing： China Agriculture Press， 2015.

[16] GHAFFARI S，KARIMI J，KAMALI S，et al. Biocontrol of Planococcus citri （Hemiptera： Pseudococcidae） by Lecanicillium longisporum and Lecanicillium lecanii under laboratory and greenhouse conditions[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2017， 20： 605-612.

[17] MARCOS R D F， STEPHON P W. Mycoinsecticides and mycoacaricides： a comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types[J]. Biological Control， 2007， 43： 237-256.

[18] SKINNER M， PARKER B L， BERGDAHL D R. Verticillium lecanii， isolated from larvae of pear thrips， Taeniothrips inconsequens， in Vermont [J]. Journal of Invertebrate Pathology， 1991， 58： 157-163.

[19] GAO L， SUN M H， LIU X Z， et al. Effects of carbon concentration and carbon to nitrogen ratio on the growth and sporulation of several biocontrol fungi[J]. Mycological Research， 2007， 111（1）： 87-92.

[20] 劉春來，王爽，李新明，等. 蠟蚧輪枝菌的碳?氮營養(yǎng)源研究[J]. 安徽農業(yè)科學，2013，41（32）：12595-12596. LIU C L， WANG S， LI X M， et al. Research on carbon nitrogen sources of Verticillium lecanii cultured on solid matrix[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2013， 41（32）： 12595-12596.

[21] VARELA A， MORALES E. Characterization on of some Beauveria Bassiana isolates and their virulence toward the coffee berry borer Hypothenemus hampei[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 1996， 64： 147-152.

[22] 李茂業(yè)，林華峰，李世廣，等. 褐飛虱高毒力綠僵菌菌株的篩選[J]. 菌物學報，2012，31（3）：331-340.

LI M Y， LIN H F， LI S G， et al. Screening of high virulent strain of Metarhizium spp. against the brown planthopper， Nilaparvata lugens[J]. Mycosystema， 2012， 31（3）： 331-340.

[23]LATCH GCM. Studies on the susceptibility of Orycetes rhinoceros to some entomogenous fungi[J]. Entomophaga， 1976， 21： 31-38.

[24] POPRAWSKI T J， MARCHAL M， ROBERT P H. Comparative susceptibility of Otiorhynchus sulcatus and Sitona lineatus （Coleoptera Curculionidae） early stage to five entomopathogenic hyphomycetes[J]. Environment Entomology， 1985， 14： 247-253.

[25] 李國霞，嚴毓華，王麗英. 蠟蚧輪枝菌11個單孢菌株的生物學及其對溫室白粉虱致病性的比較和篩選[J]. 中國農業(yè)大學學報，1996，1（1）：83-88.

LI G X， YAN Y H， WANG L Y. The biology of eleven Verticillium lecanii isolates cultured with monospores and the comparison and selection of their pathogenicity against Trialeurodes vaporariorum[J]. Journal of China Agricultural University， 1996， 1（1）： 83-88.

[26] 林華峰，李茂業(yè)，張松影，等. 一種褐飛虱病原真菌的分子生物學鑒定[J]. 應用昆蟲學報，2011，48（5）：1401-1406.

LIN H F， LI M Y， ZHANG S Y， et al. Molecular biological identification of entomogenous fungi isolated from the brown planthopper[J]. Chinese Journal of Applied Entomology， 2011， 48（5）： 1401-1406.