施河麗 孫立廣 譚軍 趙秀云 王瑞

摘 要：煙草青枯病是一種危害嚴(yán)重的土傳性病害，為了防治煙草青枯病，篩選了3株拮抗青枯雷爾氏菌的芽孢桿菌（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌JK3、枯草芽孢桿菌JK4和解淀粉芽孢桿菌JK10），將其發(fā)酵液添加到有機(jī)肥中，經(jīng)二次發(fā)酵后獲得生物有機(jī)肥（SF2、SF4），施入煙田。結(jié)果表明，生物有機(jī)肥能較好地防治煙草青枯病，同時(shí)促進(jìn)煙株的生長(zhǎng)，SF2、SF4處理的防效分別為82.18%、68.82%。同時(shí)，采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)生物有機(jī)肥顯著影響了土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了土壤中有益菌（如鞘氨醇單胞菌屬、類芽孢桿菌屬、耐熱芽孢桿菌、梭菌屬等）的增殖。芽孢桿菌和鏈霉菌的數(shù)量也明顯增加，推測(cè)鏈霉菌和芽孢桿菌可抑制青枯雷爾氏菌的繁殖，進(jìn)而控制煙草青枯病的發(fā)生。施用添加拮抗芽孢桿菌的生物有機(jī)肥是防治煙草青枯病的一項(xiàng)有效措施。

關(guān)鍵詞：青枯雷爾氏菌；生物有機(jī)肥；芽孢桿菌；土壤細(xì)菌群落；高通量測(cè)序

中圖分類號(hào)：S435.72 文章編號(hào)：1007-5119（2018）02-0054-09 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.02.008

Control Efficiency of Bio-organic Fertilizers on Tobacco Bacterial Wilt and Their Effects on Soil Bacterial Community

SHI Heli1， SUN Liguang2， TAN Jun1， ZHAO Xiuyun2， WANG Rui1*

（1. Enshi Tobacco Company of Hubei Province， Enshi， Hubei 445000， China； 2. College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： Tobacco bacterial wilt is a severe soil-borne disease. In order to control tobacco bacterial wilt， we isolated and selected Bacillus methylotrophicus strain JK3， B. subtilis strain JK4， and B. amyloliquefaciens strain JK10 which exhibited strong antibacterial activity against Ralstonia solanacearum. Fermentation solutions of these three antagonistic strains were added to organic fertilizers to make bio-organic fertilizers （SF2， SF4）. Bio-organic fertilizers were applied to the field to control bacterial wilt. The results showed that after application of bio-organic fertilizers tobacco bacterial wilt was effectively controlled. The control efficiency of SF2 and SF4 treatments were 82.18% and 68.82%， respectively. We analyzed the soil bacterial community through high-throughput sequencing technology. It was found that the soil bacterial community changed dramatically after application of bio-organic fertilizers. Compared to the control， the abundance of beneficial bacteria including Sphingomonas spp.， Paenibacillus spp.， Thermobacillus spp.， and Clostridium spp. significantly increased in the SF2 and SF4 treated soils. Abundance of Streptomyces spp. and Bacillus spp. also increased noticeably after the application of bio-organic fertilizers. Streptomyces spp. and Bacillus spp. might inhibit the growth of R. solanacearum. Our results indicated that bio-organic fertilizers added with antagonistic Bacillus spp. could effectively control tobacco bacterial wilt.

Keywords： Ralstonia solanacearum； bio-organic fertilizers； Bacillus； soil bacterial community； high-throughput sequencing

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）感染引起的毀滅性煙草病害。青枯雷爾氏菌是一種土傳病原細(xì)菌，致病力強(qiáng)，寄主范圍廣，分布廣泛。人們采用多種拮抗菌如芽孢桿菌、放線菌、假單胞菌等來防治青枯病[1-2]，但由于這些拮抗菌施入土壤中后，不能很好地在土壤中定殖，造成其防效不穩(wěn)定。此外，有機(jī)肥被廣泛用于控制土傳病害[3]，研究表明，土壤中添加有機(jī)肥后，青枯雷爾氏菌的數(shù)量顯著降低[4]。由此，人們嘗試將有機(jī)肥與拮抗菌兩者相結(jié)合研制具有抗病性的生

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司科技重點(diǎn)項(xiàng)目“基于宏基因組學(xué)的植煙土壤健康評(píng)價(jià)研究與應(yīng)用”（110201402016）

作者簡(jiǎn)介：施河麗（1984-），女，碩士，研究方向?yàn)闊煵菰耘嗯c微生物工程。E-mail：154518720@qq.com。*通信作者，E-mail：100689575@qq.com

收稿日期：2017-10-23 修回日期：2018-01-04

物有機(jī)肥，拮抗菌在有機(jī)肥中大量繁殖，并以有機(jī)肥為載體，施用于田間后，能更好地抑制病原菌的繁殖，從而達(dá)到控制土傳病害的目的。

目前，生物有機(jī)肥施入土壤后，對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響也是一個(gè)研究熱點(diǎn)。土壤微生物在土壤有機(jī)質(zhì)的降解、土壤養(yǎng)分（C、N、P、S）的循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，對(duì)植物的健康生長(zhǎng)至關(guān)重要[5]。人們對(duì)土壤微生物的了解主要通過純培養(yǎng)土壤微生物，并進(jìn)行鑒定分析。然而，能夠通過純培養(yǎng)獲得的微生物只占土壤微生物的1%，絕大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)的[6]。而基于高通量測(cè)序技術(shù)的宏基因組學(xué)是一項(xiàng)嶄新的研究土壤微生物的技術(shù)[7]，能夠更加深入全面地研究各種農(nóng)業(yè)措施對(duì)土壤微生物的影響[8-9]。

本研究篩選了3株拮抗青枯雷爾氏菌的芽孢桿菌（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌JK3、枯草芽孢桿菌JK4、解淀粉芽孢桿菌JK10），添加至有機(jī)肥后配制成抗病的生物有機(jī)肥，用于控制煙草青枯病。此外，為了研究生物有機(jī)肥施入田間后對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響及其作用機(jī)制，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[10]，研究施用生物有機(jī)肥后土壤細(xì)菌種群和豐度的改變，對(duì)深入了解生物有機(jī)肥的作用機(jī)制有著重要意義，也為煙草青枯病的生物防治提供一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

前期研究中，從湖北省恩施州健康煙株的根際土壤中分離篩選了對(duì)青枯雷爾氏菌具有較強(qiáng)抑菌活性的3個(gè)芽孢桿菌菌株：甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）JK3、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）JK4、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）JK10，保存于實(shí)驗(yàn)室，備用。

1.2 拮抗芽孢桿菌在有機(jī)肥中的定殖

分析3株芽孢桿菌在不同種類的有機(jī)肥中的定殖率。按組成成分分別配制5種不同有機(jī)肥A、B、C、D、E，121 ℃高壓滅菌30 min。分別接種JK3、JK4、JK10的單菌落至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃，210 r/min震蕩培養(yǎng)48 h，通過稀釋涂布，測(cè)發(fā)酵液的含菌量。將3株拮抗菌發(fā)酵液分別按1/10（V/m）的接種量混合加入到滅菌的100 g有機(jī)肥中（放于500 mL三角瓶），含水量為60%，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，每天手動(dòng)搖翻、混勻。7 d后，取發(fā)酵后的有機(jī)肥10 g，溶于90 mL無菌水中，系列梯度稀釋，稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)2～3 d后，計(jì)算單菌落數(shù)量。拮抗菌在有機(jī)肥中的增殖率計(jì)算方法為：（有機(jī)肥中的含菌量/發(fā)酵液的含菌量）×100%。

1.3 生物有機(jī)肥的二次固體發(fā)酵

選擇芽孢桿菌定殖率高的2種有機(jī)肥（有機(jī)肥C、有機(jī)肥D），進(jìn)行二次固體發(fā)酵，獲得抗青枯病的生物有機(jī)肥。

將JK3、JK4、JK10菌株分別用發(fā)酵培養(yǎng)基（1.2%豆粕粉，0.2% NH4NO3，0.2% Na2HPO4，1.5%淀粉），于210 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，通過稀釋涂布，測(cè)發(fā)酵液的含菌量。將發(fā)酵液中菌體濃度調(diào)整到1×109 CFU/mL，分別按照1/10（V/m）的接種量添加至有機(jī)肥C或有機(jī)肥D中進(jìn)行二次固體發(fā)酵，室溫固體發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵堆肥的中心溫度接近45 ℃時(shí)，進(jìn)行翻堆，發(fā)酵7 d。最后將含單株拮抗菌的3種有機(jī)肥按1∶1∶1的體積進(jìn)行混合，并后熟2～3 d，后熟過程中翻堆2次。攤開使有機(jī)肥中水分揮發(fā)，控制生物有機(jī)肥的含水量為30%左右。經(jīng)測(cè)定，生物有機(jī)肥C的養(yǎng)分含量為：45.86%有機(jī)質(zhì)，1.96% N，1.43% P2O5，3.38% K2O。生物有機(jī)肥D的養(yǎng)分含量為：43.34%有機(jī)質(zhì)，2.33% N，2.75% P2O5，6.79% K2O。將配制好的生物有機(jī)肥在室溫下保存4個(gè)月后，經(jīng)稀釋涂布測(cè)定芽孢桿菌含量。

1.4 生物有機(jī)肥防治煙草青枯病效果田間試驗(yàn)

試驗(yàn)田位于湖北省宣恩縣椒園鎮(zhèn)涼風(fēng)村，為煙草青枯病發(fā)病嚴(yán)重地塊（前季發(fā)病率為42%）。設(shè)置4個(gè)處理：處理SF2，生物有機(jī)肥C；處理SF4，生物有機(jī)肥D；處理SF7，不添加拮抗菌JK3、JK4、JK10的有機(jī)肥C，做為有機(jī)肥對(duì)照；處理SF8，化肥[m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶1.5∶2.5]，施氮量

為97.5 kg/hm2。SF2、SF4和SF7處理均按200 g/株將有機(jī)肥做為基肥，在移栽前穴施到煙株根際周圍，與SF8處理的N、P、K差量均用化學(xué)肥料補(bǔ)齊。每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)種植60株煙苗。

移栽后2個(gè)月，測(cè)量和調(diào)查各處理中煙株的莖圍、株高、青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)。病情指數(shù)（DI）和防治效果（BE）按照下列公式計(jì)算[11]：

DI=[Σ（該病級(jí)株數(shù)×病級(jí)指數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)指數(shù)）]×100

防治效果=[（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)]×100%

1.5 土壤樣品的采集和DNA提取

分別在移栽后0、60、120 d，通過五點(diǎn)采樣法采集煙草根際土壤（采樣深度為0～15 cm），將土樣混勻后保存在?80 ℃。采用FastDNATM SPIN kit （MP Biomedicals， Santa Ana， CA）試劑盒提取土壤微生物基因組DNA。利用正向引物338F（5'-ACTCCT ACGGGAGGCAGCA-3'）和反向引物806R（5'-GGA CTACHVGGGTWTCTA AT-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)。PCR反應(yīng)體系為：0.4 ?L FastPfupolymerase，4 ?L 5×Fastpfu buffer，0.8 ?L 338F primer （5 ?M），0.8 ?L 806R primer （5 ?M），10 ng土壤微生物DNA模板，加ddH2O至總體積為20 ?L。反應(yīng)條件為：95 ℃ 變性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s進(jìn)行27次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用Agencourt? AMPure XP Beads（Beckman， Brea， CA）進(jìn)行純化。擴(kuò)增產(chǎn)物用于構(gòu)建文庫(kù)，文庫(kù)采用MiSeq sequencer （Illumina）

測(cè)序儀，在上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

1.6 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

原始數(shù)據(jù)采用FASTX Toolkit 0.0.13軟件包進(jìn)行分揀，去除Q20<50%的片段、末端低質(zhì)量的堿基（Q20值<20），并去除長(zhǎng)度小于35 bp的片段。有效reads進(jìn)行以下分析：

OTU（Operational Taxonomic Units）聚類和細(xì)菌豐度分析：將序列進(jìn)行聚類，高相似性（97%）的序列歸為同一類，即為一個(gè)OTU[12]。OTU的產(chǎn)生采用mothur軟件生成，序列與已知數(shù)據(jù)庫(kù)GreenGene[13]，Silva[14]進(jìn)行比對(duì)分析。計(jì)算其距離，并進(jìn)行OTU聚類。微生物種類的劃分采用RDP training set （V9） database數(shù)據(jù)庫(kù)[15]。選擇50個(gè)豐度最高的OTUs用來構(gòu)建Heatmap圖。

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性分析：根據(jù)OTU組成和豐度，樣品間相似性用thetayc algorithm進(jìn)行計(jì)算，構(gòu)建樣品的相似聚類圖。進(jìn)行PCoA分析，確定不同樣品間相似性和差異性。如果樣品點(diǎn)間的距離越近，說明兩個(gè)樣品間相似度越高。

2 結(jié) 果

2.1 拮抗菌在不同有機(jī)肥的定殖效果

3株拮抗芽孢桿菌在5種不同有機(jī)肥中的定殖情況如表1所示。從表1可以看出，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌JK-3菌株在5種有機(jī)肥中定殖效果最好，含菌量和增殖率都明顯高于枯草芽孢桿菌JK-4和解淀粉芽孢桿菌JK-10菌株，說明甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌JK-3可利用有機(jī)肥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行大量繁

表1 3株拮抗菌在5種有機(jī)肥中定殖率

Table 1 Colonization rate of three antagonistic strains in five organic fertilizers

拮抗菌

Antagonistic strains 有機(jī)肥A

Organic fertilizer A 有機(jī)肥B

Organic fertilizer B 有機(jī)肥C

Organic fertilizer C 有機(jī)肥D

Organic fertilizer D 有機(jī)肥E

Organic fertilizer E 發(fā)酵液

Fermentation broth

JK-10 含菌量/（1011