黃玉茜，楊勁峰，梁春浩，陳堔平一，劉欣宇，耿坷睿，姚玉晨，張宇，韓曉日

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香草酸對花生種子萌發(fā)、幼苗生長及根際微生物區(qū)系的影響

黃玉茜1，楊勁峰1，梁春浩2，陳堔平一1，劉欣宇1，耿坷睿1，姚玉晨1，張宇1，韓曉日1

（1沈陽農業(yè)大學土地與環(huán)境學院，沈陽 110866；2遼寧省農業(yè)科學院植物保護研究所，沈陽 110161）

【目的】探討酚酸類自毒物質香草酸的自毒作用，研究其對花生種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，揭示根際土壤微生物在花生生育期內對自毒物質的響應規(guī)律?！痉椒ā恳曰ㄉ贩N阜花12號150GY為試材，培養(yǎng)皿培養(yǎng)試驗設6個處理：0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mmol?L-1香草酸溶液；營養(yǎng)缽種植試驗設5個處理：0、0.01、0.03、0.05、0.07 mmol?L-1香草酸溶液；盆栽試驗設5個處理：香草酸用量分別為0、0.01、0.03、0.05、0.07 mg?kg-1干土。分別研究外源添加香草酸對花生種子萌發(fā)、幼苗生長及根際微生物區(qū)系的影響?！窘Y果】（1）經不同濃度香草酸溶液處理后，花生種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均低于CK，與對照存在顯著性差異。當香草酸溶液濃度為0.09 mmol?L-1時，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)與對CK相比分別降低39%、66.3%和55.9%，自毒效應響應指數(shù)達到最大值。（2）經不同濃度香草酸溶液處理后，花生幼苗的主根長、單株干重、葉綠素含量、凈光合速率和氣孔導度均低于CK，與對照存在顯著性差異，當香草酸溶液濃度為0.07 mmol?L-1時，各指標與對CK相比分別降低37.3%、40.0%、19.0%、53.9%和49.1%，自毒效應響應指數(shù)達到最大值。胞間CO2濃度變化趨勢與以上指標相反，隨香草酸濃度的增大而呈現(xiàn)上升趨勢，當香草酸溶液濃度為0.07 mmol?L-1時，胞間CO2濃度比對照提高46.1%。（3）香草酸濃度≥0.03 mmol?L-1時，花生根系總吸收面積、活躍吸收面積和根系活力（活躍吸收面積/總吸收面積）低于CK，葉片的MDA含量高于對照，均與對照存在顯著性差異，當香草酸溶液濃度為0.07 mmol?L-1時，各指標與對照相比分別降低22.4%，54.2%和40.6%，MDA含量提高43.3%。（4）根際放線菌數(shù)量在花生生育前期隨著香草酸濃度的增大而顯著降低，進入結莢期后各處理間差異不顯著。根際細菌數(shù)量在花生生育前期時各處理間差異不顯著，而進入結莢期后隨著香草酸濃度的增大而顯著降低。高濃度的香草酸（0.07 mg?kg-1干土）對根際真菌生長具有抑制作用，而低濃度的香草酸（0.01 mg?kg-1干土）對根際真菌生長具有促進作用?！窘Y論】香草酸對花生種子萌發(fā)和幼苗生長存在一定的抑制作用，香草酸亦會抑制花生幼苗的光合作用，降低根系活力，促進幼苗葉片產生丙二醛。此外，不同濃度的香草酸溶液均會使花生根際細菌和放線菌的數(shù)量降低，抑制根際土壤中細菌和放線菌的生長繁殖，而對土壤真菌的影響呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象，即低濃度的香草酸溶液促進花生根際土壤中真菌的生長；而高濃度則對真菌生長具有一定的抑制作用。

香草酸；花生；自毒物質；光合特性；根系活力；微生物區(qū)系

0 引言

【研究意義】中國是最大的花生生產國，總產量達到1 470.79×104t，占世界總產量的40.8%，位居世界第1位[1]。但由于中國人多地少，且過度追求較高的種植效益，導致花生重茬連作現(xiàn)象嚴重。近年來，在中國花生主產區(qū)，花生連作重茬減產嚴重，連作的年限越長，減產的幅度就越大[2-3]。連作障礙已成為一個廣泛存在、危害嚴重的生產性問題?！厩叭搜芯窟M展】連作障礙現(xiàn)象在作物中普遍存在，現(xiàn)有的眾多研究結果表明，土壤理化性質惡化、土壤生物學環(huán)境惡化和作物的自毒作用是導致連作障礙的三大因素[4-5]。但由于這些因素之間存在著錯綜復雜的關系，至今仍未從根本上闡明連作障礙的產生機理。而越來越多的研究顯示出，在農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，作物本身的自毒作用是導致連作障礙的重要因素，并成為備受重視的研究熱點。水稻、大豆、小麥、黃瓜、蘆筍、蘋果、西洋參等[6-13]植物的根系分泌物和腐解物中鑒定出許多自毒物質。自毒物質能促進土壤病菌的生長，影響作物種子的發(fā)芽，根系的吸收能力和細胞膜透性，從而加重連作障礙?？梢?，植物自身產生自毒物質現(xiàn)象普遍，且自毒物質作用廣泛，毒害持久，深入研究自毒作用機理對闡明連作障礙的成因至關重要。劉蘋等[14-16]首次采用連續(xù)收集法提取到花生植株的根系分泌物，并通過研究證明花生根系能釋放化感物質對花生的生長發(fā)育產生自毒作用，且這些化感物質主要通過抑制胚根的生長、損傷細胞膜的結構來抑制花生植株的生長。其進一步對花生根系分泌物的中性組分進行研究，鑒定出2, 4-二甲基苯甲醛、月桂酸、豆蔻酸、軟酯酸、油酸和硬酯酸等6種主要成分，但其僅就根系分泌物的堿性、酸性及中性成分對根腐鐮刀菌及固氮菌的影響進行了研究，沒有確定其對花生的自毒作用，也并未對根系分泌物的堿性和酸性組分進行鑒定，其后對鄰苯二甲酸、對羥基苯甲酸和苯甲酸以及3種酚酸類物質的混合物分析發(fā)現(xiàn)，在較高添加濃度時對花生種子發(fā)芽和炭疽病菌均產生了抑制作用，對固氮菌的生長表現(xiàn)為低促高抑，且3種酚酸類物質兩兩互作時對花生種子發(fā)芽的影響增強。李培棟等[17]研究了南方紅壤區(qū)不同連作年限花生土壤中酚酸物質的種類、含量，及其對花生生長的影響。研究結果表明，連作花生土壤中存在3種酚酸類物質，分別為對羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸，且這3種酚酸物質均隨著連作年限的增加而呈現(xiàn)累積的趨勢，并可以抑制花生幼苗的生長和提高花生的發(fā)病率?！颈狙芯壳腥朦c】筆者前期研究發(fā)現(xiàn)花生根系分泌物的自毒作用與花生連作障礙有著密切關系，在根際土壤水浸液中鑒定出4種酚酸類物質，分別為對羥基苯甲酸、香草酸、香豆酸和香豆素，其中香草酸和香豆素含量較高且變化規(guī)律性明顯，在土壤中的含量隨連作年限的增加而呈累積上升趨勢[18]，但并沒有對這些酚酸類物質進行系統(tǒng)的化感自毒效應研究?！緮M解決的關鍵問題】因此，本試驗通過對4種酚酸類物質進行初篩后選用香草酸處理花生種子及幼苗，研究其對花生種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。此外，通過盆栽試驗研究添加不同濃度香草酸后，花生根際微生物區(qū)系的變化，旨在說明土壤中微生物的數(shù)量變化特點，揭示根際土壤微生物在花生生育期內對自毒物質的響應變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花生品種為阜花12號150GY，該品種屬連續(xù)開花亞種小粒珍珠豆型，抗旱、抗倒、耐瘠、適應性廣，生育期125—128 d，較適宜遼西北風沙半干旱地區(qū)栽培。自毒物質香草酸（vanillic acid）為分析純，購于sigma公司。真菌培養(yǎng)采用馬丁氏培養(yǎng)基，細菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基[19]。

1.2 試驗設計

本研究設計3個試驗。

1.2.1 香草酸對花生種子萌發(fā)影響的試驗 共設6個處理，分別不施加香草酸（CK），施加香草酸的濃度分別為0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mmol?L-1，分別記作M1、M2、M3、M4、M5。挑選大小相當?shù)幕ㄉN子6粒放于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿（9 cm）中，分別加入不同濃度的香草酸溶液 2 mL培養(yǎng)，對照加無菌水。每個處理3次重復，每重復3個培養(yǎng)皿。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d（2015年4月2—9日），設定溫度25℃，定期補充無菌水，每天觀察發(fā)芽情況，調查種子發(fā)芽數(shù)，當胚根突破種皮，長度為種長一半時計為發(fā)芽種子。6 d后測定發(fā)芽勢、8 d后測定發(fā)芽率、根長，計算發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率（%）=（發(fā)芽終期全部正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100% ；

發(fā)芽勢（%）=（6 d內發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)）×100%；

發(fā)芽指數(shù) = ∑(Gt/Dt)

式中，Gt為逐日發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應發(fā)芽天數(shù)。

1.2.2 香草酸對花生幼苗生長影響試驗

（1）試驗方法 將300 g無菌沙子混少量珍珠巖后裝入大小相當?shù)臓I養(yǎng)缽中，于2015年4月12日，澆透水后分別播入經浸種催芽處理的種子。試驗共設置5個處理，分別為CK（不施加香草酸）、Y1（香草酸0.01 mmol?L-1）、Y2（香草酸0.03 mmol?L-1）、Y3（香草酸0.05 mmol?L-1）和Y4（香草酸0.07 mmol?L-1），每個處理3次重復，每重復10株，每處理共計30株。置于人工智能氣候箱中培養(yǎng)，條件為：24℃下，14 h光周期；22℃下，10 h暗周期；光強為400 μmol?m-2?s-1。3 d后各處理分別加入相應濃度的香草酸溶液10 mL，并以無菌水作對照，6 d后再分別加入相應濃度的香草酸溶液10 mL。出苗后每盆加入Hoagland營養(yǎng)液15 mL，每隔5 d澆水，出苗20 d后進行生長及生理指標測定。

（2）植株生長指標測定 每處理隨機選取15株，用直尺測量株高，用蒸餾水沖凈根系后測定主根長，收集并吸干植株后稱整株鮮重，然后放入烘箱105℃殺青1 h，之后80℃下烘干至恒質量，稱其干重。

（3）葉綠素含量測定 采用美國產CCM-200 plus葉綠素含量測定儀測定主莖倒3完全展開葉，每個處理測定30片葉，重復3次，以CCI值表示葉綠素含量。

（4）葉片光合速率及氣體交換參數(shù)測定 凈光合速率、氣孔導度和胞間CO2濃度使用LI-6400便攜式光合測定儀進行活體測定，測定于晴天上午9：30—10：30光照充足且相對穩(wěn)定的時間進行，每個處理測定5片葉，重復3次。

（5）葉片丙二醛含量和根系吸收面積測定 采用TCA法測定葉片丙二醛含量[20]，采用甲烯藍蘸根比色法測定根系總吸收面積、活躍吸收表面積和根系活力[21]。

1.2.3 香草酸對微生物區(qū)系影響試驗

（1）試驗方法 試驗于2015年在沈陽農業(yè)大學花生定位科研基地進行，盆栽土壤為花生連作風沙土（取自遼寧省康平縣海州窩堡花生連作區(qū)，耕層土壤有機質含量5.55 g?kg-1，全氮0.66 g?kg-1，全磷0.12 g?kg-1，全鉀21.02 g?kg-1，堿解氮49.5 mg?kg-1，速效磷13.81 mg?kg-1，pH 6.24）。采用塑料盆，上口直徑32 cm、下口直徑25 cm、高22 cm，每盆裝干土10 kg，播種前一次性施用肥料（N：0.05 g?kg-1干土；P2O5和K2O分別為0.1 g?kg-1干土）。試驗設5個處理，分別為CK（不施加香草酸）、P1（香草酸0.01 mg?kg-1干土）、P2（香草酸0.03 mg?kg-1干土）、P3（香草酸0.05 mg?kg-1干土）和P4（香草酸0.07 mg?kg-1干土），每個處理3次重復，每個重復5盆，即每個處理共播種15盆。于2015年5月22日播種，每盆播4穴，每穴播1粒，2周后出苗，出苗后每盆留健苗3株。生育期間精細管理，按重量法適時澆水，2015年9月30日收獲。

（2）根際土壤樣品的獲取每個處理于花生苗期、花針期、結莢期和成熟期進行采樣。采樣前兩天澆一次透水，采樣時連同花生一同拔起，抖落掉根上較大的土塊，附著在根表面的土壤收集后晾干研碎作為根際土壤樣品[22]。

（3）微生物的分離與計數(shù)采用稀釋平板測數(shù)法。細菌37℃下培養(yǎng)36 h，進行菌落計數(shù)；放線菌28℃下培養(yǎng)5 d后計數(shù)；真菌在28℃下培養(yǎng)7 d后計數(shù)。結果以每克干土所含數(shù)量表示[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參照WILLIAMSON等[24]提出的響應指數(shù)（response index，RI）作為衡量自毒效應的大小。即：

RI = 1-C/T T≥C

RI = T/C-1 T＜C

式中，C為對照值，T為處理值，RI＞0為促進，RI＜0為抑制，定義對照的RI值為0，絕對值的大小與作用強度一致。所得數(shù)據(jù)（除注明外，均以原始數(shù)據(jù)進行）用SPSS15.0軟件進行差異顯著性分析、單因子方差分析結合多重比較分析。以95%可信度水平做差異顯著性分析。

2 結果

2.1 香草酸對花生種子萌發(fā)的影響

由表1可以看出香草酸對花生種子萌發(fā)有較大影響，具有顯著的自毒效應。經不同濃度香草酸溶液處理后，花生種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均低于CK，與對照存在顯著性差異，即香草酸對種子萌發(fā)存在一定的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度效應。當香草酸溶液濃度為0.09 mmol?L-1時（M5），發(fā)芽率為61%，發(fā)芽勢為28%，發(fā)芽指數(shù)為0.56，和對照相比分別降低了39%、66.3%和55.9%，自毒效應響應指數(shù)達到最大值，分別為-0.39、-0.67和-0.56，即自毒作用強度最大。根長的變化趨勢與以上3個指標不同，即隨著香草酸濃度的增大不同處理間并不存在顯著性差異。數(shù)據(jù)結果進一步顯示，和其他3指標相比，種子發(fā)芽勢對自毒物質濃度變化更為敏感，當香草酸溶液濃度為0.01 mmol?L-1時（M1），發(fā)芽勢達到89%，和對照相比提高了6%，其自毒效應響應指數(shù)為0.06（RI＞0），即表現(xiàn)為促進作用。當香草酸溶液濃度為0.09 mmol?L-1時（M5），發(fā)芽勢和發(fā)芽率相比，下降幅度更為明顯，且RI值降到最低，僅為-0.67，即自毒作用強度最大，呈現(xiàn)出明顯的自毒物質低促高抑現(xiàn)象。

表1 不同濃度香草酸溶液對花生種子萌發(fā)指標的影響

表中數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異達5%顯著水平，下同。CK、M1、M2、M3、M4、M5分別表示施加香草酸的濃度為0、0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mmol?L-1

The different lower-case letters indicate statistically significant differences between different treatments (＜0.05)，the same as below. CK, M1, M2, M3, M4 and M5 mean application of different vanillic acid amounts: 0, 0.01, 0.03, 0.05, 0.07, 0.09 mmol?L-1

2.2 香草酸對花生幼苗生長的影響

香草酸對花生幼苗生長有一定影響，具有自毒效應（表2）。經不同濃度香草酸溶液處理后，花生幼苗的主根長和單株干重兩個指標均低于CK，與對照存在顯著性差異，即香草酸對幼苗生長存在一定的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度效應。當外源施加0.07 mmol?L-1（Y4）香草酸溶液時，幼苗主根長和單株干重比對照降低了37.3%和40.0%，主根長和單株干重僅為5.20 cm和0.48 g，自毒效應響應指數(shù)達到最大值，分別為-0.37和-0.40，即自毒作用強度最大。幼苗株高和單株鮮重兩個指標隨著香草酸濃度的增大與對照間并不存在顯著性差異。

表2 不同濃度香草酸溶液對花生幼苗生長的影響

CK、Y1、Y2、Y3、Y4分別表示施加香草酸的濃度為0、0.01、0.03、0.05、0.07 mmol?L-1。下同

CK, Y1, Y2, Y3 and Y4 mean application of different vanillic acid amounts: 0, 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 mmol?L-1. The same as below

2.3 香草酸對花生幼苗光合特性的影響

由表3可以看出香草酸對花生幼苗光合特性指標有較大影響。經不同濃度香草酸溶液處理后，花生幼苗的葉綠素含量、凈光合速率和氣孔導度均低于CK，而胞間CO2濃度高于CK，即香草酸對幼苗的光合特性存在一定的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度效應。葉綠素含量、凈光合速率和氣孔導度3個指標均隨著香草酸濃度的增大而降低，其中，氣孔導度在不同處理間均存在顯著性差異，而葉綠素含量和凈光合速率兩個指標僅與對照存在顯著性差異，但各處理間差異不顯著。當香草酸溶液濃度為0.07 mmol?L-1時（Y4），葉綠素含量為41.81%，凈光合速率為2.29 μmol?m-2?s-1，氣孔導度為47.45 mmol?m-2?s-1，和對照相比分別降低了19.0%、53.9%和49.1%，抑制作用最為明顯。胞間CO2濃度的變化趨勢與以上3個指標相反，即隨著香草酸濃度的增大而呈現(xiàn)上升的趨勢，但各處理間差異不顯著，當香草酸溶液濃度為0.07 mmol?L-1時（Y4），胞間CO2濃度達到最高，為696.19 μmol?mol-1，比對照提高了46.1%。

表3 不同濃度香草酸溶液對花生幼苗光合特性的影響

2.4 香草酸對花生幼苗根系吸收面積的影響

由表4可以看出香草酸對花生幼苗根系活力指標有較大影響。Y2、Y3和Y4處理中花生根系總吸收面積、活躍吸收面積和根系活力（活躍吸收面積/總吸收面積）均低于CK。3個指標均隨著香草酸濃度的增大而降低，其中Y1處理與CK間差異不顯著，其余3個處理均與CK存在顯著性差異。即當香草酸濃度≥0.03 mmol?L-1時對花生幼苗的根系活力存在一定的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度效應。當外源施加0.07 mmol?L-1（Y4）香草酸溶液時，根系總吸收面積和根系活躍吸收面積值最小，分別為0.118 m2和0.022 m2，根系活力最低（0.19），與對照相比降幅分別達到22.4%、54.2%和40.6%。

表4 不同濃度香草酸溶液對花生幼苗根系吸收面積的影響

2.5 香草酸對花生幼苗葉片丙二醛含量的影響

由圖1可以看出外源添加香草酸對花生幼苗葉片的MDA含量具有一定的影響。當香草酸溶液濃度為0.03、0.05和0.07 mmol?L-1（Y2、Y3和Y4）時，葉片的MDA含量明顯高于CK，與對照呈現(xiàn)顯著性差異，分別較CK提高了30.9%、39.5%和43.3%，Y1處理與CK間差異不顯著，即當香草酸濃度≥0.03 mmol?L-1時對花生幼苗葉片產生MDA含量存在一定的促進作用。

圖1 不同濃度香草酸溶液對花生葉片丙二醛含量的影響

2.6 香草酸對花生根際土壤中微生物區(qū)系的影響

2.6.1 對土壤中細菌數(shù)量的影響 由圖2可見，香草酸對花生根際土壤中細菌數(shù)量變化有較大影響。經不同濃度香草酸溶液處理后，根際細菌數(shù)量從苗期到成熟期呈現(xiàn)不同的變化趨勢。從總體上看，在花生全生育期內，根際土壤中細菌數(shù)量的變化為逐漸上升的動態(tài)變化曲線。即在花生苗期和花針期階段，各處理中根際細菌的初始菌量較為接近，無明顯差異，且均為整個生育期內的最低值。進入結莢期后各處理中細菌數(shù)量開始出現(xiàn)明顯上升趨勢，成熟期時均達到全生育期內最高值。進入花生生育后期，添加不同濃度香草酸溶液的各處理中，其根際細菌數(shù)量始終低于對照組，即香草酸對花生根際土壤中細菌生長存在一定的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度效應。細菌數(shù)量隨著香草酸濃度的增大而降低，抑制作用逐漸增強。成熟期時，CK的細菌數(shù)量達到最高值（4.39×107CFU/g），P4處理（香草酸0.07 mg?kg-1干土）的細菌數(shù)量為最低值（4.5×106CFU/g），和CK相比降低了89.7%。

2.6.2 對土壤中放線菌數(shù)量的影響 由圖3可見，香草酸對花生根際土壤中放線菌數(shù)量變化有較大影響。經不同濃度香草酸溶液處理后，根際放線菌數(shù)量從苗期到成熟期呈現(xiàn)不同的變化趨勢。從總體上看，在花生全生育期內，根際土壤中放線菌數(shù)量的動態(tài)變化和細菌呈現(xiàn)相反的變化趨勢，為逐漸下降的動態(tài)變化曲線，即在花生苗期和花針期階段，各處理中初始菌量均達到生育期內最高值，且各處理間菌量差異明顯，隨著花生生育進程的推進，進入生育后期各處理間菌量趨于一致，并無明顯差異，進入成熟期后各處理的菌量均達到生育期內最低值。在花生生育前期，添加不同濃度香草酸溶液的各處理中，其根際放線菌數(shù)量始終低于對照組，即香草酸對花生根際土壤中放線菌生長存在一定的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度效應。放線菌數(shù)量隨著香草酸濃度的增大而降低，抑制作用逐漸增強。苗期時，CK的放線菌數(shù)量達到最高值（8.18×104CFU/g），P4處理（香草酸0.07 mg?kg-1干土）的放線菌數(shù)量為最低值（2.38×104CFU/g），和CK相比降低了70.9%。

CK、P1、P2、P3、P4分別表示施加香草酸的濃度為0、0.01、0.03、0.05、0.07 mg?kg-1干土。下同

圖3 不同濃度香草酸溶液對花生根際放線菌數(shù)量的影響

2.6.3 對土壤中真菌數(shù)量的影響 由圖4可見，香草酸對花生根際土壤中真菌數(shù)量變化有較大影響。經不同濃度香草酸溶液處理后，根際真菌數(shù)量從苗期到成熟期呈現(xiàn)不同的變化趨勢。從總體上看，在花生全生育期內，根際土壤中真菌數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降再小幅上升的變化趨勢，花針期時各處理的菌量均達到峰值。在整個生育期內，P1（香草酸0.01 mg?kg-1干土）和P2處理（香草酸0.03 mg?kg-1干土）的真菌數(shù)量始終高于對照組，即低濃度的香草酸溶液對花生根際土壤中真菌生長存在一定的促進作用；而P3（香草酸0.05 mg?kg-1干土）和P4處理（香草酸0.07 mg?kg-1干土）的真菌數(shù)量始終低于對照組，即高濃度的香草酸溶液對真菌生長具有一定的抑制作用。在花針期時，CK的真菌數(shù)量為2.93×103CFU/g，P1處理的菌量達到最高值（4.03×103CFU/g），和CK相比提高了37.5%，而P4處理的菌量達到最低值（2.73×103CFU/g），較CK降低了6.8%。

圖4 不同濃度香草酸溶液對花生根際真菌數(shù)量的影響

3 討論

3.1 香草酸對花生種子萌發(fā)和幼苗生長的影響分析

花生連作障礙的成因十分復雜[25-27]，學者普遍認為酚酸類自毒物質的累積是引起花生連作障礙的直接原因[28-30]。酚酸類自毒物質主要來自植物殘體的分解產物和根系的分泌作用，其通過影響植物的膜系統(tǒng)、光合作用、內源激素合成等對植物生長產生抑制作用[31-33]。目前國內外學者關于自毒物質的作用機制，對植物生理影響方面的研究已取得較大進展，研究多集中在大豆、黃瓜和地黃等作物，近年來國內學者也相繼對花生自毒作用進行研究，但目前在花生自毒作用的機理以及調控措施方面研究較少。筆者通過前期研究在根際土壤水浸液中鑒定出4種酚酸類物質，分別為對羥基苯甲酸、香草酸、香豆酸和香豆素，其中香草酸和香豆素含量較高且變化規(guī)律性明顯，其在土壤中的含量隨連作年限的增加而呈累積上升趨勢，但并沒有對這些酚酸類物質進行系統(tǒng)的化感自毒效應研究。因此，本試驗通過對4種酚酸類物質進行初篩后選用香草酸處理花生種子及幼苗，研究其對花生種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。試驗結果顯示香草酸對花生種子萌發(fā)和幼苗生長有較大影響，存在一定的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度效應，即其具有顯著的自毒效應。其中，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、幼苗主根長和單株干重5個指標均隨著香草酸濃度的增大而降低，與對照存在顯著差異，自毒效應逐漸增強。這與部分學者的研究結果相吻合，如袁云云等[34]研究發(fā)現(xiàn)外源添加不同濃度的鄰苯二甲酸對花生發(fā)芽全程均有較強的抑制作用，該抑制作用隨濃度的增加而增強。鄰苯二甲酸對花生根長的影響，在苗期時各濃度都有明顯的抑制作用，到結莢期時，10 mg·kg-1濃度對花生根長的抑制作用已達到極顯著，其余高濃度處理的植株抑制作用更顯著。邵慶勤等[35]研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的阿魏酸、香草酸和混合酸處理野燕麥后種子萌發(fā)率都有不同程度的降低，并且都隨著酸濃度的增加，抑制效果增強，在濃度為10 mmol·L-1的水平下抑制作用最強，阿魏酸、香草酸及其混合物的萌發(fā)率分別為對照的72%、80%和78%。然而針對酚酸類物質對苜蓿、人參和水稻種子萌發(fā)影響的研究[36-38]，結果均顯示出酚酸類物質對種子萌發(fā)產生了低濃度促進、高濃度抑制作用，與本試驗結果不完全相同，本試驗中只有較為敏感的指標（種子發(fā)芽勢）顯示出一定的低促高抑現(xiàn)象，此現(xiàn)象可能是由于酚酸物質對不同作物的影響閾值差異所致。

3.2 香草酸對花生幼苗光合特性、根系活力和丙二醛含量的影響分析

眾所周知，植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的活力水平直接影響地上部分的生長、營養(yǎng)狀況和產量水平，根系活性降低必然導致植株養(yǎng)分吸收的減少。葉綠素含量與植株的光合速率密切相關，葉綠素含量的多少反映了植物進行光合作用的能力強弱。植物在逆境下受到傷害以及植物對逆境抵抗能力往往與體內的SOD 活性水平相關，衰老時往往伴隨著SOD活性的降低從而導致自由基增加，同時伴隨著丙二醛（MDA）含量的上升，即膜脂過氧化的加劇。關于自毒物質對膜脂過氧化作用的影響前人已有很多研究[39-40]。本試驗結果顯示出，香草酸對花生幼苗根系活力、葉綠素含量和光合速率都有一定的抑制作用，并且隨著濃度的增加效果越明顯；對葉片中的丙二醛含量有一定的促進作用，且隨著濃度的升高，效果越明顯。該結果說明香草酸對花生幼苗生長具有一定的自毒效應。

3.3 香草酸對花生根際土壤中微生物區(qū)系的影響分析

作物連作導致酚酸類自毒物質在土壤中不斷積累，從而對作物和土壤微生物產生自毒作用，而土壤微生物是土壤有機物轉化的執(zhí)行者，又是植物營養(yǎng)元素的活性庫，是土壤中最活躍的部分[41]。本試驗以酚酸類物質香草酸為研究對象，通過盆栽試驗研究添加不同濃度香草酸后，花生根際微生物區(qū)系的變化，旨在說明土壤中微生物的數(shù)量變化特點。研究結果顯示，外源施入不同濃度的香草酸溶液均會使花生根際細菌和放線菌的數(shù)量降低，說明香草酸抑制根際土壤中細菌和放線菌的生長繁殖；而香草酸對土壤真菌的影響呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象，即低濃度的香草酸溶液對花生根際土壤中真菌生長存在一定的促進作用；而高濃度的香草酸溶液對真菌生長具有一定的抑制作用。但值得進一步探討的是，多位學者研究發(fā)現(xiàn)[42-43]隨著外源物質濃度的升高，土壤微生物數(shù)量均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，而在本試驗中除真菌外均未發(fā)現(xiàn)該趨勢，作者分析可能是由于以下幾個原因導致：第一，以上學者開展的研究均是在無作物種植的情況下進行，而本試驗是在盆栽花生條件下，開展全生育期內的微生物區(qū)系動態(tài)變化研究；第二，由于外源施加的酚酸類物質種類不同，此現(xiàn)象可能是由于不同酚酸物質對作物的影響閾值具有一定差異所致；第三，細菌、放線菌的生長可能對香草酸具有更高的靈敏度，后續(xù)試驗應以現(xiàn)有濃度為基礎向下設置更低的濃度梯度系列。終上所述，針對多種酚酸類物質對花生植株及根際微生物的自毒作用及閾值范圍尚需要進一步系統(tǒng)研究。

4 結論

香草酸對花生種子萌發(fā)和幼苗生長有較大影響，存在一定的抑制作用，且該抑制作用具有一定的濃度效應，即其具有顯著的自毒效應。香草酸亦會抑制花生幼苗的光合作用，降低根系活力，促進幼苗葉片產生丙二醛。此外，不同濃度的香草酸均會使花生根際細菌和放線菌的數(shù)量降低，說明香草酸抑制根際土壤中細菌和放線菌的生長繁殖；而香草酸對土壤真菌的影響呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象，即低濃度的香草酸（0.01 mg?kg-1干土）對花生根際土壤中真菌生長存在一定的促進作用，而高濃度的香草酸（0.07 mg?kg-1干土）對真菌生長具有一定的抑制作用。

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（責任編輯 李云霞）

Effects of Vanillic Acid on Seed Germination, Seedling Growth and Rhizosphere Microflora of Peanut

HUANG YuQian1, YANG JinFeng1, LIANG ChunHao2, CHEN ShenPingYi1, LIU XinYu1, GENG KeRui1, YAO YuChen1, ZHANG Yu1, HAN XiaoRi1

(1College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866;2Plant Protection Research Institute, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Shenyang 110161)

【Objective】 Experiments were carried out to investigate the autotoxicity of vanillic acid and its effect on seed germination and seedling growth of peanut, so as to reveal the response rules of rhizosphere microbes to the autotoxic substances in peanut growth period.【Method】Peanut (L. cv Fuhua 12 150GY ) was used in this study, and petri dish method, nursery pot and pot culture experiment were adopted to explore the effect of vanillic acid on the peanut seed germination, seedling growth and rhizosphere microflora. Six vanillic acid application treatments in petri dish experiment were set with application of different vanillic acid amounts: 0, 0.01, 0.03, 0.05, 0.07, 0.09 mmol?L-1, five treatments in nursery pot experiment were 0, 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 mmol?L-1, and five treatments in pot culture experiment were 0, 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 mg?kg-1dry soil.【Result】(1) The seed germination ratio, germination energy and germination index were lower than CK after treatment with different concentrations of vanillic acid. When the concentration of vanillic acid was 0.09 mmol?L-1, the seed germination ratio, germination energy and germination index respectively decreased by 39%, 66.3% and 55.9% compared with CK, and the response index (RI) reached the maximum. (2) The root length, plant dry weight, chlorophyll content, net photosynthetic rate and stomatal conductance were lower than CK after treatment with different concentrations of vanillic acid. When the concentration of vanillic acid was 0.07 mmol?L-1, all above indexes decreased by 37.3%, 40.0%, 19.0%, 53.9% and 49.1%, respectively, compared with CK, and the response index (RI) reached the maximum. Conversely, the intercellular CO2concentration was the opposite of the above indexes, it went up with the increase of the concentration of vanillic acid. When the concentration of vanillic acid was 0.07 mmol?L-1, the intercellular CO2concentration increased by46.1% compared with CK. (3) when the concentration of vanillic acid ≥0.03 mmol?L-1, the total absorption area, active absorption area and root activity were lower than CK, while the MDA content were higher than CK. When the concentration of vanillic acid was 0.07 mmol?L-1, all above indexes respectively decreased by 22.4%, 54.2% and 40.6% compared with CK, the MDA content increased by 43.3%. (4) The number of rhizosphere actinomycetes were markedly reduced with the increase of vanillic acid concentration at the early stage of peanut, and the differences between the treatments were not significant at the late stage of peanut. The number of bacteria in different treatments were not significant difference at the early stage of peanut, and it substantially reduced with the increase of vanillic acid concentration at the late stage. A high concentration of vanillic acid (0.07 mg?kg-1dry soil) had inhibitory effect on rhizosphere fungal growth, and low concentration of vanillic acid (0.01 mg?kg-1dry soil) had a promoting effect of fungal growth. 【Conclusion】 Vanillic acid had a significant autotoxinc-effect, which inhibited the photosynthesis of peanut seedling, reduced the root activity and promoted seedling leaf malondialdehyde.In addition, the number of rhizosphere bacteria and actinomycetes decreased after treated with vanillic acid, indicating that vanillic acid inhibited the growth of rhizosphere bacteria and actinomycetes; while it promoted the growth of rhizosphere fungi at low concentration but inhibited the growth at high concentration.

vanillic acid; peanut; autotoxic substances; photosynthetic characterization; root activity; microflora

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.011

2017-06-29；

2017-09-28

國家自然科學青年基金項目（31401948）、國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（CARS-14,CARS-13）

黃玉茜，Tel：13889239598；E-mail：hyqlch@163.com。

韓曉日，Tel：13840499488；E-mail：hanxiaori@163.com