溫立柱，孫霞，樊紅梅，郭蕓琿，于媛媛，任紅，王文莉，鄭成淑

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菊花克隆與功能分析

溫立柱，孫霞，樊紅梅，郭蕓琿，于媛媛，任紅，王文莉，鄭成淑

（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院/山東省中日韓菊花國際合作研究中心，山東泰安 271018）

【目的】從菊花中分離克隆，分析其序列特征和在菊花中的時空表達特性，通過基因沉默研究其對菊花花序發(fā)育的影響，分析可能的調(diào)控方式和潛在機理，為菊花花序大小的調(diào)控奠定理論基礎。【方法】使用RACE方法從菊花中克隆全長，通過DNAMAN等軟件對其序列進行分析。采用熒光定量的方式檢測其在菊花不同器官和發(fā)育時期的表達。構建35S::-GFP融合蛋白載體進行亞細胞定位，構建TRV2-沉默表達載體侵染菊花。使用SPSS軟件統(tǒng)計分析沉默系菊花表型變化，通過光學顯微鏡觀察舌狀花花瓣表皮細胞變化，使用熒光定量方式檢測相關基因在沉默系中的表達。【結果】從菊花中克隆了全長，其編碼的氨基酸序列長度為540，理論等電點為7.39，蛋白質(zhì)的理論分子量為60.4 kD，含有兩個AP2保守功能區(qū)域和VYL修飾位點。在與其他物種的ANT蛋白構建的系統(tǒng)進化樹中，CmANT與AtANT聚在一起。熒光定量結果表明：（1）在花蕾中的表達量最高，其次是根>莖>葉。（2）在花序不同部位的比較中，舌狀花中的表達量最高，其次是筒狀花，在花萼中的表達量最低。（3）在舌狀花中的表達隨著發(fā)育時期的延續(xù)而降低。（4）在2,4-D誘導下的3—6 h內(nèi)表達量持續(xù)上升。WoLF PSORT軟件預測和35S::-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞中的定位結果顯示，CmANT蛋白定位在植物細胞核中。TRV--1和TRV--2沉默系的平均花徑相比對照分別減小18.93%和27.47%，舌狀花的數(shù)目分別減少11.39%和14.66%，其中TRV--2與對照差異顯著（<0.05），筒狀花數(shù)目分別減少14.55%和36.56%。頂端花序的舌狀花平均長度分別減少34.17%和54.68%，舌狀花的寬度分別比對照減小24.05%和10.13%。葉片平均鮮重分別比對照組減小13.19%和21.98%，葉片鮮重與筒狀花數(shù)目顯著相關（<0.05）。舌狀花花瓣表皮細胞顯微觀察發(fā)現(xiàn)，沉默系舌狀花花瓣表皮細胞長度和寬度與對照差異不明顯。在兩沉默系中的表達明顯上升，在小花原基分化期時分別是對照中的1.8和1.78倍，同期的表達分別下降了32.28%和38.19%，和的表達量在多個時期也明顯降低?！窘Y論】根據(jù)沉默系表型與相關基因的表達，推測的沉默可能解除了對抑制，促進了生長素的轉運和過量積累，間接抑制了的活性，限制了細胞的分裂增殖，引發(fā)細胞數(shù)目變少，導致沉默系器官變小。

菊花；AINTEGUMENTA；花徑；基因表達；基因沉默

0 引言

【研究意義】‘杭白菊’是中國傳統(tǒng)的菊花品種，不僅具有較高的觀賞價值，而且富含黃酮和酚酸類等營養(yǎng)物質(zhì)，成為重要的飲用保健產(chǎn)品，但由于其花序較小，限制了產(chǎn)量提高。（）對花器官的形成和大小發(fā)育具有重要作用。開展調(diào)控菊花花序生長發(fā)育的機理研究，可以為杭白菊的產(chǎn)量和品質(zhì)提高奠定理論基礎，對杭白菊產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】- like（）屬于（）轉錄調(diào)控家族中的亞族[1]，在模式植物擬南芥中包含、，共8個成員[2]，其序列均包含兩個AP2保守功能區(qū)域，但不含有miR172結合位點[3]。家族成員對于植物的生長發(fā)育調(diào)控具有重要作用，參與了胚的發(fā)育，莖的伸長，花器官發(fā)育的起始和生長等[4-5]，其中對于花器官大小的影響最為明顯[2]。缺失突變體的花器官變小，胚珠發(fā)育受損導致雌性不育[6-7]，而其過表達導致花器官增大[8]。Krizek等[9]發(fā)現(xiàn)擬南芥中生長素轉運相關基因可能是的直接調(diào)控目標，YAMAGUCHI等[10]研究表明，可以響應生長素的誘導，參與了（）的表達調(diào)控，進而影響營養(yǎng)生長向開花起始的轉變，該路徑與（）平行。在花器官生長過程中，的活性受到上游生長素響應基因（）的調(diào)控，影響花器官的大小發(fā)育[11]。除花器官發(fā)育起始和生長大小以外，Krizek等[12-13]發(fā)現(xiàn)參與的其他生理過程也與生長素有關，如花器官身份確定和雌蕊群的發(fā)育等。CHIALVA等[14]研究表明，的表達水平與葡萄果實的大小有關。植物花器官的發(fā)育由A、B、C、E四類轉錄調(diào)控基因相互作用而決定[15]，能夠調(diào)控（，B類）和（，C類）的表達，影響花器官位置和大小的發(fā)育[4]，其缺失突變導致花器官發(fā)育紊亂。MIZUKAMI等[8]的研究認為能夠致使器官增大的原因是其在器官形成過程中保持分生組織較強的分生能力，擬南芥中可能通過（）調(diào)控細胞分裂周期，使分生組織保持活力從而影響器官的大小。擬南芥中過表達導致葉片細胞數(shù)目變多[16]。在ant ail6雙突變體和野生型中，細胞壁重塑相關基因的表達存在較大差異[9]，HARADA等[17]證明/（）和（）參與了康乃馨花瓣的伸長過程，筆者實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)菊花中和與花瓣細胞的分裂和伸長有關。【本研究切入點】關于在菊花花序生長發(fā)育中的功能有待研究?！緮M解決的關鍵問題】使用RACE方法從菊花中克隆全長，分析其在菊花不同器官和時期以及2,4-D誘導下的表達特性，統(tǒng)計觀察沉默的菊花花瓣大小和形態(tài)特征，從而鑒定在菊花花序生長發(fā)育中的功能。

1 材料與方法

試驗于2016—2017年在山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院實驗中心進行。

1.1 試驗材料與處理

選取長勢均勻一致的杭白菊扦插苗生根后栽培到溫室中，經(jīng)30 d長日照（16 h光照，8 h黑暗）營養(yǎng)生長后，置于短日照（8 h光照，16 h黑暗）環(huán)境中促進其花芽分化。采取不同時期的根、莖、葉片和花器官，存儲在-80℃低溫冰箱中保存，備用。

1.2 菊花CmANT克隆

試驗采用天根TRIzol試劑盒提取菊花花序的RNA。使用SMARTer RACE cDNA擴增試劑盒（Takara，日本）反轉錄所需的cDNA一鏈。在菊花轉錄組數(shù)據(jù)庫（http://www.icugi.org/chrysanthemum/）中檢索獲得的初始中間片段。使用諾維贊高保真酶進行5′和3′端克隆，通過DNAMAN軟件進行全長拼接，設計引物進行全長驗證。

1.3 生物信息學分析

通過NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST程序對CmANT蛋白進行保守功能區(qū)域搜索。使用DNAMAN軟件進行多氨基酸序列比對，在PBIL網(wǎng)站（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）對其信號肽等特征位點進行檢測。使用Mega 7.0軟件以鄰近結合的方式構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，青蒿AaANT、向日葵HaANT、馬鈴薯StANT、棗樹ZjANT、棉花GhANT、苦瓜McANT與擬南芥AILs家族成員序列從NCBI網(wǎng)站獲得。

1.4 CmANT實時熒光定量分析

為分析在菊花不同器官中的表達情況，采取現(xiàn)蕾期（花蕾直徑約0.5 cm）菊花的根、莖段、植株中間部位的功能葉片和頂端花蕾分別進行檢測。采取植株頂端盛花期（花序直徑約6 cm）的菊花花序，檢測在花序不同部位的表達。采取初開期（舌狀花長約1.5 cm）、盛花期（舌狀花長約2.8 cm）和衰敗期（舌狀花出現(xiàn)萎蔫變色）的舌狀花，檢測在舌狀花不同生長時期的表達。參照YAMAGUCHI等[18]的方法對營養(yǎng)生長狀態(tài)下的菊花植株噴施10 mmol?L-12,4-D，檢測在菊花頂芽中的表達量。使用菊花的作為定量的內(nèi)參基因，試驗中所需引物見表1。使用羅氏Light Cycler 480熒光定量儀進行PCR檢測，具體程序如下：94℃預變性10 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)。每個試驗重復3次，根據(jù)2?ΔΔCt公式計算結果，通過SPSS軟件計算標準誤差和差異顯著性。

1.5 亞細胞定位觀察

根據(jù)全長設計引物擴增其編碼區(qū)序列（表1）。使用T4連接酶連接到p1258-GFP載體中，轉化大腸桿菌DH5α，測序驗證后，提取質(zhì)粒轉化到農(nóng)桿菌GV3101中，制備菌液侵染洋蔥表皮細胞，在超高分辨率激光共聚焦顯微鏡（LSM880）下觀察拍照。

1.6 CmANT的沉默

參照Lü等[19]的方法對菊花進行病毒誘導沉默。根據(jù)與轉錄組中相似基因的序列比對，篩選出的特異序列，用于沉默擴增，所需引物見表1。將沉默所需片段連接到p-TRV2載體上，轉化到GV3101農(nóng)桿菌中，按需配制含pTRV1、pTRV2和pTRV2-質(zhì)粒的混合侵染液。將扦插生根后的菊花幼苗分為兩組進行侵染，一組由含有pTRV1和pTRV2空載的農(nóng)桿菌侵染，作為對照；一組由含有pTRV1和pTRV2-的農(nóng)桿菌侵染，每組處理50株菊花。經(jīng)真空負壓侵染后置于黑暗條件中2 d，然后轉移到溫室長日照（光照16 h，黑暗8 h）環(huán)境中培養(yǎng)30 d，后轉移到短日照（光照8 h，黑暗16 h）環(huán)境中促進其花芽分化。采取小花原基分化期的花芽，初開期和盛花期的花序，通過半定量PCR的方式檢測病毒誘導基因沉默效果。采集沉默系與TRV對照組菊花花序和葉片進行形態(tài)特征調(diào)查分析。

1.7 沉默系的表型性狀觀察

采取沉默系和TRV對照組的盛花期花序和葉片，調(diào)查花序直徑、舌狀花和筒狀花數(shù)目、舌狀花的長度和寬度，稱量所有葉片鮮重。使用IBM SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，花器官形態(tài)使用數(shù)碼相機拍照。制作舌狀花花瓣中部上表皮細胞切片，在光學顯微鏡下觀察拍照，隨機選取視野中9個細胞，測量記錄其長度和寬度，使用SPSS軟件統(tǒng)計分析。

1.8 CmANT相關基因實時熒光定量分析

在菊花轉錄組中檢索調(diào)控相關的基因序列，設計定量引物（表1）。根據(jù)文獻查閱和預試驗檢測，采取沉默系和對照組菊花的小花原基分化期（短日照處理14 d）花芽[20]，初開期和盛花期的內(nèi)外輪舌狀花，參照1.4的方法進行熒光定量檢測。

表1 相關基因試驗所用引物序列

2 結果

2.1 菊花CmANT克隆與序列分析

根據(jù)擬南芥中序列在菊花轉錄組數(shù)據(jù)庫中的blast結果，篩選出相近的基因中間片段，通過RACE克隆的方法獲得全長序列，共1 995 bp，將其序列提交到NCBI基因庫中，命名為，登錄號為：KY315243。使用DNAMAN軟件預測，發(fā)現(xiàn)編碼540個氨基酸，其理論等電點為7.39，蛋白質(zhì)的理論分子量為60.4 kD。

2.2 ANT氨基酸序列比對分析

通過NCBI網(wǎng)站BLAST搜索相似蛋白序列，獲得了其他物種的ANT蛋白，其中CmANT與青蒿的AaANT相似度最高，為80.78%，由于擬南芥中AtANT的氨基酸序列研究較為深入，所以將菊花的CmANT與其進行詳細序列比對（圖1），兩者的相似度為39.97%。對CmANT結構分析表明，在中間部位有兩個AP2/ERF家族特有的AP2保守功能區(qū)域，是AP2-like亞族區(qū)別于ERF-like亞族的重要特征[21]。兩個AP2保守區(qū)域之間有29個氨基酸組成的連接區(qū)域[22]。此外，CmANT含有與轉錄活性有關的VYL修飾位點[23]。

兩個AP2保守結構域由下劃線標示，VYL修飾位點由黑色三角標示

2.3 系統(tǒng)進化分析

為進一步確認CmANT的身份，將菊花的CmANT與其他物種的ANT蛋白以及擬南芥的8個AtAIL蛋白成員一起通過Mega 7.0軟件以鄰近結合的方式構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結果顯示菊花的CmANT與青蒿的AaANT聚在一組（圖2），兩者的遺傳距離更為接近。此外，各物種的ANT蛋白聚在一起，與擬南芥的其他AIL成員遺傳距離較遠。由此說明，CmANT為菊花中的ANT蛋白。

2.4 菊花CmANT在菊花中的表達

通過熒光定量的方式檢測在菊花不同器官中的表達（圖3-A），發(fā)現(xiàn)在莖和葉中的表達量較低，在花蕾中的表達量最高，是葉中的16.21倍，同時在根中也有相當較高的表達，是葉中的8.28倍。比較在菊花花序不同部位中的表達（圖3-B），發(fā)現(xiàn)其在花萼中的表達量最低，在筒狀花中次之，在舌狀花中的表達量最高，是花萼中的10.46倍。本試驗進一步檢測了在舌狀花不同生長時期的表達（圖3-C），結果表明在衰老期的表達量最低，在初開期和盛花期均有較高的表達量，分別是衰老期的14.25和8.45倍。是生長素調(diào)控網(wǎng)絡中重要的響應基因[10]，參照YAMAGUCHI等[18]的方法，檢測了在2,4-D誘導下的表達情況，發(fā)現(xiàn)其表達量在經(jīng)2, 4-D處理3 h后上升了4.64倍，在6 h后仍持續(xù)上升，是對照的7.49倍（圖3-D）。

2.5 菊花CmANT表達載體的構建與亞細胞定位

經(jīng)WoLF PSORT軟件預測，發(fā)現(xiàn)CmANT蛋白定位在植物細胞核中。根據(jù)全長設計引物擴增其編碼區(qū)序列，連接到p1258-GFP過表達載體中，轉化到土壤農(nóng)桿菌中侵染洋蔥表皮細胞，使用475 nm藍光激發(fā)，發(fā)現(xiàn)綠色熒光聚集在細胞核區(qū)域，表明CmANT蛋白主要定位在洋蔥表皮細胞的細胞核中。兩種方法的結果互相吻合（圖4），說明CmANT蛋白的作用區(qū)域可能更多集中在細胞核中。

圖2 AILs蛋白系統(tǒng)進化分析

A：CmANT在菊花不同器官中的表達；B：CmANT在菊花花序不同部位的表達；C：CmANT在不同生長期的舌狀花中表達；D：CmANT在2,4-D誘導下的表達。誤差線代表3個生物學重復計算的標準誤差。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.6 菊花CmANT沉默的菊花花序和葉片

通過半定量PCR方式檢測在各株系小花原基分化期花芽中的表達，鑒定出6個TRV-沉默株系，選擇表型變化最為明顯的TRV--1和TRV--2進行下一步研究，并在初開期和盛花期時持續(xù)檢測沉默效果（圖5）。

A、D為綠色熒光下的圖片，B、E為明場下的圖片，C、F為疊加下的圖片

TRV--1和TRV--2沉默系中花序直徑與TRV對照組差異明顯（＜0.01），分別減小了18.93%和27.47%（圖6-A，表2）。舌狀花的數(shù)目分別減少了11.39%和14.66%，其中TRV--2與對照差異顯著（＜0.05），而筒狀花的數(shù)目變化更為明顯，分別減少了14.55%和36.56%。舌狀花的大小對菊花花序直徑具有重要影響，本試驗采集了各株系頂端花序的內(nèi)、外輪舌狀花進行觀察和統(tǒng)計分析（圖6-B，表2），發(fā)現(xiàn)兩株沉默系的舌狀花平均長度與對照相比差異顯著（＜0.01），分別減少了34.17%和54.68%；舌狀花的寬度分別比對照減小了24.05%和10.13%。

圖5 CmANT在不同沉默系和TRV對照組小花原基分化期花芽中的表達

舌狀花大小的變化可能源自細胞體積和數(shù)目的改變，為進一步研究TRV-沉默株系舌狀花花瓣變小的原因，本試驗采集了體積差異明顯的沉默系和對照組舌狀花，制備花瓣中部表皮細胞玻片，在400倍光學顯微鏡下觀察統(tǒng)計（圖6-C，表2），發(fā)現(xiàn)兩個TRV-沉默株系的表皮細胞長度和寬度與對照組差異不明顯。說明的沉默并沒有引起花瓣表皮細胞的體積變化，推測舌狀花花瓣變小的原因可能是由于花瓣細胞數(shù)目的改變。菊花的營養(yǎng)對花序的發(fā)育具有重要影響，本試驗初步檢測了作為主要營養(yǎng)供應的葉片的鮮重（表2），發(fā)現(xiàn)沉默系中葉片平均鮮重分別比對照組減小了13.19%和21.98%，但差異不顯著（＞0.05）。進一步通過SPSS軟件了解其與花序各項指標的相關性，發(fā)現(xiàn)葉片鮮重與筒狀花數(shù)目顯著相關（＜0.05），而與其他指標的相關性均不顯著（表2），說明沉默系中筒狀花數(shù)目的改變可能與葉片鮮重存在一定關系，而其他花器官指標的變化大多與葉片改變關系可能不大。

2.7 CmANT及其相關基因在菊花沉默系中的表達

在對照組的小花原基分化期時表達量最高，初開期時有所下降，盛花期時表達量最低；在TRV--1和TRV--2沉默系中在小花原基分化期和初開期時的表達量極顯著低于對照組（＜0.01），在盛花期時，TRV--2沉默系與對照組也有顯著差異（＜0.05）。說明在兩個沉默系的表達受到了明顯抑制。在TRV--1和TRV--2沉默系中各時期的表達均高于對照組，在小花原基分化期時差異最為顯著（＜0.05），分別是對照中的1.8和1.78倍，而表達的改變可能會影響生長素的運輸和積累。在兩個沉默株系中的表達均比對照中低，如在小花原基分化期時分別下降了32.28%和38.19%，說明的沉默影響了的表達。在初開期時分別減少了27.76%和29.88%，在初開期時分別比對照降低了37.03%和33.78%（圖7）。和的表達降低，從側面說明沉默系中花瓣細胞的分裂活動可能受到了影響。

A：花序，B：舌狀花，C：舌狀花花瓣表皮細胞，I：TRV對照組，II：TRV-CmANT-1沉默系，III：TRV-CmANT-2沉默系，Bar=25 μm

表2 CmANT沉默系與對照組菊花花序形態(tài)指標

表中數(shù)值為平均值±標準誤差。每一行中*代表在＜0.05水平上與對照相比有顯著差異，**代表在＜0.01水平上有顯著差異

Values are mean ± SE. In each line, * indicates statistically significant differences at＜0.05, ** indicates statistically significant differences at＜0.01

3 討論

CmANT氨基酸序列中含有AILs家族中保守的兩個AP2功能區(qū)域，前人研究發(fā)現(xiàn)兩個AP2區(qū)域會同時作用于ANT和靶基因的結合[24]，CmANT的第一個AP2功能域中含有與轉錄活性有關的VYL修飾位點，說明菊花的CmANT可能與AtANT類似，具有轉錄調(diào)節(jié)功能。

3.1 菊花CmANT表達特性

本試驗發(fā)現(xiàn)在花蕾中的表達量最高，說明其可能更多的調(diào)控花器官的發(fā)育，但也參與了根、莖、葉等營養(yǎng)器官的生長。MIZUKAMI等[8]研究證明能夠保持細胞的分生能力，實現(xiàn)細胞的持續(xù)增殖，調(diào)控器官不斷生長。比較在菊花不同時期舌狀花中的表達發(fā)現(xiàn)，其表達量隨著舌狀花發(fā)育的持續(xù)而降低，推測可能是由于初開期的舌狀花處于快速生長期，伴隨著大量細胞的生長和增殖，的高表達可能會維持此時細胞增殖所需的能力，而衰老期時舌狀花幾乎停止了生長，細胞生長和增殖的需求較小，所以的表達量較低。同理，在初開期花序的不同部位中，舌狀花的數(shù)量較多，生長發(fā)育較快，需要的高表達來實現(xiàn)其較大的生長需求，其次是筒狀花和花萼。在生長素調(diào)控花序發(fā)育的代謝網(wǎng)絡中，生長素與受體結合促進了轉錄抑制蛋白AUX/IAAs的降解，解除了對轉錄調(diào)控因子AUXIN- RESPONSE FACTORs（ARFs）的抑制[25-26]，其中ARF MONOPTEROS（MP/ARF5）能夠直接激活的表達[18]。本試驗中，的表達在菊花經(jīng)2,4-D處理3—6 h內(nèi)出現(xiàn)快速響應而持續(xù)上升，說明可能受到生長素含量的間接調(diào)控。通過35S::- GFP融合蛋白在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，熒光信號聚集在細胞核中，這可能與CmANT作為轉錄調(diào)控因子的性質(zhì)有關，在細胞核中實現(xiàn)對下游基因的轉錄調(diào)控。

相鄰列中*代表在＜0.05水平上與TRV對照相差異顯著，**代表在＜0.01水平上差異顯著

* indicates statistically significant differences at＜0.05 compared with TRV control among adjacency lists, ** indicates statistically significant differences at＜0.01

圖7及其相關基因在沉默系和對照中的表達

Fig. 7 Expression ofand related genes in silenced and control chrysanthemum

3.2 CmANT沉默對菊花花序和葉片的影響

通過構建TRV-沉默表達載體侵染菊花進行功能驗證，發(fā)現(xiàn)TRV--1和TRV--2沉默株系的花序平均直徑相比TRV對照組明顯減小。而在擬南芥強突變體中，不僅花器官的體積變小，同時出現(xiàn)了外輪花瓣和雄蕊的數(shù)量減少[7]，NOLE-WILSON等[27]發(fā)現(xiàn)突變體中分生組織細胞的不足導致形成的花器官原基比野生型要小，進而可能使花器官數(shù)目減少。雖然本試驗沉默系中未發(fā)現(xiàn)菊花單個小花的器官缺失，但舌狀花和筒狀花數(shù)目均明顯減少，說明的沉默可能會影響菊花小花原基的分化，影響小花數(shù)目。筒狀花數(shù)目減少的幅度要大于舌狀花，可能是由于筒狀花相比舌狀花在小花原基分化時發(fā)育較晚的緣故，因此筒狀花數(shù)目的改變更為明顯。對舌狀花觀察統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，其平均長度和寬度較對照組明顯變小，通過對花瓣表皮細胞的顯微觀察，發(fā)現(xiàn)細胞的長度和寬度與對照相比無明顯變化，類似的是擬南芥突變體的葉片和花瓣表皮細胞體積沒有變小，反而異常變大[8]。排除細胞體積的變化的因素，則引起花瓣變小的原因可能是細胞數(shù)目的減少，因此推測的沉默可能會影響花瓣細胞的增殖，進而影響花瓣的大小。本試驗發(fā)現(xiàn)沉默系葉片平均鮮重明顯小于對照組，說明的沉默也會對葉片產(chǎn)生類似的影響。通過相關性分析發(fā)現(xiàn)除筒狀花數(shù)目以外，花序其他指標與葉片的相關性不明顯，推測沉默系中花序的改變除部分來自葉片營養(yǎng)供應的差異外，可能更多的是由于的沉默。

3.3 CmANT調(diào)控花序生長發(fā)育機理的分析

是調(diào)控細胞分裂起始的重要基因，主要在花器官中表達[28]，擬南芥中過表達導致細胞數(shù)目變多[16]。MIZUKAMI等[8]發(fā)現(xiàn)擬南芥中過表達使在成熟葉片中持續(xù)表達，在突變體中卻沒有表達，認為可能會直接調(diào)控的表達，從而實現(xiàn)細胞的持續(xù)分裂。但RANDALL等[29]的研究表明的啟動子序列與AtANT并無直接互作關系，并推測與在調(diào)控器官生長過程中是獨立運行的。本試驗中發(fā)現(xiàn)，在的沉默系中的表達有所降低，推測可能會以間接的方式影響的表達。在沉默系的小花原基分化時，的表達降低可能會限制分生組織的細胞分裂，影響小花的數(shù)目，尤其是發(fā)育較晚的筒狀花。是重要的生長素轉運相關蛋白，影響側生器官的生長發(fā)育[30]，可能受到的直接調(diào)控[9]。在擬南芥雙突變體中，發(fā)現(xiàn)雖然花器官的發(fā)育受阻，但有更多的生長素積累[9]。在本試驗中，在兩個沉默系中的表達均明顯上升，所以猜測可能是負向調(diào)控的轉錄抑制因子，的沉默導致抑制減弱，而激活了的表達，進而可能會促進生長素的積累。Garza- AGUILAR等[31]的研究表明在IAA處理過的玉米種子萌發(fā)過程中，CYCD3;1蛋白含量降低，同時相關蛋白激酶的活性也有所改變，因此推測持續(xù)過高濃度的生長素含量對的轉錄表達和相關激酶的活性可能具有抑制作用。另一方面，植物體內(nèi)激素調(diào)控網(wǎng)絡存在交叉聯(lián)系和相互影響[32]，誘導的生長素積累，可能會對其他激素的代謝網(wǎng)絡產(chǎn)生影響，如擬南芥雙突變體花器官中不僅生長素大量積累，同時伴隨著其他激素含量的改變[21]，這些激素的代謝紊亂可能會對產(chǎn)生影響，抑制其轉錄表達或者蛋白激酶活性。因此也有可能是菊花的沉默激活了的表達，造成花序中的激素代謝紊亂，對的表達產(chǎn)生了間接影響，抑制了其活性，導致細胞分裂受阻。PEAUCELLE等[33]發(fā)現(xiàn)細胞壁中果膠成分的改變，引起細胞壁的松散，有利于側生器官的起始發(fā)育，而引起的生長素積累，調(diào)控一系列細胞壁重塑相關基因的表達，如和。Harada等[17]證明了和參與了康乃馨花瓣的伸長生長。本試驗中，和在兩個沉默系中的表達均有所降低。因此推測的沉默可能間接的降低了細胞壁重塑基因的表達，限制了細胞壁的舒張，影響了花器官分生組織的發(fā)育，也有可能是的沉默導致細胞分裂活動的降低，減少了細胞壁重塑相關蛋白的需求，從而影響了和的轉錄表達，本研究更傾向于后者。

4 結論

本研究克隆的具有典型AP2家族序列特征，在花蕾和初開期的舌狀花中具有較高的表達。的沉默導致花序直徑、小花數(shù)目和舌狀花的體積明顯變小，推測原因是由于對抑制的解除，促進了生長素的轉運而過量積累，間接抑制了的活性，限制了細胞的分裂增殖，以致細胞數(shù)目變少，伴隨著細胞壁的重塑活動，從而影響器官的生長。

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（責任編輯 趙伶俐）

Cloning and Functional Verification ofGene in Chrysanthemum

WEN LiZhu, SUN Xia, Fan HongMei, GUO YunHui, YU YuanYuan, REN Hong, WANG WenLi, ZHENG ChengShu

(College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University/Chrysanthemum Research Center of China, Japan and Korea in Shandong Province, Tai’an 271018, Shandong)

【Objective】 To understand the role ofgene in chrysanthemum inflorescence development, we clonedgene from chrysanthemum, analyzed its sequence, and characterized its temporal and spatial expression pattern. We further analyzed the impact ofsilence on inflorescence development and its possible regulation mode. This study was carried to reveal the potential mechanism ofin governing inflorescence development, which in turn can provide a theoretical basis for chrysanthemum inflorescence diameter adjustment. 【Method】 The chrysanthemumgene was cloned by RACE method and its sequence was analyzed with DANMAN software. Its expression in different developmental stages and organs of chrysanthemum was detected by real-time fluorescent quantitation PCR. The plasmid of 35S::-GFP was constructed for the subcellular localization. The silence vector of TRV2-was constructed to infect chrysanthemums. The statistics of phenotypic changes insilenced chrysanthemums were analyzed via SPSS software. The ray florets petal epithelial cells were observed with optical microscope. The expression ofand related genes were detected by real-time fluorescent quantitation PCR. 【Result】 The full-length ofwas cloned from chrysanthemum. It encodes 540 amino acids and contains two AP2 conserved function domains and VYL modification sites. The theoretical isoelectric point of CmANT is 7.39 and its molecular weight is 60.4 kD. The phylogenetic tree composed of ANT proteins from various plants species showed that CmANT and AaANT had been grouped together. The real-time fluorescent quantitation results showed that: (1)was expressed most in floral buds, followed by roots, stems and leaves. (2) Gene expression in different parts of inflorescence indicated thatwas expressed the most in ray florets followed tubular florets and the lowest in the sepal. (3) The expression ofdeclined during the development of ray florets. (4) The expression ofunder 2,4-D treatment increasedbetween 3 h to 6 h. WoLF PSORT prediction and 35S::-GFP fusion protein localization in onion epithelial cells indicated that CmANT protein was located in cell nucleus. Compared with the control, the mean inflorescence diameters of chrysanthemums in TRV--1 and TRV--2 lines were decreased by 18.93% and 27.47% respectively and the numbers of ray florets were decreased by 11.39% and 14.66% respectively, among which the difference between TRV--2 lines and the control was statistically significant (＜0.05 ). The numbers of tubular florets were decreased by 14.55% and 36.56%, the mean length of ray florets in top inflorescences was decreased by 34.17% and 54.68%, and the width was decreased by 24.05% and 10.13% respectively in TRV--1 and TRV--2 lines compared with the control, the mean fresh weight of leaves was decreased by 13.19% and 21.98% respectively in TRV--1 and TRV--2 lines and the correlation between leaf fresh weight and tubular floret number was significant (＜0.05 ). The microscopic observation of epithelial cells in ray floret petals indicated that the cell length and width of petals in the silenced lines and the control had no visible differences. The expression ofwas decreased by 32.28% and 38.19% in two silenced lines and the expression ofandalso decreased at most developmental stages. 【Conclusion】Due to the phenotypic changes andexpression pattern in silenced chrysanthemums lines, we speculated that the silence ofmight relieve the repression on, facilitate the transport and accumulation of auxins, indirectly repress the activation of, limit the cell division, and cause the decrease of cell number, combined of which would eventually lead to the smaller organ sizes in silenced chrysanthemums lines.

;; inflorescence diameter; gene expression; gene silence

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.014

2017-09-20；

2017-12-20

國家科技支撐計劃（2011BAD10B07）、國家自然科學基金面上基金（31670663）

溫立柱，E-mail：wlizhu@163.com。孫霞，E-mail：sunxia65@sina.com。溫立柱與孫霞為同等貢獻作者。

鄭成淑，Tel：0538-8246139；E-mail：zcs@sdau.edu.cn