劉曉晨，吳圣勇，雷仲仁，王海鴻

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不同溫度下兩株球孢白僵菌侵染西花薊馬的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及其毒力

劉曉晨，吳圣勇，雷仲仁，王海鴻

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100193）

【目的】通過(guò)比較兩株球孢白僵菌（）在不同溫度條件下侵染西花薊馬（）的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及其毒力，探討球孢白僵菌菌體增殖和殺蟲(chóng)毒力的關(guān)系，為提高球孢白僵菌對(duì)西花薊馬的殺蟲(chóng)效率提供理論支持。【方法】首先，在20、25和30℃ 3個(gè)溫度條件下，連續(xù)記錄第1—8天西花薊馬被兩株球孢白僵菌菌株（SCWJ-2和GZGY-1-3）侵染后的死亡率，并以未被真菌感染的西花薊馬為對(duì)照，計(jì)算其累積校正死亡率，選擇第3天的數(shù)據(jù)（對(duì)照死亡率為2%—5%）比較兩個(gè)菌株的殺蟲(chóng)效率。其次，在20、25和30℃ 3個(gè)溫度條件下，連續(xù)記錄第1—8天內(nèi)平板培養(yǎng)的上述兩個(gè)菌株的菌落直徑，選取第3天兩個(gè)菌株的菌落生長(zhǎng)直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。最后，提取20、25和30℃溫度下，西花薊馬分別被兩株球孢白僵菌侵染第1、2和3天的混合DNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)定量球孢白僵菌在每個(gè)宿主樣品體內(nèi)的拷貝數(shù)，選取第3天兩個(gè)菌株的基因拷貝數(shù)進(jìn)行比較分析。【結(jié)果】生物測(cè)定結(jié)果顯示，在檢測(cè)溫度（20—30℃）范圍內(nèi)，球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2對(duì)西花薊馬成蟲(chóng)均具有較高致病性，無(wú)論任何溫度和何種菌株，西花薊馬從處理后第2天開(kāi)始有死亡個(gè)體出現(xiàn)，第8天時(shí)，SCWJ-2和GZGY-1-3造成的校正死亡率分別為83%—91%和79%—90%。以第3天的校正死亡率為指標(biāo)（對(duì)照死亡率為2%—5%），30℃下菌株SCWJ-2毒力顯著高于GZGY-1-3（＜0.05），25℃和20℃下兩個(gè)菌株毒力無(wú)顯著差異（＞0.05）。平板培養(yǎng)試驗(yàn)表明，在檢測(cè)溫度（20—30℃）范圍內(nèi)，兩個(gè)菌株菌落直徑隨著時(shí)間推移而增加，第8天時(shí)，菌株SCWJ-2和GZGY-1-3的菌落直徑分別為31—36、28—32 mm。選取第3天菌落生長(zhǎng)直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，菌株SCWJ-2在3個(gè)溫度下的菌落直徑均顯著大于菌株GZGY-1-3（＜0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，除30℃下的菌株SCWJ-2之外，兩個(gè)菌株在西花薊馬體內(nèi)的基因拷貝數(shù)都在第1天時(shí)下降，2 d后又逐漸上升。使用第3天西花薊馬體內(nèi)的基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析，在30℃下菌株SCWJ-2真菌拷貝數(shù)顯著大于GZGY-1-3（＜0.05），25℃和20℃下兩個(gè)菌株基因拷貝數(shù)無(wú)顯著差異（＞0.05）。【結(jié)論】真菌在被侵染蟲(chóng)體內(nèi)的基因拷貝數(shù)受到菌株和溫度的影響，這與生物測(cè)定結(jié)果相一致。與菌株GZGY-1-3相比，SCWJ-2更適合高溫條件下對(duì)西花薊馬的防治。

球孢白僵菌；西花薊馬；真菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】西花薊馬（）是一種重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)[1-3]，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成較大威脅[4-6]。球孢白僵菌（）是一種廣譜性蟲(chóng)生真菌，已被大量應(yīng)用于西花薊馬的防治[7-12]。蟲(chóng)生真菌孢子附著并穿透昆蟲(chóng)體壁[13]后，菌絲在昆蟲(chóng)血腔內(nèi)生長(zhǎng)，能夠產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物[14]、消耗宿主體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、穿透宿主的重要器官和阻止血淋巴流動(dòng)等，最終導(dǎo)致宿主昆蟲(chóng)死亡[15]。然而，室內(nèi)適溫下篩選出的對(duì)西花薊馬具有相似殺蟲(chóng)效率的球孢白僵菌菌株，在田間實(shí)際應(yīng)用時(shí)效率卻顯著不同[16-17]。菌體增殖能力的差異是引起菌株間毒力差異的重要原因[18]，田間溫度可能通過(guò)影響真菌菌體增殖，導(dǎo)致不同菌株間最終殺蟲(chóng)效率不同[19]。因此，研究不同溫度對(duì)球孢白僵菌侵染的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)影響，對(duì)提高田間防治效果具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，許多評(píng)價(jià)真菌菌體增殖與殺蟲(chóng)效率關(guān)系的研究大多是通過(guò)體外試驗(yàn)完成的。例如，檢測(cè)液體培養(yǎng)的菌絲和孢子數(shù)，固體培養(yǎng)的菌落直徑等[20-25]。EKESI等[20]報(bào)道了溫度對(duì)2株球孢白僵菌和4株綠僵菌（）的孢子萌發(fā)和菌落直徑生長(zhǎng)的影響，進(jìn)而影響了對(duì)薊馬（）的致病性；Adamo等[24]研究表明，隨著溫度的升高靈桿菌（）或蠟狀芽孢桿菌（）生長(zhǎng)速率加快，進(jìn)而影響對(duì)寄主蟋蟀（）的致病能力；HUNT等[25]檢測(cè)了不同溫度下昆蟲(chóng)體內(nèi)病原菌的生長(zhǎng)狀況，把感染綠僵菌（）的果蠅（）分別于不同溫度環(huán)境下處理相同時(shí)間后采樣，培養(yǎng)并計(jì)數(shù)菌落的數(shù)量，結(jié)果表明昆蟲(chóng)體表病原菌生長(zhǎng)狀況與溫度密切相關(guān)。然而，上述方法都無(wú)法模擬真菌當(dāng)時(shí)所處的寄主體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和免疫壓力環(huán)境，不能很好地代表真菌的自然生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。關(guān)于檢測(cè)真菌在活體內(nèi)增殖的方法，曾有報(bào)道使用顯微鏡法測(cè)定血球計(jì)數(shù)板上被感染的昆蟲(chóng)體內(nèi)芽生孢子和/或菌絲片段的數(shù)量[26]，但這一技術(shù)在感染初期和末期得到的結(jié)果很不精確，因?yàn)樗拗髟诟腥境跗谄溲馨椭械木w很少，而在感染后期芽生孢子和菌絲片段又太多，均無(wú)法精確計(jì)數(shù)[26]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)為準(zhǔn)確定量真菌在昆蟲(chóng)體內(nèi)生長(zhǎng)數(shù)量提供了便利[27-29]。但目前為止，還未有利用此項(xiàng)技術(shù)分析同種真菌不同菌株在不同溫度下昆蟲(chóng)宿主體內(nèi)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】針對(duì)適溫下對(duì)西花薊馬殺蟲(chóng)毒力相似，而高溫下顯著不同的球孢白僵菌兩個(gè)菌株GZGY-1-3和SCWJ-2，在設(shè)定的溫度下，比較兩個(gè)菌株經(jīng)平板培養(yǎng)的菌落直徑和侵染薊馬后在蟲(chóng)體內(nèi)的基因拷貝數(shù)，結(jié)合生物測(cè)定數(shù)據(jù)，分析真菌菌體增殖和殺蟲(chóng)效率間的關(guān)系，以期為提高田間應(yīng)用球孢白僵菌防治西花薊馬的效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2017年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

西花薊馬成蟲(chóng)于2013年采自北京市昌平區(qū)的辣椒上，在室內(nèi)用豆角飼養(yǎng)，置于人工氣候箱內(nèi)（MLR-351H，SANYO Electric Co., Ltd）。飼養(yǎng)溫度（25±1）℃，光周期14L﹕10D，相對(duì)濕度60%—80%。

1.2 供試菌株

球孢白僵菌菌株SCWJ-2和GZGY-1-3分別采集于四川和貴州，現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)分別為CGMCC No.9253和No.9254。試驗(yàn)時(shí)，用無(wú)菌接種環(huán)于斜面上刮下分生孢子，涂于CMA產(chǎn)孢培養(yǎng)基（瓊脂20 g·L-1、硝酸銨1 g·L-1、玉米粉20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、麥麩10 g·L-1、水合硫酸鎂1 g·L-1和硝酸二氫鉀3 g·L-1）上，在恒溫培養(yǎng)箱（GXZ-9240A）光周期12 L﹕12D，（25±1）℃中培養(yǎng)15 d。

孢子萌發(fā)率檢測(cè)：用接種環(huán)刮下2 mg孢子粉置于50 mL的三角瓶中，加入10 mL高溫滅菌的萌發(fā)液（4%葡萄糖，1%酵母提取物，0.05吐溫-80），在（25±1）℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)18 h，于400×顯微鏡（OLYMPUS，BX51）下鏡檢，萌發(fā)率＞90%可用于試驗(yàn)。

孢子懸浮液制備：將孢子加入滅菌的0.05%吐溫-80溶液，配成107個(gè)孢子/mL的懸浮液。

1.3 生物測(cè)定

取約2 000頭西花薊馬成蟲(chóng)置于上述孢子懸浮液中浸泡5 s，對(duì)照組薊馬用0.05%的吐溫溶液處理5 s。用細(xì)毛筆將西花薊馬挑到濾紙上，吸干多余液體，然后轉(zhuǎn)移至放有豆角葉片的培養(yǎng)皿（直徑約為7 cm）中，用保鮮膜密封培養(yǎng)皿，并用細(xì)針頭在保鮮膜上扎孔保持透氣。分別放入20、25和30℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，光周期12 L﹕12D，每天記錄死亡的西花薊馬數(shù)量，并把死亡薊馬挑入一個(gè)墊有濕潤(rùn)濾紙的滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，5—6 d后顯微鏡觀察是否有菌絲長(zhǎng)出，以確定是否為白僵菌侵染致死。連續(xù)記錄8 d，計(jì)算其累積校正死亡率并制作西花薊馬的累積校正死亡率曲線。每個(gè)處理重復(fù)6次，每次100頭西花薊馬。在3個(gè)溫度下，選擇第3天的數(shù)據(jù)（對(duì)照死亡率為2%—5%）比較兩個(gè)菌株殺蟲(chóng)效率。

1.4 菌落直徑測(cè)定

參考TEFERA等[23]的方法，將15 mL的薩氏培養(yǎng)基倒入直徑9 cm的滅菌培養(yǎng)皿冷卻，取50 μl 107個(gè)/mL的球孢白僵菌孢子懸浮液滴于培養(yǎng)基中央，然后分別置于20、25和30℃溫度環(huán)境，光周期14L﹕10D的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天定時(shí)測(cè)量菌落直徑并進(jìn)行比較，每個(gè)溫度下每個(gè)菌株重復(fù)6次。

1.5 西花薊馬體內(nèi)球孢白僵菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

取樣：用上述球孢白僵菌孢子懸浮液處理西花薊馬后，分別放置于20、25和30℃下，于0、24、48和72 h取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100只。提取DNA進(jìn)行后續(xù)絕對(duì)熒光定量試驗(yàn)。

DNA提?。貉心シ椒▍⒖糂ell等[27]，在裝有樣品的研磨管中分別加入0.25 g直徑為0.2 mm的鋯珠和0.8 mm的硅珠，然后放在TissueLyzerTM（Qiagen）組織研磨儀中30 Hz下干磨1 min。研磨期間，為了保持每個(gè)管中真菌都能夠被充分研磨，每隔15 s中斷一次，進(jìn)行研磨管位置的重新調(diào)整。然后加入200μl核裂解液，繼續(xù)如上研磨。研磨結(jié)束，采用Wizard?基因組DNA純化試劑盒（Promega，USA）提取組織體內(nèi)的混合DNA，用Nuclease-Free Water溶解。

標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品定量：通過(guò)球孢白僵菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）與核糖體RNA序列（GenBank登錄號(hào)：AF345539）設(shè)計(jì)qRT-PCR中的引物和探針。探針：6-FAM-ACAGCTCGCACCGGA-MGB；上游引物：5′-GCCGGCCCTGAAATGG-3′；下游引物：5′-GATTCGAGGTCAACGTTCAGAAG-3′。qPCR試驗(yàn)在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System 上運(yùn)行，運(yùn)行體系為20 μl：8 μlNuclease-Free Water，10 μl TaqMan Universal Master Mix Ⅱ，無(wú)UNG，上下游引物各0.5μl，1 μl探針。運(yùn)行過(guò)程：95℃預(yù)變性2 min，95℃15 s，60℃1 min循環(huán)40次。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用無(wú)菌的0.05%吐溫-80配置108個(gè)/mL球孢白僵菌孢子懸浮液，取1 mL至研磨管離心甩去上清，然后按上述方法研磨提取DNA。將提取的108個(gè)GZGY-1-3孢子的DNA按10倍梯度從108逐級(jí)稀釋至102（考慮到試驗(yàn)時(shí)DNA的劑量，100個(gè)孢子的DNA量被認(rèn)為是儀器檢測(cè)的極限），利用qPCR制得。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行絕對(duì)定量。

通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋后測(cè)定了7個(gè)點(diǎn)（108—102）的擴(kuò)增曲線，得出其標(biāo)準(zhǔn)曲線：=-3.353+35.864（2=0.998）。與生物測(cè)定和菌落直徑試驗(yàn)相一致，選取被侵染第3天的薊馬體內(nèi)基因拷貝數(shù)，進(jìn)行同一溫度下兩個(gè)菌株間數(shù)據(jù)比較。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用Abbott公式計(jì)算累積校正死亡率。用SAS 9.2軟件進(jìn)行差異顯著性分析。相同溫度下，第3天兩個(gè)菌株間殺蟲(chóng)毒力差異性、平板培養(yǎng)菌落直徑差異性以及被侵染的西花薊馬體內(nèi)菌體基因拷貝數(shù)的差異性均使用檢驗(yàn)，顯著性水平為＜0.05?；蚩截悢?shù)在數(shù)據(jù)分析前進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。

2 結(jié)果

2.1 球孢白僵菌GZGY-1-3和SCWJ-2菌株殺蟲(chóng)毒力比較

生物測(cè)定結(jié)果顯示，在檢測(cè)溫度（20—30℃）范圍內(nèi)，球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2對(duì)西花薊馬成蟲(chóng)均具有較高致死率。無(wú)論任何溫度和何種菌株，西花薊馬從處理后第2天開(kāi)始死亡，第8天時(shí)，SCWJ-2和GZGY-1-3造成的校正死亡率分別為83%—91%和79%—90%（圖1）。以第3天的校正死亡率為指標(biāo)（對(duì)照死亡率為2%—5%），在適溫（20和25℃）下，兩個(gè)菌株殺蟲(chóng)毒力間沒(méi)有顯著差異，較高溫度（30℃）下菌株SCWJ-2毒力顯著高于GZGY-1-3（＜0.05）（圖2）。

a：20℃；b：25℃；c：30℃

同一溫度下柱上不同字母表示菌株間差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 球孢白僵菌GZGY-1-3和SCWJ-2菌株菌落直徑比較

平板培養(yǎng)結(jié)果顯示，在檢測(cè)溫度（20—30℃）范圍內(nèi)，兩個(gè)菌株菌落直徑隨著時(shí)間推移而增加，第8天時(shí)，菌株SCWJ-2和GZGY-1-3的菌落直徑分別為31—36、28—32 mm（圖3）。對(duì)應(yīng)生物測(cè)定結(jié)果，選取第3天菌落生長(zhǎng)直徑數(shù)據(jù)，在20、25和30℃下，菌株SCWJ-2菌落直徑均顯著大于菌株GZGY-1-3（＜0.05）（圖4）。

2.3 球孢白僵菌GZGY-1-3和SCWJ-2菌株在被侵染的薊馬體內(nèi)基因拷貝數(shù)

如圖5所示，除30℃下的菌株SCWJ-2之外，兩個(gè)菌株在西花薊馬體內(nèi)的基因拷貝數(shù)都在第1天時(shí)下降，2 d后又逐漸上升。使用第3天西花薊馬體內(nèi)的基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示，在同一溫度（20或25℃）下，菌株SCWJ-2和菌株GZGY-1-3在西花薊馬體內(nèi)的基因拷貝數(shù)無(wú)顯著差異，而在30℃下，菌株SCWJ-2的基因拷貝數(shù)顯著高于菌株GZGY-1-3（＜0.05）。

a：20℃；b：25℃；c：30℃

圖3 不同溫度下兩株球孢白僵菌菌株的菌落直徑日生長(zhǎng)

Fig. 3 The daily diameter growth of the two strains ofunder different temperatures

圖4 不同溫度下球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2菌落直徑

3 討論

蟲(chóng)生真菌作為防治害蟲(chóng)的重要生防因子，其殺蟲(chóng)效率受實(shí)際應(yīng)用時(shí)的環(huán)境溫度的影響。環(huán)境溫度通過(guò)影響菌體增殖進(jìn)而影響蟲(chóng)生真菌的殺蟲(chóng)毒力。以前的研究方法中，以顯微鏡法[26]為代表的活體檢測(cè)無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，而離體培養(yǎng)的方式[20-23]不能很好的代表被侵染的寄主體內(nèi)的真菌所處的營(yíng)養(yǎng)或免疫條件[29]。因此，本研究通過(guò)PCR方法檢測(cè)真菌在寄主昆蟲(chóng)體內(nèi)的基因拷貝數(shù)，以檢測(cè)離體平板菌落直徑的方法為對(duì)照，分析其與生物測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系。結(jié)果表明，在3個(gè)溫度下，球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2在蟲(chóng)體內(nèi)的基因拷貝數(shù)差異，而不是平板菌落直徑差異，與生物測(cè)定毒力的差異相一致。在20℃或25℃下兩個(gè)菌株的殺蟲(chóng)效率相似，在30℃下菌株SCWJ-2殺蟲(chóng)效率顯著高于GZGY-1-3，更適于高溫環(huán)境對(duì)西花薊馬的防治。

a：20℃；b：25℃；c：30℃

菌株SCWJ-2在30℃相對(duì)高溫下，殺蟲(chóng)效果顯著高于GZGY-1-3，可能由于其更好的高溫耐受力。考慮到SCWJ-2和GZGY-1-3分別來(lái)自四川和貴州，這兩個(gè)地區(qū)的溫度環(huán)境有一定的差異，菌株來(lái)源地不同可能造成兩者在相對(duì)高溫下耐熱力不同，進(jìn)而造成殺蟲(chóng)毒力的不同。這與俞佳等的結(jié)論基本相似[30-31]。

袁盛勇等[11,32]研究表明，球孢白僵菌菌株MZ041016和MZ060812在孢子濃度分別為3.6×108和3×108個(gè)/mL時(shí)，對(duì)西花薊馬成蟲(chóng)的致死率為分別為82.31%和88.42%；王雅卉等[33]研究表明，菌株CYT4侵染西花薊馬第6天后累積校正死亡率為49.78%。本研究生物測(cè)定結(jié)果顯示，25℃下兩個(gè)菌株在孢子濃度107個(gè)/mL時(shí)，8 d后對(duì)西花薊馬的致死率分別為89%（菌株SCWJ-2）和86%（菌株GZGY-1-3），達(dá)到了對(duì)西花薊馬較好的毒力效果。綜合考慮對(duì)高溫的耐受能力，菌株SCWJ-2和GZGY-1-3是有潛力用于防治西花薊馬的高效菌株[12]。

圖6 不同溫度下球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2侵染西花薊馬3 d后體內(nèi)基因拷貝數(shù)對(duì)數(shù)

白僵菌侵染西花薊馬的實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果表明，與處理 0 h 相比，菌株SCWJ-2和GZGY-1-3的基因拷貝數(shù)大部分在處理24 h時(shí)下降，而處理48和72 h時(shí)開(kāi)始回升。侵染初期孢子拷貝數(shù)下降可能與以下因素有關(guān)：（1）薊馬的活動(dòng)將體表部分孢子抖落；（2）孢子穿透昆蟲(chóng)表皮所造成的損耗。Anderson等[28]在研究球孢白僵菌和綠僵菌感染家蠅（）時(shí)也發(fā)現(xiàn)了相似的生長(zhǎng)模式。而30℃下菌株SCWJ-2拷貝數(shù)在24 h時(shí)并未下降反而上升，這可能是由于30℃為菌株SCWJ-2的適宜溫度，宿主體內(nèi)的真菌增殖彌補(bǔ)了體表真菌的損失和消耗。

30℃下，菌株SCWJ-2在薊馬體內(nèi)的拷貝數(shù)顯著高于GZGY-1-3，這與前者比后者具有更高的殺蟲(chóng)毒力這一生物測(cè)定結(jié)果相一致。在20或25℃下，兩個(gè)菌株在蟲(chóng)體內(nèi)拷貝數(shù)和生物測(cè)定毒力方面結(jié)果一致，均無(wú)顯著差異，這說(shuō)明在一定程度上，菌株在宿主昆蟲(chóng)體內(nèi)增殖的差異性決定了菌株的毒力不同。此外，真菌在昆蟲(chóng)體內(nèi)增殖時(shí)，還會(huì)產(chǎn)生毒素等[34]，這是否也會(huì)導(dǎo)致不同溫度下不同菌株毒力的差異，還需進(jìn)一步研究。

菌落直徑（真菌在寄主體外生長(zhǎng)）檢測(cè)結(jié)果顯示，在3個(gè)檢測(cè)溫度下，菌株SCWJ-2菌落直徑均大于GZGY-1-3，20℃和25℃下兩個(gè)菌株的菌落直徑差異性與生物測(cè)定結(jié)果不一致，只有在30℃下與生物測(cè)定結(jié)果相一致。可見(jiàn)，檢測(cè)離體情況下平板培養(yǎng)的真菌菌落直徑這一方法有一定的局限性。真菌在入侵到昆蟲(chóng)體內(nèi)時(shí)，會(huì)接觸到昆蟲(chóng)血腔中特有的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境[35]和免疫響應(yīng)系統(tǒng)[25,36]，這是與離體培養(yǎng)基所提供的環(huán)境截然不同的。此外，溫度對(duì)平板培養(yǎng)的真菌菌落直徑的影響通常選取的是第7—10天的數(shù)據(jù)[19,37-38]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了真菌在昆蟲(chóng)體內(nèi)的增殖時(shí)期。因此，真菌在活體昆蟲(chóng)內(nèi)的增殖很難用體外平板上菌落直徑這一數(shù)據(jù)來(lái)準(zhǔn)確描述。與之相比，不同溫度下宿主昆蟲(chóng)體內(nèi)真菌的基因拷貝數(shù)更好地解釋了耐熱性不同菌株殺蟲(chóng)效率的差異。

4 結(jié)論

在適溫下，球孢白僵菌菌株GZGY-1-3和SCWJ-2均對(duì)西花薊馬有較好的殺蟲(chóng)效率。在較高的溫度下，菌株SCWJ-2比GZGY-1-3在被侵染的薊馬體內(nèi)基因拷貝數(shù)更大，引起的校正死亡率更高，更適合高溫季節(jié)對(duì)西花薊馬進(jìn)行生物防治。真菌在蟲(chóng)體內(nèi)的基因拷貝數(shù)很好地解釋了不同菌株和不同溫度條件引起的殺蟲(chóng)毒力的差異。結(jié)果為球孢白僵菌在高溫季節(jié)防治西花薊馬的可行性提供了理論支持。

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growth kinetics and virulence of TwoStrains inunder different temperatures

LIU Xiaochen, WU Shengyong, LEI Zhongren, WANG Haihong

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193)

【Objective】The objective of this study is to compare the growth kinetics and virulence of two strains ofinfected Western flower thrips () under different temperatures, analyze the relationship between the proliferation and insecticidal virulence of, and to provide a theoretical support for improving the efficiency ofagainst.【Method】Firstly, from 1st to 8th day, the mortality of the infectedwith two strains of(SCWJ-2 and GZGY-1-3) under 20, 25, and 30℃ was recorded, and cumulative corrected mortality was calculated while uninfectedwas used as control. The mortality ofinfected with the two strains at the 3rd day (the mortality of control was 2%-5%) was compared. Secondly, under 20, 25 and 30℃, the colony diameter of the two strains was recorded continuously from 1st to 8th day. The colony diameter of the two strains at the 3rd day was compared. Finally, the DNA mixture ofinfected with fungi from 1st to 3rd day under 20, 25 and 30℃ was extracted, respectively. The real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to quantify the copy number of fungi within each insect host sample. The gene copy of two strains under the same temperature at the 3rd day was compared. 【Result】The bioassay results ofagainstshowed that within the tested temperature range (20-30℃), both strains GZGY-1-3 and SCWJ-2 were highly lethal toadults. No matter what the temperature or the strain, the dead individualsappeared from the 2nd day after treatment. On the 8th day, the corrected mortality ofinfected by strain SCWJ-2 and GZGY- 1-3 was 83%-91% and 79%-90%, respectively. The corrected mortality ofinfected by the two strains on the 3rd day was compared (the morality of control were 2%-5%). the virulence of strain SCWJ-2 was significantly higher than that of GZGY-1-3 under 30℃(＜0.05), but there was no significant difference between them under 25 and 20℃(＞0.05). Within the tested temperature range from 20 to 30℃, the colony diameter of two strains increased with time. On the 8th day, the colony diameter of the strains SCWJ-2 and GZGY-1-3 was 31-36 and 28-32 mm, respectively. On the 3rd day, the colony diameter of strain SCWJ-2 was significantly larger than that of strain GZGY-1-3 under all test temperatures(＜0.05). The results of qRT-PCR showed that, with the exception of strain SCWJ-2 at 30℃, the gene copy number of both strains indecreased on the 1st day and gradually increased after 2 days at all the three temperatures. The gene copy number of strain SCWJ-2 withinwas significantly higher than that of strain GZGY-1-3 under 30℃(＜0.05), but there was no significant difference between them under 25 and 20℃(＞0.05). 【Conclusion】 The number of fungal gene copies within insect host was affected by strains and temperatures, which is in accordance with the result of bioassay. Compared withstrain GZGY-1-3, strain SCWJ-2 is more suitable for controllingunder high temperatures.

;; fungal growth kinetics; real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR)

（責(zé)任編輯 岳梅）

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.006

2017-10-30；

2017-11-21

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0201205）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-25-B-07）

劉曉晨，E-mail：1804486941@qq.com。

雷仲仁，Tel：010-62815930；E-mail：leizhr@sina.com。通信作者王海鴻，Tel：010-62815930；E-mail：wanghaihong2020@sina.com