于青林，孟令莉，霍海亮，高翠娟

(臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂，276000)

琥珀酸是一種具有重要應(yīng)用價值的生物基平臺化合物，被美國能源部認為是未來十二組最具價值的生物煉制產(chǎn)品之一[1]，廣泛地應(yīng)用于清潔劑、表面活性劑、食品添加劑、抗菌劑，并用于合成γ-丁內(nèi)酯、四氫呋喃等多種重要化學(xué)品[2]。同時，作為一種重要的有機合成中間體，琥珀酸還是合成多種聚酯的重要前體物質(zhì)[3]，近年來逐漸攀升為大宗化學(xué)品，全球年產(chǎn)量在3萬～5萬t[4]。傳統(tǒng)的化學(xué)法合成琥珀酸需要金屬Pd和Ru的催化，通過丁烷制備順式丁烯二酸酐再經(jīng)化學(xué)方法加工而成[5]。由于石油資源的減少和環(huán)境污染問題的日益嚴重，資源可再生的、高效環(huán)保的琥珀酸生產(chǎn)方式愈來愈受到關(guān)注。琥珀酸是微生物細胞中心代謝三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA)的中間代謝產(chǎn)物之一，并且還是多種兼性厭氧菌和嚴格厭氧菌的代謝末端產(chǎn)物，可以通過微生物利用可再生的碳水化合物資源進行生產(chǎn)[6-8]。

解脂酵母(Yarrowialipolytica)屬于非傳統(tǒng)酵母，具有生物安全(generally recognized as safe, GRAS)、魯棒性的特點[9]。經(jīng)過遺傳改造后的解脂酵母可以作為細胞工廠有效生產(chǎn)許多高附加值的化學(xué)品和脂肪/脂肪酸衍生的燃料，如檸檬酸、異檸檬酸、α-酮戊二酸等[10-13]。2009年，KAMZOLOVA等人利用構(gòu)建好的產(chǎn)α-酮戊二酸解脂酵母首先生產(chǎn)α-酮戊二酸，再以乙醇為底物在過氧化氫存在的情況下脫羧生產(chǎn)琥珀酸，琥珀酸的產(chǎn)量為63.4 g/L[14]。2010年，YUZBASHEV 等人首先突變解脂酵母的琥珀酸脫氫酶Sdh2亞基，然后采用N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍進行化學(xué)誘變，獲得的突變株Y-3314以甘油為底物、碳酸鈣為緩沖劑進行低pH琥珀酸發(fā)酵，得到45 g/L的琥珀酸鹽[15]。筆者實驗室通過基因敲除琥珀酸脫氫酶Sdh5亞基成功獲得可產(chǎn)琥珀酸的重組解脂酵母PGC01003，該重組酵母在琥珀酸發(fā)酵的同時還產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物乙酸[16]。隨后，在PGC01003的基礎(chǔ)上進一步敲除乙酰輔酶A水解酶編碼基因ach1，獲得重組酵母PGC11505，乙酸溢出得到有效控制[17]。本研究以重組酵母PGC11505為宿主，甘油作底物，對生產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速、通氣量、初始甘油質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度以及發(fā)酵罐的pH控制進行優(yōu)化,重組酵母琥珀酸產(chǎn)量得到明顯提高，為工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母粉、蛋白胨，均為OXOID公司；甘油(分析純)，天津大茂化學(xué)試劑廠；重組解脂酵母(Yarrowialipolytica)PGC11505為本研究室保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

2.5 L發(fā)酵罐，德國貝朗醫(yī)療有限公司；0.22 μm水溶性濾膜，天津市東康科技有限公司；高壓液相色譜，日本島津公司；UV-1800分光光度計，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養(yǎng)與發(fā)酵

采用YPG(酵母粉10 g/L、蛋白胨 20 g/L、甘油20 g/L)培養(yǎng)種子，發(fā)酵培養(yǎng)基含酵母粉10 g/L、蛋白胨和甘油的質(zhì)量濃度除特殊說明分別為20 g/L和100 g/L。所有培養(yǎng)基在121℃滅菌20 min。從固體平板上刮取適量菌苔至內(nèi)含50 mL YPG的250 mL錐形瓶，28℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，然后無菌接種至發(fā)酵罐。依次對轉(zhuǎn)速、溶氧、碳源質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度、發(fā)酵罐的pH值進行優(yōu)化。定時取樣測菌體濃度、發(fā)酵上清液的甘油與有機酸質(zhì)量濃度。補料分批發(fā)酵的初始甘油質(zhì)量濃度為100 g/L，不控制發(fā)酵罐的pH值、28 ℃、600 r/min、1 vvm，當(dāng)甘油質(zhì)量濃度低于20 g/L時補加80 mL質(zhì)量濃度為750 g/L的甘油母液。

1.3.2 分析方法

采用分光光度計測定600 nm的菌體吸光值，然后依據(jù)菌體OD值與菌體干重(DCW)之間的線性關(guān)系進行換算。甘油、琥珀酸、乙酸質(zhì)量濃度采用高壓液相色譜進行測定。具體操作為，1 mL發(fā)酵液離心后取上清液，用0.22 μm水溶性濾膜過濾，加至高壓液相色譜專用的小瓶內(nèi)，放置在自動進樣器中。色譜柱為美國伯樂Aminex HPX-87H 糖分析柱，檢測器為示差折光檢測器，流動相為5 mmol/L稀H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫箱的溫度設(shè)定在65 ℃。利用發(fā)酵罐的在線自動pH值監(jiān)測系統(tǒng)記錄發(fā)酵液的pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶氧對琥珀酸產(chǎn)量的影響

解脂酵母是嚴格好氧菌，氧氣對菌體生長和產(chǎn)物合成都非常重要。影響溶氧的主要因素是發(fā)酵罐內(nèi)置擋板的轉(zhuǎn)速和通氣量。首先實驗了不同轉(zhuǎn)速和通氣量對琥珀酸產(chǎn)量的影響(圖1)。經(jīng)過72 h發(fā)酵，轉(zhuǎn)速400和600 r/min的菌體生物量為6.2和14.2 g/L(以DCW計)，分別產(chǎn)生了1.3和1.5 g/L乙酸，證實重組解脂酵母PGC11505的乙酸溢出得到有效控制。轉(zhuǎn)速為600 r/min時，重組菌PGC11505可消耗52.0 g/L甘油產(chǎn)生17.0 g/L琥珀酸，而轉(zhuǎn)速為400 r/min時只消耗了21.9 g/L甘油產(chǎn)生8.3 g/L琥珀酸。較高的轉(zhuǎn)速可以提供更充分的溶氧，利于菌體生長和琥珀酸的生產(chǎn)。

圖1 發(fā)酵罐不同轉(zhuǎn)速對琥珀酸發(fā)酵的影響
Fig.1 Influence of speed of revolution on succinic production of Y. lipolytica

通氣量分別為0.5、1.0、2.0 vvm時對琥珀酸發(fā)酵的影響見圖2。通氣量對重組菌PGC11505的甘油消耗、菌體生長及琥珀酸發(fā)酵影響較小。重組解脂酵母PGC11505在發(fā)酵72 h后，菌體生物量依次為17.7、21.9、21.0 g/L，分別產(chǎn)生了18.6、20.1、19.7 g/L琥珀酸。從節(jié)能和琥珀酸的產(chǎn)量綜合考量，確定1.0 vvm為最適通氣量。

a-不同發(fā)酵時間的甘油濃度；b-不同發(fā)酵時間的菌體干重；c-不同發(fā)酵時間的琥珀酸產(chǎn)物濃度
圖2 不同通氣量對琥珀酸發(fā)酵的影響
Fig.2 Influence of various aeration rates on succinic production of Y. lipolytica

2.2 初始甘油濃度對琥珀酸產(chǎn)量的影響

解脂酵母具有較高的滲透壓耐受性，然而初始碳源濃度過高可能會產(chǎn)生底物抑制，菌體分泌甘露醇、赤蘚糖醇等多元醇以對抗高滲透壓。本組實驗比較了初始甘油質(zhì)量濃度為50、100、150 g/L對琥珀酸發(fā)酵的影響。圖3顯示不同初始甘油質(zhì)量濃度對琥珀酸發(fā)酵的影響較大。甘油質(zhì)量濃度為50 g/L時，菌體在40 h消耗全部甘油，產(chǎn)生14.2 g/L琥珀酸。隨著甘油質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵周期延長，菌體生物量和琥珀酸產(chǎn)量也相應(yīng)的提高。甘油初始質(zhì)量濃度為100 g/L時，22.6 g/L菌體發(fā)酵72 h產(chǎn)生20.1 g/L琥珀酸。當(dāng)甘油質(zhì)量濃度增加至150 g/L時，發(fā)酵98 h仍殘余69.3 g/L的甘油，菌體生長受到抑制，生長差，最大生物量為19.0 g/L，琥珀酸產(chǎn)量為21.0 g/L。初始甘油質(zhì)量濃度為100 g/L能保證菌體較好的生長，并且發(fā)酵較充分，獲得較高的琥珀酸產(chǎn)量。

a-不同發(fā)酵時間的甘油濃度；b-不同發(fā)酵時間的菌體干重；c-不同發(fā)酵時間的琥珀酸產(chǎn)物濃度
圖3 不同初始甘油質(zhì)量濃度發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸比較
Fig.3 Succinic acid production from various concentrations of glycerol

2.3 蛋白胨含量對琥珀酸產(chǎn)量的影響

作為構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的材料，微生物生長和產(chǎn)物合成需要充足的氮源。氮源過低菌體生長代謝差，過高則造成營養(yǎng)物質(zhì)的浪費，因此合適的碳氮比對發(fā)酵至關(guān)重要。本實驗固定甘油質(zhì)量濃度為100 g/L，比較了蛋白胨的添加質(zhì)量濃度為0、10、20 g/L對琥珀酸發(fā)酵的影響。由表1可見，不添加蛋白胨菌體生長差，消耗的甘油量較少，只生產(chǎn)9.9 g/L琥珀酸。蛋白胨質(zhì)量濃度為10 g/L和20 g/L菌體生長良好，菌體量分別為18.6 g/L和17.9 g/L，分別產(chǎn)生20.3 g/L和20.7 g/L琥珀酸。另外，蛋白胨含量較高時的乙酸產(chǎn)量也升高。因此，選擇10 g/L蛋白胨作為后續(xù)實驗的適宜質(zhì)量濃度。

表1 添加不同蛋白胨對琥珀酸發(fā)酵的影響Table 1 Succinic acid production in medium containingvaried concentraitons of peptone

2.4 發(fā)酵液pH對琥珀酸產(chǎn)量的影響

為減少弱酸環(huán)境對有機酸發(fā)酵的影響，通常采用控制發(fā)酵液pH值接近中性的策略進行琥珀酸發(fā)酵[15]。然而近中性環(huán)境的發(fā)酵產(chǎn)物是琥珀酸鹽而非琥珀酸，并且發(fā)酵過程需要持續(xù)流加堿液以調(diào)節(jié)pH值，增大了發(fā)酵過程染菌的概率和發(fā)酵后提取的工序。鑒于解脂酵母的魯棒性，我們比較分析了不同pH值條件下PGC11505的琥珀酸發(fā)酵，發(fā)酵罐的pH值分別控制在4.0、5.0、6.0以及不控制pH的自然pH值(圖4)。發(fā)酵罐pH值設(shè)定為6.0的實驗組，重組菌PGC11505消耗了最多的甘油、積累最高的菌體(42.4 g/L)，產(chǎn)生22.1 g/L琥珀酸。發(fā)酵罐pH值較低的實驗組(pH 4.0、pH 5.0)，初始pH值較低的環(huán)境不利于菌體的快速生長與琥珀酸合成代謝，菌體量和琥珀酸的質(zhì)量濃度都偏低。發(fā)酵罐自然pH值發(fā)酵組，在發(fā)酵初始階段發(fā)酵液的pH值接近中性(pH6.5)，這對菌體快速進入指數(shù)生長期有利。隨著菌體生長和發(fā)酵的進行，菌體進入旺盛的合成代謝階段，琥珀酸不斷積累，生產(chǎn)高達26.3 g/L琥珀酸。這充分表明，重組解脂酵母可以耐受天然的弱酸性環(huán)境，適合在自然低pH值下進行琥珀酸發(fā)酵。

圖4 不同pH值對琥珀酸發(fā)酵的影響
Fig.4 Succinic acid production under varied pH conditions

2.5 補料分批琥珀酸發(fā)酵

最后，根據(jù)上述實驗確定的最適條件進行不控制pH值的補料分批發(fā)酵。如圖5所示，發(fā)酵初始時pH值為6.5，24 h即降至4.5，48 h后持續(xù)維持在3.5左右。乙酸積累量始終低于0.5 g/L。菌體生長曲線表明，重組菌PGC11505在自然弱酸性條件下生長良好，最高菌體量為26.8 g/L DCW。經(jīng)過2次補料共消耗192.5 g/L甘油，合成46. 9 g/L琥珀酸，琥珀酸對甘油的產(chǎn)率為0.24 g/g，生產(chǎn)率為0.34 g/(L·h)。琥珀酸的產(chǎn)量較優(yōu)化之前提高了4.7倍。

圖5 重組解脂酵母PGC11505自然低pH值琥珀酸發(fā)酵情形
Fig.5 Fed-batch fermentation profile of engineered Y. lipolytica PGC11505 under natural low pH

3 結(jié)論

琥珀酸是一種重要的有機合成中間體。通過2.5 L發(fā)酵罐對重組解脂酵母PGC11505的琥珀酸發(fā)酵的發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速、通氣量、初始甘油質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度、發(fā)酵罐的pH值設(shè)置優(yōu)化后，琥珀酸的產(chǎn)量提高4.7倍。其中，發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速600 r/min好于400 r/min，通氣量為1.0 vvm時最佳。初始甘油質(zhì)量濃度設(shè)定為100 g/L能保證菌體較好的生長，并且發(fā)酵充分。蛋白胨的質(zhì)量濃度為10.0 g/L較適宜。不控制pH值的自然發(fā)酵獲得最高的琥珀酸產(chǎn)量和產(chǎn)率，分別為26.3 g/L和0.27 g/g。經(jīng)過138 h補料-分批發(fā)酵，共消耗192.5 g/L甘油，合成46. 9 g/L琥珀酸，產(chǎn)率為0.24 g/g，生產(chǎn)率為0.34 g/(L·h)。本研究表明，解脂酵母作為魯棒性微生物，可以在不調(diào)節(jié)pH值的自然低pH值環(huán)境進行琥珀酸發(fā)酵，具備工業(yè)化生產(chǎn)琥珀酸的潛力。然而，實驗中還發(fā)現(xiàn)，重組解脂酵母PGC11505除了合成琥珀酸之外，還通過磷酸戊糖途徑產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物赤蘚糖醇。赤蘚糖醇的生成造成底物甘油的浪費，影響甘油對琥珀酸的產(chǎn)率，這也為下一步的菌株改造提供了新的研究思路和方向。