張國麗，楊陳文，余茜，陳安均，劉書亮,2，敖曉琳,2*

1(四川農業(yè)大學 食品學院，四川 雅安，625000)2(四川農業(yè)大學 食品加工與安全研究所，四川 雅安，625000)

植物乳桿菌在發(fā)酵食品中應用十分廣泛，其生理活性以及穩(wěn)定性對食品加工有著重要影響。高溫會導致蛋白質變性，膜結構破壞以及核酸分子受損等。在植物乳桿菌的工業(yè)應用過程中常常會伴隨一些高溫的過程，如噴霧干燥、巴氏滅菌等，此外熱耐受還與植物乳桿菌的長期保藏成正相關。因此提高乳桿菌的耐受能力對于提高植物乳桿菌的商業(yè)價值有重要意義。

1978年美國學者COSTERTON提出了生物膜(Biofilm)這一專有名詞[1-2]，它主要是由附著于生物或者非生物實體表面的細菌細胞和包裹著細菌的基質所組成。當細菌受到各種脅迫，如營養(yǎng)缺乏或營養(yǎng)過剩，低pH值，高滲透壓，抗菌劑和抗生素等，在這些不利的環(huán)境下，大量的細菌通過自身合成的水合多聚物粘附在固體表面，以固著的方式生長從而形成生物膜。這是細菌所具有的一種非常重要的環(huán)境適應機制[3]。

生物膜在食品加工與安全領域具有重要的研究價值，生物膜的形成能促進有益微生物對不利環(huán)境的適應能力，使其具有良好的穩(wěn)定性，可解決發(fā)酵劑不穩(wěn)定等食品工業(yè)中的實際問題。但食品工業(yè)的原輔料、食品加工機械表面和管道內以及生產(chǎn)環(huán)境中很容易出現(xiàn)生物膜，生物膜的特殊結構可以使其耐受消毒劑的作用而得以殘存，進而可以再次污染食品，如果是病原菌，則可能造成極大的食品安全隱患[4-5]。

細菌在受到不同程度的環(huán)境因子刺激，如熱、酸、鹽等刺激，應激蛋白在細胞生長、發(fā)育、分化過程中的基因轉錄、蛋白質合成、折疊、跨膜運輸、分解和立體構象的維持等方面發(fā)揮重要作用，可抵御不良環(huán)境，典型代表為熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)，該蛋白廣泛分布于微生物、動物、植物等各種生物體內，其中DnaK、GroEL熱激蛋白，可通過調節(jié)蛋白質修復和折疊作用，從而保護蛋白質形態(tài)、功能特性[6]，與生物膜的形成息息相關。

本試驗研究了植物乳桿菌PG3-1生物膜形成后對其耐受性的影響，并從基因表達水平分析解釋該類現(xiàn)象，為更好的發(fā)揮植物乳桿菌的益生功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌(LactobacillusplantarumPG3-1，NCBI登錄號：AB617650)，分離自傳統(tǒng)制作的泡菜老鹽水中，具有優(yōu)良的發(fā)酵性能。

MRS肉湯、試驗培養(yǎng)基(牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，葡萄糖20 g，檸檬酸5 g，胰蛋白胨25 g，果膠0.5 g，氯化鈉40 g，乳粉15 g，蒸餾水1 000 mL)，瓊脂糖等，以上生化試劑均為國產(chǎn)分析純或市售。

試劑盒：Biozol RNA Mini Kit，Biomiga公司；HisScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，Vazyme 公司；2×SYBR Mixture，熒光定量PCR板膜，Biomiga公司；96孔細胞培養(yǎng)板，Haimen Boyang儀器設備公司。

1.2 儀器與設備

3001型酶標儀，Thermo Scientific 公司；BPC-250F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；DHG-9245A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈操作臺，蘇州凈化；SYQ-DSX-280B壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-4C+酸度計，成都世紀方舟科技有限公司；D2KW-5-4電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；CFX Connect Real-time PCR儀，BIO-RAD公司；Gel Doc XR凝膠成像儀，BIO-RAD公司；SORVALL高速離心機，美國科駿儀器有限公司；DY-A電泳儀，上?？颠_儀器廠。EVO18掃描電鏡，Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌生物膜形成菌株和浮游菌株的制備

生物膜菌株(實驗組)：將過夜活化培養(yǎng)后的植物乳桿菌按5×107CFU/mL接入試驗培養(yǎng)基，振蕩搖勻后按照每孔200 μL的添加量添加到96孔板中42 ℃培養(yǎng)36 h。該接種和培養(yǎng)條件參照實驗室前期試驗結果。以相應等體積空白培養(yǎng)基作為陰性對照。

浮游菌株(對照組)：將活化后的植物乳桿菌按1×105CFU/mL接入MRS肉湯培養(yǎng)基，振蕩搖勻后按照每孔200 μL的添加量添加到96孔板中37 ℃下培養(yǎng)36 h。以相應等體積空白培養(yǎng)基作為陰性對照。

1.3.2 植物乳桿菌生物膜的定量測定

培養(yǎng)完成之后的培養(yǎng)液倒出，每孔加入200～300 μL無菌水清洗，將結合不緊密及游離菌體清除。風干后加入0.5%結晶紫染液50 μL染30 min。倒掉染液，每孔加入250 μL無菌水洗3次。風干后采用酶標儀檢測490 nm處OD值。以A490值定量生物膜形成量，A490小于等于0.17時表明無生物膜形成，A490大于0.34時表明生物膜大量形成[7]。

1.3.3 植物乳桿菌生物膜的形態(tài)觀察

將約1 cm×1 cm經(jīng)過70%酒精浸泡、清潔的蓋玻片置于培養(yǎng)基中，讓植物乳桿菌在培養(yǎng)過程中自然黏附聚集在玻片上，培養(yǎng)完成之后取出玻片，置于2%戊二醛磷酸緩沖液中，于4 ℃冰箱中固定過夜，次日以磷酸緩沖液沖洗，分別用40%、70%、90%、100%的乙醇依次脫水，每次15 min。脫水后，用醋酸戊酯置換乙醇，再進行干燥、鍍金及掃描電鏡觀察[8]，觀察生物膜形成情況，以浮游菌株作為對照。

1.3.4 植物乳桿菌生物膜耐受性的測定

同一批次培養(yǎng)多管實驗組和對照組菌株，實驗組單獨通過離心、沖洗、濃縮、打散、重懸等一系列過程，測定對照組及實驗組初始活菌數(shù)。

(1)對溫度的耐受性：參照司淼菲[9]的方法，參考初始活菌數(shù)將實驗組與對照組分別按106CFU/mL接種量接種到5 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，然后分別在50 、55 、60 、65 、70 ℃水浴條件下靜置1 h，進行平板活菌計數(shù)，比較生物膜菌株和浮游菌株對溫度耐受性的差異，每組3個平行。

(2)對酸堿度的耐受性：參照KUBOTA[10]的方法，將實驗組和對照組分別按106CFU/mL的接種量分別接種到pH值2、3、4、8、9、10的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置處理2 h，進行平板活菌計數(shù)，比較生物膜菌株和浮游菌株對酸堿度耐受能力的差異，每組3個平行。

(3)對鹽度的耐受性：將實驗組與對照組分別按106CFU/mL接種量分別接種到添加有6%、8%、10%、12%、14% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置處理2 h，進行活菌計數(shù)，比較生物膜菌株和浮游菌株對不同鹽度耐受能力的差異，每組3個平行。

1.3.5 生物膜菌株和浮游菌株功能基因相對表達量的測定

分別提取植物乳桿菌生物膜菌株和浮游菌株總RNA。提取的樣品經(jīng)紫外分光光度計檢測達到OD260/OD280為1.8～2.0，保存于-20 ℃冰箱中備用。

逆轉錄：將所得RNA采用試劑盒轉錄成cDNA，保存于-20 ℃冰箱中備用。體系(20 μL)：2×RTmix 10 μL，酶2 μL，寡核苷酸1 μL，隨機六聚體1 μL，RNA模板6 μL。

逆轉錄反應程序：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。

引物設計：根據(jù)根據(jù)Gene Bank提供的GroEL、Dank基因序列，應用Oligo軟件，設計了針對特異性定量引物用于實時熒光定量PCR反應，以16S rRNA作為內參基因[11]，引物信息如表1。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

表1 引物信息表Table 1 Primer information table

實時熒光定量PCR擴增體系：SYBR 2×5μL ，上游引物0.2 μL(10 μmol/L)，下游引物0.2 μL(10 μmol/L) ，梯度稀釋cDNA模板0.4 μL，ddH2O補足至10 μL。

反應程序：95 ℃預變性10 min ，95 ℃變性15 s，退火1 min，40個循環(huán)。反應結束后記錄CT值，每個處理3次重復。溶解曲線：95 ℃，10 s；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。

相對表達量計算：采用EXCEL以及SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析?；蛳鄬Ρ磉_量的計算采用2-ΔΔCt方法進行分析[12]。其中：

相對表達量 = 2-ΔΔCt

(1)

ΔΔCt =(Ct實驗組-Ct實驗組內參)-(Ct對照組-Ct對照組內參)

(2)

2 結果與分析

2.1 生物膜菌株的測定結果

經(jīng)測定，實驗組A490值為4.492 3，對照組A490值為0.136 5。對具有成熟生物膜的植物乳桿菌和浮游菌株進行掃描電鏡觀察，所形成的生物膜較游離菌體具有大量的胞外聚合物包被，整個膜有孔洞，具有典型的生物膜結構(圖1-b)，對照組中植物乳桿菌菌體形態(tài)清晰可見，沒有包被物，菌體呈游離狀態(tài)(圖1-a)。

圖1 植物乳桿菌生物膜以及游離菌體掃描電鏡圖
Fig.1 SEM of biofilm and planktonic L. plantarum

2.2 生物膜形成對植物乳桿菌耐受性的影響

2.2.1 生物膜形成對植物乳桿菌酸堿耐受性的影響

環(huán)境pH值對微生物的生長至關重要，可以通過影響細胞膜表面電荷的性質及通透性從而影響對物質的吸收能力，或者通過改變酶活、酶促反應等影響新陳代謝。酸性條件是乳酸菌自然發(fā)酵過程中的重要環(huán)境特征。乳桿菌發(fā)酵的主要產(chǎn)物乳酸的pKa=3.86，細胞內的乳酸分子通過去游離化和游離化作用來調控細胞從對數(shù)生長期進入穩(wěn)定生長期，但是作為益生菌的乳桿菌服用后經(jīng)過胃部到達腸前時將會經(jīng)受極端的酸性條件。堿性條件下則不利于乳酸菌的生長繁殖，本試驗對植物乳桿菌生物膜形成后對偏酸和偏堿環(huán)境的耐受能力均進行了測定，結果如圖2所示，隨著酸度或堿度的增大，實驗組和對照組的耐受能力均下降，在不利的環(huán)境因素下，微生物的存活受到威脅，但實驗組總體上較對照組表現(xiàn)出更佳的耐受能力，表明生物膜形成之后，植物乳桿菌對酸堿的耐受能力有所提高，可有利于使用植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)一些酸度較高的食品，該試驗結果與HIROMI[10]等的試驗結果類似。在pH值小于3的范圍內，實驗組與對照組的存活率都很低，實驗組沒有明顯的優(yōu)勢，表明生物膜結構在極端環(huán)境中也會被破壞，失去對菌體的保護作用。

圖2 生物膜形成菌株與浮游菌株的酸堿耐受性
Fig.2 the tolerance to pH of biofilm and planktonic L. plantarum
(不同大小寫字母代表差異顯著，p<0.05)

2.2.2 生物膜形成對植物乳桿菌溫度耐受性的影響

高溫會影響菌株的生長和代謝，對于大多數(shù)乳酸菌在60 ℃左右就會死亡。生物膜形成對植物乳桿菌溫度耐受性的影響結果如圖3所示。

圖3 生物膜形成菌株與浮游菌株對溫度的耐受性
Fig.3 the tolerance to temperature of biofilm and planktonic L. plantarum
(不同大小寫字母代表差異顯著，p<0.05)

隨著溫度的升高，對照組和實驗組的存活率均下降，但是生物膜形成菌株在同樣溫度下較之于浮游菌株具有更好的耐受性，最高耐受溫度提高至70 ℃，可能原因是在生物膜培養(yǎng)過程中受到較高溫度的刺激與誘導，提高了植物乳桿菌的熱應激能力，在經(jīng)過熱適應之后具有更好的溫度耐受性。當溫度達到65 ℃及以上時，實驗組與對照組存活率都很低，表明生物膜的保護作用具有一定限度。在益生菌發(fā)酵食品中，某些產(chǎn)品需要經(jīng)過簡單的巴氏滅菌處理來殺滅導致腐敗的雜菌，但是在殺滅雜菌的同時也會導致益生菌的死亡，若能利用植物乳桿菌生物膜形成的保護作用提高其對溫度的耐受性，就可以通過低溫殺菌方式殺滅腐敗微生物，有益微生物可以存在于食品之中。

2.2.3 生物膜形成對植物乳桿菌鹽度耐受性的影響

植物乳桿菌生物膜形成對鹽度耐受性的影響如圖4所示，隨著鹽濃度的增加，對照組與實驗組的存活率均下降，但實驗組總體的耐受性高于對照組，表明植物乳桿菌生物膜形成之后對鹽度的耐受性有所提高。在發(fā)酵高鹽度食品時，利用植物乳桿菌生物膜形成的保護作用能夠很好的耐受高鹽度，有利于發(fā)酵的順利進行。

圖4 生物膜形成菌株與浮游菌株對鹽度的耐受性
Fig.4 The tolerance to NaCl of biofilm and planktonic L. plantarum
(不同大小寫字母代表差異顯著，p<0.05)

植物乳桿菌在自然生長過程中通常會暴露在一定濃度的鹽溶液中，而細胞質的濃度須與外界保持一致。當菌體突然暴露在高滲環(huán)境(如高濃度的鹽溶液)中時，環(huán)境滲透壓的改變會影響細胞的重要生理功能，細菌為了存活則需要適應這種環(huán)境變化，細胞會通過向胞外運輸水分，從而改變胞內滲透壓和細胞體積來適應高滲環(huán)境。而生物膜形成的保護結構可能在一定程度上減少了高鹽濃度的進入來應對這種環(huán)境脅迫。

2.3 功能基因相對表達量的確定

2.3.1 內參基因的擴增

將cDNA模板分別稀釋0，10，102，103，104，105，106，107倍，按照體系進行熒光定量PCR，確定最佳稀釋倍數(shù)為100倍。通過內參基因的溶解曲線(圖5)可以觀察到在80～85 ℃之間出現(xiàn)單一的峰，沒有雜峰出現(xiàn)，溶解峰對應的值與擴增產(chǎn)物的理論非常接近，證明內參基因擴增產(chǎn)物為單一特異性產(chǎn)物。實時反轉PCR受到RNA的不穩(wěn)定性，RNA提取方法的不穩(wěn)定性，逆轉效率和PCR效率等因素的影響。本實驗采用保守的基因作為內參(16S rRNA)對定量方法進行標準化來消除上述因素對結果的影響。

圖5 內參基因溶解曲線
Fig.5 Melt curve of reference gene

2.3.2 目的基因擴增結果

通過圖6和圖7可以觀察到目的基因在75～80 ℃出現(xiàn)單一的峰，目的基因的引物特異性較好，沒有雜峰和引物二聚體的岀現(xiàn)，溶解峰對應的值與擴增產(chǎn)物的理論值非常接近，表明目的基因擴增產(chǎn)物為單一特異性產(chǎn)物。

圖6 GroEL基因溶解曲線
Fig.6 Melt curve of GroEL gene

圖7 DanK基因溶解曲線
Fig.7 Melt curve of DanK gene

M-2 000 bp的DNA標記； 1-2-16S rRNA內參基因；3-DanK基因
圖8 內參基因及DanK基因擴增結果
Fig.8 Electrophoresis results of reference gene and DanK gene

M-2 000 bp的DNA標記； 3-4-GroEL 基因
圖9 GroEL基因擴增結果
Fig.9 Electrophoresis result of GroEL gene

2.3.3 基因相對表達量的確定

實時熒光定量技術是通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號的強弱來即時測定特異性產(chǎn)物的量，進而據(jù)此推斷目的基因的初始含量。利用該方法對植物乳桿菌生物膜菌株和浮游菌株各功能基因進行相對定量分析，結果如圖10所示。DnaK，GroEL 基因的相對表達量分別達到1.53，3.22。結果表明，生物膜成熟過程中受到熱脅迫等環(huán)境影響，DnaK、GroEL基因表達量增高，與焦凌霞[13]的實驗結果類似，學者對酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌進行70～90 ℃熱脅迫，DnaK基因的表達量也提高至1～2.5倍不等。2種熱應激基因對植物乳桿菌在高溫逆境下的生存于生物膜的形成起著重要作用。

圖10 基因相對表達量
Fig.10 The relative expression of genes

3 討論

細菌生物膜的形成過程牽涉到多種基因的表達以及復雜的蛋白調控機制[14]。本試驗表明，植物乳桿菌生物膜形成之后相關應激基因的表達量提高，且對環(huán)境的適應能力和耐受性也相應提高，表明其生物膜的形成與各種應激行為密不可分，在成膜過程中受到各種環(huán)境脅迫，產(chǎn)生相應的應激行為，調控了菌體對不良環(huán)境的耐受力。乳酸菌的應激研究目前已較為全面，但是將生物膜的形成與應激行為和環(huán)境耐受力相結合的研究較為少見。

DnaK、GroEL生物學功能廣泛，而且在生物體內廣泛地參與了多種復雜的功能，與生物在高溫、酸、堿、氧化應激等逆境下的生存關系密切。熱激蛋白在受到各種環(huán)境脅迫時都會受到誘導表達上調。環(huán)境滲透壓升高，會對蛋白質二級結構有破壞作用，GroEL基因面對滲透脅迫則會受到誘導表達上調，起到保護蛋白質的目的。在此環(huán)境脅迫下與調控下也促進了生物膜的形成。

劉倩穎[15]的試驗研究表明，在鹽脅迫下，GroEL基因的表達量會增加至4倍左右，在本實驗植物乳桿菌生物膜的成熟過程也受到鹽脅迫，說明該基因在鹽脅迫下其相對表達量也會受到影響，可能一個基因同時調控著細菌的多種環(huán)境應激行為。

應激基因的相對表達量變化在表型試驗中也得以驗證。酸、高溫脅迫下會導致一些相關的酸敏感酶的活性喪失，細胞膜、大分子物質的結構損壞等，菌體與菌體之間也會有協(xié)同或拮抗行為的產(chǎn)生。植物乳桿菌會通過自身適應性調節(jié)來消除部分不利影響，涉及的可能機制包括細胞膜組成的改變、應激蛋白和分子伴侶的誘導產(chǎn)生、轉錄調控的表達等。適應性調節(jié)可能是上述一種機制的作用，也可能是多種機制的綜合結果，仍需進一步研究確定。

高滲條件通常由鹽類或糖類溶質引起，植物乳桿菌通常情況下能自我平衡胞內胞外的一定鹽或糖濃度。在高滲透壓條件下，可在細胞內積累相容性溶質；在低滲透壓條件下，可以通過向細胞外部釋放相容性溶質。通過調節(jié)相容性溶質在細胞內含量這樣的方式，達到保護菌體的目的。

植物乳桿菌生物膜形成之后，其對環(huán)境的耐受性相應提高，可利用生物膜的形成有利于抵抗環(huán)境脅迫壓力，通過調控生物膜的形成促進有益微生物聚集，提高發(fā)酵菌種穩(wěn)定性與活力，從而提高發(fā)酵食品品質。

4 結論

研究了植物乳桿菌PG3-1生物膜形成之后環(huán)境耐受力的變化以及相關功能基因表達量的變化，結果表明，生物膜形成后菌株對溫度、酸堿度、鹽度耐受性均有不同程度的提高，且與其功能基因的表達存在一定關聯(lián)，植物乳桿菌生物膜形成過程中發(fā)生熱應激、酸應激、鹽應激等應激行為，GroEL、DanK熱應激基因的相對表達量達到3.22、1.53，更為深入的相互關系還需要進一步探索。