羅國(guó)廠(chǎng) 楊 坦 張春玉 吳新杰 熊 平

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 南陽(yáng) 473000)

很多法醫(yī)實(shí)踐工作中，法醫(yī)工作者不僅僅要解決死者年齡、死者身份、死亡原因、死亡性質(zhì)以及致死手段等問(wèn)題，還有死后間隔時(shí)間(postmortem interval, PMI)的估計(jì)。死后間隔時(shí)間在刑事案件和意外死亡案件中非常重要，準(zhǔn)確評(píng)估PMI為案件偵破提供重要線(xiàn)索。因此，推斷PMI一直是法醫(yī)學(xué)者研究的重要課題之一[1～2]。

脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)是生物體細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)，每個(gè)細(xì)胞的DNA結(jié)構(gòu)和含量相當(dāng)穩(wěn)定，一般情況下，每個(gè)細(xì)胞核的DNA含量不變。但是，機(jī)體死亡后，細(xì)胞核DNA會(huì)發(fā)生降解，且DNA降解的速度在一定時(shí)間內(nèi)存在一定的規(guī)律，因此對(duì)DNA進(jìn)行定量檢測(cè)來(lái)推斷死亡時(shí)間是一種有效的方法。組織切片經(jīng)過(guò)特殊染色(Feulgen染色)后可以利用圖像分析技術(shù)特異性測(cè)定DNA灰度值，用已知定量細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)DNA含量做對(duì)照，從而得到細(xì)胞DNA含量[1]。

組織芯片也稱(chēng)組織微陣列(tissue microarray,TMA)技術(shù)，是在一個(gè)玻片上包含多個(gè)組織，一起切片、一起染色，具有平行、高通量等優(yōu)點(diǎn)[3]，用組織微陣列技術(shù)對(duì)多個(gè)組織進(jìn)行處理，可以獲得大量的數(shù)據(jù)資料，節(jié)約了組織材料，而且實(shí)驗(yàn)條件一致可減小實(shí)驗(yàn)誤差，用于推斷PMI具有不可比擬的優(yōu)越性。

圖像分析技術(shù)(Image analysis technology ，IAT)是用已知組織含量的前提下，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)特殊染色的組織進(jìn)行對(duì)比，實(shí)現(xiàn)定量分析。

IAT結(jié)合TMA研究機(jī)體死后組織細(xì)胞DNA變化，樣本量大，條件一致性、可比性增強(qiáng)，為準(zhǔn)確推斷PMI成為可能。

1 材料與方法

1.1 材料

取雄性健康新西蘭兔39只(每只重量在2.5～3.0kg)，隨機(jī)分為13組，每組3只，隨機(jī)在動(dòng)物房散養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度控制在20～25℃，每組3只，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前首先稱(chēng)重，根據(jù)不同個(gè)體重量，用20%烏拉坦靜脈麻醉，頸動(dòng)脈放血死，在死后每隔4h解剖一組，取實(shí)驗(yàn)需要的組織，10%甲醛固定。

選取人體離體組織(明確離體時(shí)間)，20～25℃保存，間隔4h，在離體0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h分別取0.5×0.5cm肌肉組織，10%甲醛固定。

1.2 方法

1.2.1常規(guī)組織蠟塊制作，HE染色后了解取材情況，初步了解細(xì)胞細(xì)胞核變化

選取各個(gè)不同時(shí)間段的組織，按照常規(guī)石蠟切片制作要求制作蠟塊，切片、HE染色，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞核變化情況，評(píng)估蠟塊質(zhì)量，選取典型部位。

1.2.2兩組織芯片的制作[3]及Feulgen染色

芯片各個(gè)位點(diǎn)排列：組織標(biāo)本在組織芯片上按照時(shí)間點(diǎn)順序排列，第一個(gè)設(shè)計(jì)為空白點(diǎn)，便于識(shí)別，從左到右按時(shí)間順序，依次為離體0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h的組織(共3組)。

芯片制備：將熔化石蠟制作的空白蠟塊,設(shè)計(jì)6×7點(diǎn)組織列陣、打孔，在各時(shí)間點(diǎn)供體蠟塊上標(biāo)記所需靶點(diǎn)，45℃烘10min，取樣器鉆取靶點(diǎn)組織，逐個(gè)取出組織芯，放入預(yù)先設(shè)計(jì)的陣列模塊中，將制成組織芯片倒置，55℃，30min，輕壓模塊排平。

切片、Feulgen染色[1](1M HCl 、60℃下水解將DNA分子中嘌呤堿基與去氧核糖之間的糖苷鍵打斷，嘌呤脫下，去氧核糖C-1位置釋放醛基與席夫試劑反應(yīng)顯紫紅色，只有DNA才具有這種專(zhuān)一的反應(yīng))、脫水、透明、封固。

1.2.3圖像分析、數(shù)據(jù)采集

Feulgen染色后的組織芯片的DNA顯紫紅色，在550nm的光波照射吸收光最強(qiáng)，所測(cè)積分光密度與細(xì)胞的DNA含量成正比，圖像采集使用(560±10)nm的濾光片，每個(gè)芯片的觀(guān)察視野設(shè)定測(cè)量范圍、利用濾光片減背底、每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分割(明確范圍)、濾波、對(duì)一些聚焦不清和重疊的細(xì)胞進(jìn)行刪除，全部設(shè)定完畢后開(kāi)始自動(dòng)測(cè)量，所得數(shù)據(jù)以人淋巴細(xì)胞核作對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞DNA含量平均值，每個(gè)芯片位點(diǎn)測(cè)量細(xì)胞數(shù)不少于50個(gè)[1]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

圖1 兔肌肉組織芯片

圖2 低倍鏡下組織芯片的一個(gè)點(diǎn)(兔腎臟)10×10

圖3 Feulgen染色，經(jīng)過(guò)濾光處理后兔腎組織芯片視野表現(xiàn)10×40

2.1 兔組織細(xì)胞核DNA含量與PMI關(guān)系相關(guān)分析

時(shí)間為因變量，DNA平均含量為自變量，進(jìn)行用單因素方差分析，所得相關(guān)方程式。

骨骼肌組織相關(guān)方程式為：Y=-0.0175x+6.997

肝臟組織相關(guān)方程式為：Y=-0.0208x+7.175

脾臟組織相關(guān)方程式為：Y=-0.0474x+6.641

心肌組織相關(guān)方程式為：Y=-0.0253x+7.823

腎臟組織相關(guān)方程式為：Y=-0.0415x+6.721

睪丸相關(guān)方程式為：Y=-0.0244x+8.277

腸相關(guān)方程式為：Y=-0.0506x+7.002

胃相關(guān)方程式為：Y=-0.0419x+6.242

膀胱相關(guān)方程式為：Y=-0.0279x+7.531

膽囊相關(guān)方程式為：Y=-0.0292x+6.767

氣管組織相關(guān)方程式為：Y=-0.0274x+7.857

肋軟骨相關(guān)方程式為：Y=-0.0174x+7.753

角膜相關(guān)方程式為：Y=-0.0214x+7.025

腦組織相關(guān)方程式為：Y=-0.0487x+6.951

2.2 兔各組織細(xì)胞核DNA降解的時(shí)序性分析

各個(gè)組織由于其所處機(jī)體位置、自身質(zhì)地、酶含量等條件不同，所以出現(xiàn)平臺(tái)期的時(shí)間不一樣，其中腦組織最早、其次為腸、脾組織等。

通過(guò)比較各組織細(xì)胞核DNA降解的時(shí)序性，初步了解不同組織降解影響因素具有差異。

2.3 人體組織細(xì)胞核DNA含量與PMI相關(guān)方程式

肌肉組織細(xì)胞核DNA降解相關(guān)方程式為：Y=-0.0193x+7.896，決定系數(shù)R2=0.9005，DNA含量與PMI呈明顯的負(fù)相關(guān)。

2.4 不同組織細(xì)胞核DNA含量與PMI關(guān)系的多元回歸分析

肌肉細(xì)胞核DNA含量和PMI數(shù)據(jù)之間進(jìn)行多元線(xiàn)性回歸分析：

Y=484.4-45.1X1-18.2X2(Y為PMI，X1為人肌肉DNA，X2為兔DNA)，決定系數(shù)R2=0.911，P=0.000。

PMI為因變量，把兔各組織DNA含量作自變量，按a=0.1引入自變量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行逐步回歸分析，各因素之間有顯著差異(P<0.05)。

3 討論

自從1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以來(lái)，F(xiàn)eulgen染色仍是DNA定量主要染色方法之一。Feulgen染色經(jīng)典顯示脫氧核糖核酸的方法具體原理是，標(biāo)本經(jīng)稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，在核糖的一端出現(xiàn)了醛基。Schiff試劑中的無(wú)色品紅可與醛基反應(yīng)，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發(fā)色團(tuán)，呈現(xiàn)出紫紅色，從而顯示出DNA的分布，可以鑒定DNA。

機(jī)體死亡后，溶酶體膜破裂細(xì)胞自溶，最終溶解消失[4]。在細(xì)胞自溶的過(guò)程中細(xì)胞核中的DNA在多種原因作用下逐步降解，最后完全消失。細(xì)胞DNA含量隨著PMI延長(zhǎng)而逐漸減少，平臺(tái)期后與PMI呈時(shí)間依賴(lài)性關(guān)系，已經(jīng)有多位法醫(yī)工作者的證實(shí)[1,5～7]

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：組織細(xì)胞核DNA在經(jīng)過(guò)一個(gè)平臺(tái)期后，含量逐漸下降，隨著PMI的延長(zhǎng)而逐步下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了以前的論述[1,5～7]。我們利用離體的人體組織和兔組織DNA降解進(jìn)行比較，證實(shí)兩者具有高度相關(guān)性，證實(shí)可以利用動(dòng)物組織DNA降解情況作為人體PMI研究的依據(jù)。

本次用組織芯片技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)來(lái)研究DNA和PMI的相關(guān)性，高通量特點(diǎn)可以包容大量的信息，同時(shí)大量組織在同一條件下進(jìn)行測(cè)量，能保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性[1]。兩種儀器操作較簡(jiǎn)單、方便，為將來(lái)廣泛地應(yīng)用提供了可能。

參 考 文 獻(xiàn)

1 羅國(guó)廠(chǎng),熊平.比較人和兔細(xì)胞DNA降解來(lái)推斷人死亡時(shí)間的可行性研究.衡陽(yáng):南華大學(xué)學(xué)報(bào),2007.

2 林旭,尹雅莎,冀強(qiáng).DNA定量技術(shù)在死亡時(shí)間推斷中的研究進(jìn)展.法醫(yī)學(xué)雜志,2011,27(1):47～51.

3 陳杰偉,劉君,張淦梅,等.高效實(shí)用的組織芯片免疫組織化學(xué)對(duì)照體系的建立.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2017,26(2):170～177.

4 羅國(guó)廠(chǎng),熊平.組織芯片在推斷死亡時(shí)間中的應(yīng)用探討.南華大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,34(5):631～633.

5 龍仁,黃安,王偉平,等.低溫下大鼠死后骨骼肌及肝組織平均ATP含量變化與PMI關(guān)系的研究.美國(guó)中華臨床醫(yī)學(xué)雜志,2005,7(3):184～185.

6 舒細(xì)記,王樹(shù)法,李艷,等.死后5～36h人腦細(xì)胞DNA降解含量的圖像分析.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,8(4):796～798.

7 熊平,郭平,張靜.組織細(xì)胞DNA降解與死亡時(shí)間的相關(guān)性的顯微拉曼光譜分析.光譜學(xué)與光譜分析,2010,30(1):1511～1515.