馮笑 劉兆宇 胡臘 陳紀(jì)濤 曾子成 劉季芳

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院（廣州510710）

自 1956 年 WARBURG［1］提出腫瘤細(xì)胞中的Warburg現(xiàn)象以來，迄今已有許多研究證明在腫瘤中存在多種代謝途徑的變化，代謝改變已被歸納為腫瘤的特征之一［2］。有研究證明，致瘤性損傷能夠誘導(dǎo)葡萄糖流量進(jìn)入磷酸戊糖途徑（PPP）［3］，腫瘤中PPP的改變是腫瘤代謝特征的重要部分。而6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PD）作為PPP的關(guān)鍵酶，控制著經(jīng)PPP的糖流量，對PPP的研究重點(diǎn)在于對G6PD的研究。

G6PD的基因位于Xq28.1，長18 kd，含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，近年研究表明，G6PD的表達(dá)與腫瘤存在密切關(guān)聯(lián)，其在胃癌［4］、黑色素瘤［5］、膀胱癌［6］、腎透明細(xì)胞癌［7］多種腫瘤組織標(biāo)本中表達(dá)量上升，在胃癌［4］、食管鱗癌［8］、乳腺癌［9］中 G6PD的表達(dá)量與腫瘤患者的臨床預(yù)后及生存期呈負(fù)性相關(guān)，也有研究發(fā)現(xiàn)G6PD可通過促進(jìn)血管生成促進(jìn)腫瘤生長［10］。G6PD如今被視為一種與臨床預(yù)后相關(guān)的癌基因及腫瘤標(biāo)志物，在腫瘤的生存、增殖、轉(zhuǎn)移中都發(fā)揮著重要作用。原發(fā)性肝癌作為一種常見癌癥，與機(jī)體的糖代謝異常存在相關(guān)性［11］，用于治療代謝性疾病糖尿病的二甲雙胍能夠改變肝癌細(xì)胞的線粒體形態(tài)及功能［12］，這提示肝癌細(xì)胞中的代謝也存在異常。過往對肝癌中G6PD基因的研究較少，有研究證實(shí)在HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞中，G6PD通過HBV提高自身表達(dá)量來促進(jìn)腫瘤發(fā)展［13］。之前的研究往往認(rèn)為G6PD是一種促癌基因，因而忽略了對于已經(jīng)發(fā)生癌變的癌細(xì)胞，高水平G6PD可能產(chǎn)生的后果。本研究補(bǔ)充了肝癌這一方面的研究，以肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5同時(shí)建立了G6PD敲低及過表達(dá)的細(xì)胞株，并對它們進(jìn)行了增殖及遷移生物學(xué)功能的初步探索，為之后深度研究G6PD及PPP對肝癌的影響打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細(xì)胞株大腸桿菌DH5α、293T細(xì)胞株、過表達(dá)、干擾質(zhì)粒及慢病毒包裝質(zhì)粒購自廣州復(fù)能有限公司，PLC/PRF/5細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司、G6PD活性檢驗(yàn)試劑盒購自Biovison公司、NADP/NADPH含量測定試劑盒購自Sigma公司、Trizol及Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司，G6PD、GAPDH抗體及二抗均購自CST，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RTPCR試劑盒購自Takara，EDU試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。

1.1.3 儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（伯樂ChemiDoc XRS+），超微量分光光度計(jì)（BioTeKEpoch2）、倒置熒光顯微鏡（萊卡DMi8）、雙模塊PCR儀（伯樂S100048/48雙模）、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Countstar IC?1000）、RealTime Cellular Analysis（RTCA）System來自美國艾森公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存細(xì)胞PLC/PRF/5及293T，37℃水浴鍋快速復(fù)蘇，以DMEM+10%FBS培養(yǎng)，置于37℃5%CO2孵箱培養(yǎng)，定時(shí)換液、傳代。

1.2.2 Real?time PCR檢測以Trizol提取細(xì)胞總RNA，以此檢測各組細(xì)胞中G6PD mRNA表達(dá)，G6PD real?time PCR 的引物為 Forward：5′?CGCCT?CACAGTGGCTGACATC?3′，Reverse：5′?ACCCCAG?GTGGAGGGCATT ?3′，GAPDH的引物為：Forward：5′?ATCACCATCTTCCAGGAGCGAG?3，Reverse：′5′?GGGCAGAGATGATGACCCTTTTG?3′，按說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)體系20 μL，以95℃反應(yīng)10 min，再以 95℃ 15 s、60℃ 60 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 Western blot檢測以冷凍PBS清洗6孔板中細(xì)胞2次，每孔加入400 mL RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解15 min，4℃13 000g離心10 min，取上層澄清液體，加入5×loading buffuer，留取部分以BCA法測定總蛋白濃度。以1×loading buffer調(diào)節(jié)兩組蛋白濃度至一致，取約50 μg的總蛋白經(jīng)10%SDS?PAGE 膠，經(jīng)80 V 30 min、120 V 60 min電泳后，以200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h，經(jīng)封閉2 h和抗體孵育，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像。

1.2.4 慢病毒包裝、濃縮及滴度測定轉(zhuǎn)染前1 d 293T細(xì)胞傳代，使次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%。在離心管中按量將lipo3000溶于Opti培養(yǎng)基中，于另一管中以3∶2∶1比例將目的質(zhì)粒、PsPAx2、PVSVg三種質(zhì)粒溶于Opti培養(yǎng)基并加入p3000，將兩管液體輕柔混合，靜止5 min后將質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合液加入293T細(xì)胞中并補(bǔ)加完全培養(yǎng)基，之后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于24 h倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率（重組慢病毒質(zhì)粒攜帶綠色GFP熒光蛋白基因），48及72 h后收集含慢病毒顆粒的培養(yǎng)基，以10 KD超濾離心管濃縮病毒液，檢測病毒顆粒滴度，-80℃保存。

1.2.5 細(xì)胞株的感染及藥物篩選將所收集慢病毒液加入PLC/PRF/5，并加入Polybrene協(xié)助感染，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)無明顯異常。48 h觀察細(xì)胞感染效率。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)所得PLC/PRF/5細(xì)胞株的Puro最小致死濃度（3 μg/mL）加入Puro進(jìn)行藥篩。藥篩時(shí)間2周，按需換液傳代。

1.2.6 EDU增殖實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期各組細(xì)胞接種至12孔板中，使得次日細(xì)胞密度適中（50%～80%）。次日先以配制好的EDU培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)2 h，經(jīng)清洗、細(xì)胞固定化、Apollo染色、DNA染色后，置于倒置熒光顯微鏡下先后以紫光、綠光為激發(fā)光曝光，分別得到全細(xì)胞及處于復(fù)制階段的細(xì)胞核圖像，10倍鏡及20倍鏡下每孔拍照10張，計(jì)算處于復(fù)制階段的細(xì)胞比例并統(tǒng)計(jì)差異。

1.2.7 遷移及增殖曲線記錄取對數(shù)生長期細(xì)胞計(jì)數(shù)，以無血清DMEM調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/mL，接種至與儀器配套的12孔遷移板上室中（200 μL/孔），下室中加入100 μL血清，位于孔板底部的金屬電極將記錄穿室細(xì)胞的電阻以反映細(xì)胞遷移能力，記錄觀察48 h內(nèi)的遷移曲線。增殖曲線依同理記錄100 h內(nèi)細(xì)胞生長指數(shù)數(shù)據(jù)。

1.2.8 克隆形成實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞消化吹打成單細(xì)胞，以細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)算細(xì)胞懸液中細(xì)胞密度，每組細(xì)胞以100個(gè)每孔接種至6孔板中，加入完全培養(yǎng)基至2 mL，吹打細(xì)胞使其分布均勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。按時(shí)觀察，至出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄上清PBS清洗，以4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，后以0.1%結(jié)晶紫染色液染色15 min，清水浸洗直至洗凈，拍照記錄克隆形成情況，計(jì)算各組克隆形成率（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLC/PRF/5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立鑒定包裝G6PD敲低及過表達(dá)慢病毒顆粒，經(jīng)慢病毒感染、Puro藥篩PLC/PRF/5細(xì)胞株獲得熒光穩(wěn)定的PLC/PRF/5敲低細(xì)胞株（PLC?G6PD shRNA）及其對照組（PLC?Scramble shRNA）、過表達(dá)細(xì)胞株（PLC?Lv201?G6PD）及其對照組（PLC?Lv201?Con）。定量PCR檢驗(yàn)mRNA水平變化，敲低效果達(dá)92.5%，過表達(dá)效果達(dá)13.89倍。Western檢驗(yàn)蛋白水平變化量，過表達(dá)同時(shí)明顯過表達(dá)了G6PD的2種亞型；由灰度值計(jì)算，敲低效果則達(dá)95.2%（圖1）。

圖1 RT?PCR及Western blot檢測敲低及過表達(dá)PLC/PRF/5中G6PD的表達(dá)情況Fig.1 Detection of mRNA and protein expression of G6PD in G6PD knockdown and overexpression cells PLC/PRF/5 via RT?PCR and Western blotting assays

2.2 增殖生長能力的檢驗(yàn)據(jù)細(xì)胞生長曲線可知，PLC?G6PD shRNA、PLC?Scramble shRNA、PLC?Lv201?G6PD、PLC?Lv201?Con四株細(xì)胞在接種后第3天進(jìn)入對數(shù)生長期（圖2A）。但細(xì)胞株P(guān)LC?G6PD shRNA較對照組倍增時(shí)間延長，生長速率明顯下降，增殖受到抑制，與PLC?Scramble shRNA相比，在培養(yǎng)的第48～ 100小時(shí)，PLC?G6PD shRNA細(xì)胞指數(shù)較對照組降低了50.2%～61.25%（圖2A），EDU顯示的增殖細(xì)胞比例較對照組低43.2%（圖2B），平均克隆形成率降低了67.2%（P＜ 0.05）（圖2C）。而過表達(dá)細(xì)胞株P(guān)LC?Lv201?G6PD較對照組PLC?Lv201?Con增殖及克隆形成實(shí)驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖A2～C）。

2.3 遷移能力檢測由RTCA系統(tǒng)所測的48 h內(nèi)細(xì)胞遷移曲線可知，過表達(dá)組細(xì)胞與對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而敲低細(xì)胞株較其對照組，遷移能力顯著降低（圖3）。

3 討論

磷酸戊糖途徑不論在正常細(xì)胞還是腫瘤細(xì)胞中都發(fā)揮著重要作用，一方面，PPP可通過其氧化分支產(chǎn)生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adeninedinucleotide phosphate，NADPH），NADPH 是細(xì)胞內(nèi)重要的還原當(dāng)量，通過還原性谷胱甘肽（GSH）對細(xì)胞內(nèi)生成的氧自由基、過氧化物清除，避免氧化損傷，是細(xì)胞生長和增殖的必要條件；另一方面，PPP通過非氧化分支產(chǎn)生核苷酸合成的重要前體五磷酸核糖（ribose?5?phosphate，R?5?P），R?5?P是細(xì)胞增殖分裂的必需物質(zhì)，對細(xì)胞的生長十分重要，尤其對腫瘤細(xì)胞而言，在腫瘤細(xì)胞中PPP為DNA合成提供了約85%的戊糖［14］。

在本研究中，通過shRNA敲低PPP關(guān)鍵酶G6PD的表達(dá)，測得G6PD活性、細(xì)胞中NADPH的產(chǎn)量均下降（未發(fā)表數(shù)據(jù)），這與隨后實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖、克隆形成及遷移能力顯著下降的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。如上所述，PPP的主要產(chǎn)物是NADPH，NADPH可維持細(xì)胞中重要還原物質(zhì)谷胱甘肽GSH的水平，用以減少細(xì)胞中的活性氧ROS，減少細(xì)胞氧化損傷及凋亡程度，故當(dāng)G6PD蛋白的功能不足以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡時(shí)，細(xì)胞的增殖及克隆形成能力受到抑制，同時(shí)，PPP非氧化分支的減弱，減少了腫瘤細(xì)胞中磷酸戊糖的供應(yīng)，也足以抑制細(xì)胞的分裂增殖。另一方面，本研究中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)G6PD時(shí)，雖然活性G6PD的量相應(yīng)增加，但是從細(xì)胞中的NADPH含量直至細(xì)胞的增殖、遷移均未發(fā)生存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變化，這也許因?yàn)榧?xì)胞正常生長中G6PD的量已然足夠維持細(xì)胞中的氧化還原平衡，故而雖然細(xì)胞中的G6PD總量以及活化形式的G6PD含量上升，卻不會(huì)改變細(xì)胞中氧化還原的底物、產(chǎn)物間的平衡。

圖2 G6PD敲低及過表達(dá)細(xì)胞增殖及生長情況Fig.2 Cell proliferation and growth in G6PD knockdown and overexpression cells

圖3 G6PD敲低及過表達(dá)細(xì)胞遷移情況Fig.3 Migration curve analyses in G6PD knockdown and overexpression cells

本研究初步證實(shí)了G6PD在肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5中發(fā)揮著類似癌基因的作用，能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、生長、遷移，為了探索肝癌細(xì)胞的代謝特征及PPP在肝癌細(xì)胞代謝中的地位，我們將對所建細(xì)胞株中糖消耗、乳酸含量、脂質(zhì)等代謝物進(jìn)行檢測，研究G6PD及PPP對腫瘤代謝的全面影響；同時(shí)深入探討G6PD發(fā)揮作用的機(jī)制，現(xiàn)已有研究表明p53可通過與G6PD的直接結(jié)合降低活性G6PD的含量而發(fā)揮抑癌作用［15］，白血病細(xì)胞中SIRT2通過對G6PD的乙?；揎椞岣逩6PD的活性而促進(jìn)腫瘤生長［16］，在肝癌細(xì)胞中PTEN可通過Tcl1/hnRNPK通路抑制G6PD前體mRNA的剪接發(fā)揮抗癌作用［17］，可見多種信號(hào)通路影響著G6PD的表達(dá)、活性，為了尋找其他影響G6PD的上游基因以及受G6PD影響的下游基因，我們已將表型變化明顯的G6PD敲低組與對照組樣品進(jìn)行全基因組芯片檢測，以期挖掘與G6PD相關(guān)的功能基因，深入探索G6PD及PPP的改變在肝癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的機(jī)制。

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