杜玄，趙燕英，劉驥，龍虎，王洪志，田萬帆，唐俊妮

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種重要的病原菌，極易污染食品并引發(fā)食物中毒，以及人或動物的組織感染、敗血癥和肺炎等[1,2]。在我國，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占所有細菌性食物中毒的比例高達20%～25%[3]。金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒主要是由腸毒素引起的。目前已發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌腸毒素有 22種，根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)的先后順序，分別命名為傳統(tǒng)腸毒素SEA～SEE和新型腸毒素SEG-SET，SElU，SElU2，SElV[4]。

對于新發(fā)現(xiàn)的腸毒素目前還缺乏檢測方法?，F(xiàn)有的檢測金黃色葡萄球菌傳統(tǒng)腸毒素和部分新型腸毒素的方法有分子生物學(xué)檢測法、免疫學(xué)檢測法和生物傳感器法等[5]，其中，大多是針對毒素基因水平的檢測，如Letertre等[6]利用實時熒光PCR（polymerase chain reaction）成功檢測出了9種腸毒素基因，該檢測技術(shù)快速，但只能檢測核酸水平而不能檢測蛋白本身。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是依靠抗原決定簇與抗體結(jié)合位點之間特異性進行檢測，如 Rahimi等[7]用ELISA方法檢測食品中的傳統(tǒng)腸毒素SEA-SED；Nagaraj等[8]利用雙抗夾心 ELISA（double-antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay，DAS-ELISA）的方法檢測食品中的SEG；朱安妮等[9]利用雙抗夾心 ELISA建立檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEI；Zhao等[10]利用雙抗夾心ELISA檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素SEM。但目前還未見檢測新型腸毒素SEP的ELISA方法報道。

新型腸毒素 sep基因的核苷酸序列有 729 bp（NCBI登錄號：YP_009113107.1），編碼286個氨基酸殘基的毒素蛋白SEP，分子量為27.89 ku。Hait等[11]在發(fā)生食物中毒事件的面包店中，檢測出金黃色葡萄球菌新型腸毒素sep基因。Calderwood等[12]的研究發(fā)現(xiàn)攜帶sep基因的MRSA菌株會增加敗血癥的風(fēng)險。因此，研究腸毒素SEP的夾心ELISA檢測方法具有必要性，可為食品污染腸毒素SEP的風(fēng)險識別提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SEP蛋白純品（1.8 mg/mL），SEP單克隆抗體（2.3 mg/mL），抗SEP兔血清（1.57 mg/mL），以及SEK、SEI和SEM蛋白均為本實驗室自制；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 IgG（IgG/HRP）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液購自天根生化科技(北京)有限公司；Tween-20購自美國Amresco公司；脫脂奶粉購自英國Oxoid公司；96孔聚苯乙烯酶標板購自中國Costar公司；Elx-808型酶標儀購自美國Bio-Tek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SEP的DAS-ELISA工作流程

以適當(dāng)稀釋的SEP單克隆抗體包被酶標板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜；倒出包被液，每孔加入含有Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBST），清洗3次；隨后，每孔加入200 μL的5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液（PBS），37 ℃封閉1～2 h，洗板3次；再加入SEP純品蛋白（20 μg/mL），每孔 100 μL，37 ℃孵育 45～90 min；加入抗SEP兔血清，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h；以羊抗兔IgG/HRP 為二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育 30～60 min；洗板5次，加入TMB底物顯色溶液，每孔100 μL，避光顯色10～20 min；加入2 mol/L的硫酸溶液使反應(yīng)停止。測定450 nm處的OD值，并計算P/N值（其中P為檢測樣品的OD450nm值；N為陰性對照OD450nm值）。

1.2.2 最佳抗體質(zhì)量濃度確定

保持其余工作條件不變，采用1.2.1的流程分別對不同質(zhì)量濃度下的抗SEP單克隆抗體（1.64、3.28、6.56 μg/mL）、不同稀釋質(zhì)量濃度的抗 SEP兔血清（1.57、3.14、6.28 μg/mL）和不同稀釋度的IgG/HRP（稀釋度為 1:3000、1:6000）進行檢測。陽性孔用已知濃度的SEP蛋白純品作對照，陰性孔用PBS代替抗原，反應(yīng)結(jié)束，測定OD450nm值，并計算P/N值，根據(jù)P/N大小確定最佳抗SEP單克隆抗體和抗SEP兔血清濃度以及IgG/HRP最佳稀釋度。

1.2.3 最佳檢測條件確定

參照朱安妮[9]的方法，按照1.2.1的流程，在最佳抗體工作濃度的條件下，分別對不同種類的緩沖液（0.1 mol/L，pH 9.2碳酸鹽）；1×PBS（pH 7.4）、封閉時長（1、1.5、2 h）、抗原孵育時間（45、60、90 min）、羊抗兔IgG/HRP反應(yīng)時間（37 ℃：30、45、60 min）、TMB底物顯色時間（10、15、20 min）進行 ELISA實驗。檢測陽性孔和陰性孔的OD450nm，計算并選擇最大P/N值為最佳條件。

1.2.4 制備DAS-ELISA標準曲線

按照ELISA的工作程序，用夾心ELISA法檢測不同質(zhì)量濃度SEP抗原（0.63、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL），測定OD450nm值，并制作標準曲線。

1.2.5 靈敏度實驗

利用DAS-ELISA法檢測不同質(zhì)量濃度的SEP蛋白（0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 μg/mL），測試 SEP檢測方法的靈敏度。判斷標準：P/N＞2.0為陽性。

1.2.6 精密度實驗[9,13]

參考文獻方法，批內(nèi)變異將陽性對照組（20、10、5 μg/mL），陰性對照組分別作 5個孔，同時檢測其OD450nm值；批間變異將上述標本連續(xù)5次檢測OD450nm值。變異系數(shù)的計算公式為CV=(SD/ˉx)×100%

1.2.7 DAS-ELISA方法的特異性分析

取實驗室保存的 SEK、SEI和 SEM 純品（10 μg/mL）作為樣品檢測。判斷標準：P/N＞2.0為陽性結(jié)果。

1.2.8 測定人工污染樣品中SEP回收率

SEP人工污染基質(zhì)采用LB肉湯、牛肉糜和熟米飯。通過添加，使基質(zhì)中SEP的含量分別為2.5、5、10和20 μg/mL。利用所建立的SEP的DAS-ELISA方法，分別測定樣品和陰性對照的OD450nm，計算樣品的回收率。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個檢測樣品做三次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用 excel軟件進行分析，實驗結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳抗體質(zhì)量濃度的確定

采用方陣滴定法來確定單克隆抗體和抗血清配對的最佳工作濃度，結(jié)果如表1所示。

當(dāng)單克隆抗體的包被質(zhì)量濃度為3.28 μg/mL，抗SEP兔血清的質(zhì)量濃度為3.14 μg/mL的時候，P/N值最大，達到9.44。

因此確定抗體的最佳配對濃度為單克隆抗體3.28μg/mL，抗血清3.14 mg/L。

表1 不同抗體濃度配對下的OD450 nm值Table 1 The OD450 nm values under different antibody concentrations

2.2 最佳IgG/HRP稀釋度的優(yōu)化

表2 不同羊抗兔IgG/HRP稀釋度下的OD450 nm值Table 2 The OD450 nm values of different goat anti-rabbit IgG /HRP dilutions

注：加粗字體為酶標抗體的最佳稀釋度。在最佳配對抗體濃度的條件下（即單克隆抗體質(zhì)量濃度為 3.28μg/mL，抗SEP兔血清質(zhì)量濃度為3.14 μg/mL），測定酶標抗體稀釋度的OD450nm值。如表2所示，當(dāng)酶標抗體的稀釋度為1:3000 時，P/N 值是9.68，因此，確定1:3000 為最佳IgG/HRP 稀釋度。

2.3 DAS-ELISA實驗條件優(yōu)化

根據(jù)2.1和2.2的實驗結(jié)果，單克隆抗體的包被濃度為3.28 μg/mL，抗SEP兔血清的濃度為3.14 μg/mL，羊抗兔IgG/HRP的稀釋度為1:3000，在此體系下對包被緩沖液、封板時長、抗原孵育時間、酶標二抗反應(yīng)時間和TMB顯色時間進行優(yōu)化，表3為實驗結(jié)果。根據(jù)P/N值最大的標準選擇最優(yōu)條件。因此，最終選擇包被緩沖液為1×PBS（pH 7.4），封閉時間為1 h，抗原孵育時間為90 min，酶標二抗反應(yīng)時間為30 min，TMB顯色時間為15 min。

表3 實驗條件的優(yōu)化Table 3 Optimization of experimental conditions

注：加粗字體為最佳實驗條件。

2.4 新型腸毒素SEP的檢測標準曲線

圖1 SEP雙抗夾心酶聯(lián)免疫法的標準曲線Fig.1 Standard curve of SEP double-antibody sandwich enzyme-linked immunoassay

根據(jù)2.1，2.2和2.3的實驗結(jié)果，在最優(yōu)條件下，選取不同濃度的SEP純品蛋白制作標準曲線，并進行線性回歸分析，標準曲線的回歸方程是y=0.0313x+0.0262，R2=0.9946。SEP的DAS-ELISA方法適用檢測范圍是0.625～20 μg/mL。

2.5 建立方法的靈敏度實驗結(jié)果

采用所建立的實驗方法，測定不同質(zhì)量濃度的SEP蛋白純品，測定OD450nm，并計算P/N值。結(jié)果如表4所示。當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?.8 μg/mL時，P/N值為2.03，根據(jù) P/N值大于 2的標準，本研究建立的DAS-ELISA方法的實際檢測靈敏度為1.8 μg/mL。

2.6 精密度實驗結(jié)果

SEP的DAS-ELISA檢測方法的精密度實驗結(jié)果如表5所示，由表5可以看出，批內(nèi)變異系數(shù)均小于6%，批間變異系數(shù)均小于15%，說明此方法具有較好的重復(fù)性。

表4 檢測SEP的靈敏度實驗Table 4 The sensitivity of SEP detection

表5 精密度實驗結(jié)果Table 5 Precision experiment results

2.7 DAS-ELISA方法的特異性結(jié)果

利用所建立的DAS-ELISA方法對實驗室保存的金黃色葡萄球菌腸毒素K、I和M純品進行檢測，檢測結(jié)果如表6所示，P/N＜2.0，檢測結(jié)果均為陰性，說明該方法與金黃色葡萄球菌其他腸毒素蛋白之間不交叉。

表6 特異性實驗結(jié)果Table 6 Specific experimental results

2.8 人工污染樣品中SEP的回收率試驗結(jié)果

通過將牛肉糜、熟米飯、LB肉湯中添加適當(dāng)濃度的SEP純品蛋白，采用建立的檢測方法檢測樣品中SEP的回收率。從表7可以看出，牛肉糜、熟米飯、LB肉湯樣品中SEP蛋白都具有較好的回收率，接近90%及以上。并且三種污染樣品中SEP的回收率隨著添加濃度的增加而增高，雖然存在樣品本身的差異性，但也能很好說明建立的方法具有較高準確度。

表7 人工污染樣品的回收率Table 7 Recovery of artificial contaminated samples

3 討論

ELISA方法具有靈敏度高，特異性好，檢測成本低等優(yōu)點，已經(jīng)在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有了廣泛應(yīng)用[14]。目前文獻報道的相關(guān)金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測也采用了該方法，如Morissette等[15]建立檢測奶酪中腸毒素SEB的夾心ELISA方法，市場上也有相應(yīng)試劑盒銷售，經(jīng)過改良后其靈敏度可達到 0.5 ng/mL。又如Rahimi等[16]檢測生牛乳中金黃色葡萄球菌腸毒素A的時候采用了ELISA試劑盒，靈敏度達到了0.2 ng/mL。但是，這些方法的建立和試劑盒的應(yīng)用大部分集中在對傳統(tǒng)金黃色葡萄球菌腸毒素 A-D的檢測上。而針對新型腸毒素檢測方法的研究相對比較少。

隨著研究的不斷發(fā)展，開發(fā)針對新型腸毒素蛋白的檢測手段具有必要性。近年來，Nagaraj等[8]、朱安妮等[9]和Zhao等[10]分別建立了檢測腸毒素SEG、SEI和SEM的夾心ELISA方法。這些方法不斷豐富了調(diào)查金黃色葡萄球菌腸毒素污染食品的檢測手段。

本研究也建立了一種檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SEP的DAS-ELISA方法，該方法在0.625～20 μg/mL范圍內(nèi)都具有較好的線性關(guān)系，建立方法的靈敏度為1.8 μg/mL，通過批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)以及人工加標的回收率實驗，證實建立的方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于金黃色葡萄球菌腸毒素P的定量檢測，也將具有良好的應(yīng)用前景。

在進行實驗條件優(yōu)化時，我們發(fā)現(xiàn)單抗和多抗的濃度并不是添加量越高效果就越好，抗體濃度過高，會增加體系中的非特異性反應(yīng)，同時也會影響單抗的抗原表位，降低抗原抗體復(fù)合物的形成，使OD450nm降低。但如果抗體濃度過低，又會使抗原的結(jié)合位點減少，造成測量值比實際值低。本研究中使用的單克隆抗體的包被濃度為3.28 μg/mL，抗SEP兔血清的濃度為3.14 μg/mL。同時，封閉時間、抗原孵育時間、二抗反應(yīng)時間和TMB底物顯色時間也會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，一般來說TMB顯色時間越長，顏色越深，OD450nm值越高。但如果延長顯色時間也會使陰性孔的值升高，使P/N值反而降低，這與朱安妮等[9]的發(fā)現(xiàn)相似，本研究優(yōu)化的顯色時間為15 min。另外，食品基質(zhì)的復(fù)雜性也會影響實驗的結(jié)果，在加標回收實驗中發(fā)現(xiàn)，對于牛肉糜和熟米飯這兩種基質(zhì)來說，SEP的濃度越高，回收率越好，而LB肉湯的回收率在不同SEP的濃度下都較好。以后可進一步探索樣品的前處理手段和方法，以進一步降低待測基質(zhì)本身對實驗結(jié)果影響。還有在特異性實驗中，我們把實驗室保存的金黃色葡萄球菌腸毒素K、I和M蛋白進行對照檢測，發(fā)現(xiàn)腸毒素K、I和M與腸毒素P之間不存在交叉反應(yīng)，這是一個很好的結(jié)果。但本研究也還存在一定的缺陷，建立的方法的檢測限不夠靈敏，在今后的研究中我們將進一步優(yōu)化條件，并且將建立更加豐富的樣品評價方案。

綜上所述，本研究初步建立了一種檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SEP的DAS-ELISA方法，該方法可用來檢測被金黃色葡萄球菌污染食品中的SEP含量，將具有一定的應(yīng)用前景和借鑒意義。

4 結(jié)論

本研究建立了一種檢測金黃色葡萄球菌新型腸毒素P的雙抗夾心ELISA方法；該方法的回歸方程為y=0.0313x+0.0262，R2=0.9946；該方法檢測SEP毒素的靈敏度為1.8 μg/mL，精密度批內(nèi)變異低于6%，批間變異低于15%，對LB肉湯、牛肉糜和熟米飯回收率可達90%以上。

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