崔玲君，孫海新，李潔，趙美麗，周延培

（1.山東世通檢測(cè)評(píng)價(jià)技術(shù)服務(wù)有限公司，山東青島 266000）（2.青島即墨市段泊嵐動(dòng)物衛(wèi)生與產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督站，山東即墨 266200）

L-抗壞血酸（又稱(chēng)維生素C），是人體每日膳食推薦供應(yīng)量最大的一種維生素[1]，它能夠廣泛參與機(jī)體內(nèi)的各種氧化還原反應(yīng)，對(duì)人體新陳代謝及生命活動(dòng)具有重要的影響。然而人體自身不能合成抗壞血酸，只能從食物中攝取[2]。因此準(zhǔn)確測(cè)定食品中抗壞血酸的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食品質(zhì)量控制具有重要意義。目前常見(jiàn)的抗壞血酸測(cè)定方法有滴定法[3]、電化學(xué)法[4,5]、毛細(xì)管電泳法[6]、紫外光度法[7]、熒光法[3,8]、原子吸收光譜法[9]以及液相色譜法[10,11]等，以上方法均具有各自的優(yōu)越性，但是由于L-抗壞血酸極不穩(wěn)定，遇空氣中氧、熱、光、堿性物質(zhì)，特別是在有氧化酶及痕量銅等金屬離子存在時(shí)，易被氧化成為脫氫型抗壞血酸，因此保護(hù)L-抗壞血酸不被氧化是各檢測(cè)方法的技術(shù)關(guān)鍵。另外，L-抗壞血酸的光學(xué)異構(gòu)體-D-抗壞血酸，也常被用作食品添加劑，但其抗氧化活性只有L-抗壞血酸的5%[12]。因此，要準(zhǔn)確測(cè)定食品中活性抗壞血酸的含量，即需要將不同構(gòu)型的抗壞血酸區(qū)分測(cè)定，以上研究大都沒(méi)有區(qū)分測(cè)定不同構(gòu)型的抗壞血酸，而是測(cè)定抗壞血酸的總量。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)液相色譜法測(cè)定不同構(gòu)型的抗壞血酸含量已經(jīng)開(kāi)展了廣泛研究，其中克服提取物穩(wěn)定性差，抗壞血酸同分異構(gòu)體化學(xué)性質(zhì)相似，色譜分離不佳，前處理步驟繁瑣等問(wèn)題[13]，成為標(biāo)準(zhǔn)化食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)的行業(yè)技術(shù)瓶頸。針對(duì)上述問(wèn)題，本文從樣品預(yù)處理、提取劑選擇、色譜條件等方面進(jìn)行了探索優(yōu)化，建立了一種L-抗壞血酸、D-抗壞血酸和脫氫抗壞血酸同步測(cè)定方法，對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定食品中活性抗壞血酸的組分含量、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器

G1260高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫；D-500均質(zhì)乳化機(jī)，德國(guó)維根斯；XW-80A漩渦混合器，上海滬西分析儀器廠有限公司；液氮，青島城陽(yáng)長(zhǎng)松氣體有限公司；研缽，北京金志業(yè)儀器設(shè)備有限公司；YCFS20-1000-S聚能式超聲波振動(dòng)棒，杭州遠(yuǎn)成超聲波科技有限公司；CF15RXII高速冷凍離心機(jī)，日本日立；CP225D電子天平，德國(guó)賽多利斯；MTN-5800氮吹儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；FE20+LE427 pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多。

1.2 試劑

L-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品、D-抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥99%，Sigma）；偏磷酸、硫代硫酸鈉、磷酸二氫鉀、草酸、磷酸、磷酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；癸胺（分析純，Sigma）；L-半胱氨酸（分析純，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HPLC色譜條件

Agilent(SB-C18，4.6×250 mm，5 μm)反相色譜柱；流動(dòng)相為磷酸二氫鉀-癸胺混合溶液，濃度分別為0.025 mol/L、4.3 mmol/L，pH=2.7；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm（抗壞血酸在244 nm～265 nm有最大吸收峰[14]）；流速0.7 mL/min；柱溫27 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用偏磷酸-硫代硫酸鈉混合溶液（濃度分別為0.25 mol/L、0.019 mol/L），將混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適當(dāng)稀釋?zhuān)渲瞥上盗谢旌蠘?biāo)準(zhǔn)品工作液，在1.3.1節(jié)所述色譜條件下，采用外標(biāo)法對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（y）和相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，見(jiàn)表1。

表1 L-抗壞血酸和D-抗壞血酸的線性方程Table 1 Regression equations of L-ascorbic acid and D-ascorbic acid

1.3.3 樣品前處理

A液制備：稱(chēng)取2～3 g樣品（精確至0.001 g）置于具塞離心管中，加入 0.25 mol/L偏磷酸和 0.019 mol/L硫代硫酸鈉混合提取液，渦旋溶解并定容至25 mL。搖勻，冰浴超聲3 s、間歇5 s，90～100個(gè)循環(huán)；0 ℃、9000 r/min離心5 min，吸取部分上清液，經(jīng)0.22 μm水相膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，用于測(cè)定L-抗壞血酸和D-抗壞血酸含量；

B液制備：取10 mL A液，離心后收集上清液于具塞離心管中，加入5 mL現(xiàn)配0.177 mol/L的L-半胱氨酸溶液，用磷酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2，常溫振蕩5 min。

再用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5～2.8，用高純水定容至25 mL。搖勻，經(jīng)0.22 μm水相膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，用于測(cè)定L-抗壞血酸的總量。

1.4 結(jié)果計(jì)算與數(shù)據(jù)處理

按下式計(jì)算試樣中抗壞血酸的含量：

式中：X為試樣中抗壞血酸含量，(mg/100 g)；C為樣液中抗壞血酸的質(zhì)量濃度，(mg/L)；C0為樣品空白液中抗壞血酸的質(zhì)量濃度，(mg/L)；V為試樣的最后定容體積，(mL)；m為實(shí)際檢測(cè)試樣質(zhì)量，(g)；1000，100均為換算系數(shù)(由mg/L換算成mg/mL的換算因子)；F為稀釋倍數(shù)(發(fā)生還原步驟為2.5)。

L-抗壞血酸、D-抗壞血酸的含量直接由上式計(jì)算得出；脫氫抗壞血酸含量由B液中測(cè)得的L-抗壞血酸總量與A液中測(cè)得的L-抗壞血酸含量之差計(jì)算得到。

測(cè)定結(jié)果用兩次平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

考察磷酸二氫鉀和癸胺的濃度對(duì)兩種抗壞血酸峰形和分離效果的影響，不同濃度組成時(shí)的HPLC圖見(jiàn)圖1。由圖中a、b和c可知，隨著癸胺濃度的提高，分離度有所提高，癸胺有增加D-抗壞血酸保留時(shí)間的作用[12]。當(dāng)磷酸二氫鉀-癸胺緩沖鹽溶液濃度分別為0.05 mol/L、8.6×10-3mol/L時(shí)分離度最佳，但太高的緩沖鹽濃度會(huì)縮短色譜柱使用壽命，因此，將磷酸二氫鉀-癸胺濃度同時(shí)減半，即濃度分別為0.025 mol/L、4.3×10-3mol/L時(shí)，分離效果最好，峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)（見(jiàn)圖1d）。出峰順序依次為L(zhǎng)-抗壞血酸、D-抗壞血酸，故選擇該濃度的緩沖鹽作流動(dòng)相。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同流動(dòng)相配比時(shí)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of standard solution at different mobile phase ratios

2.1.2 破碎處理方式對(duì)提取效果的影響

圖2 破碎處理方式對(duì)提取效果的影響Fig.2 Effect of crushing treatment on the extraction efficiency

針對(duì)果蔬樣品的前處理，對(duì)比了機(jī)械勻漿[15]和液氮冷凍研磨兩種破碎方法對(duì)提取效果的影響（見(jiàn)圖2）。機(jī)械勻漿：取100 g左右樣品，加入等質(zhì)量的提取液，經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)并混合均勻，然后取 4～6 g（精確至0.001 g）勻漿試樣，用于測(cè)試。液氮冷凍研磨：稱(chēng)取2～3 g（精確至0.001 g）樣品置于研缽中，加入適量液氮，迅速研磨至細(xì)粉，然后加入提取液混勻，全部轉(zhuǎn)移至離心管中用于測(cè)試。由圖2可知，獼猴桃果實(shí)經(jīng)機(jī)械勻漿后L-抗壞血酸獲得量為87.30 mg/100 g，經(jīng)液氮冷凍研磨獲得量為94.20 mg/100 g，兩者相差6.90 mg/100 g，經(jīng)t檢驗(yàn)，兩者在95%置信區(qū)間內(nèi)存在顯著性差異。二者比較，以液氮冷凍研磨提取效果更好。并且使用液氮研磨還有以下優(yōu)勢(shì)：樣品用量少，便于進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 提取劑的選擇

抗壞血酸具有較強(qiáng)的還原性，容易受到光照、溫度、金屬離子和貯存條件等的影響[16]，但在酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定[17]，因此選取了 0.10 mol/L草酸、0.10 mol/L磷酸、0.25 mol/L偏磷酸作為提取劑，使用羊乳粉樣品，分別做三水平添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示用0.25 mol/L偏磷酸作為提取液回收率高，且不同添加水平之間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，見(jiàn)表2。因此實(shí)驗(yàn)選取0.25 mol/L偏磷酸作為提取液。

按外標(biāo)法計(jì)算，測(cè)得此乳粉中只含有L-抗壞血酸，含量為81.50 mg/100 g，不含D-抗壞血酸，該乳粉標(biāo)簽顯示維生素C平均含量為87.29 mg/100 g，測(cè)定值為示值的93.4%。食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，維生素C的使用量為30 mg/100 g～100 mg/100g[18]，此乳粉符合標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 硫代硫酸鈉對(duì)提取物穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of Na2S2O3 on the stability of extractive

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：對(duì)比偏磷酸提取液和含硫代硫酸鈉保護(hù)劑的偏磷酸提取液，提取的樣品穩(wěn)定性。分別在4 ℃下放置0 h、6 h、16 h、24 h，依次測(cè)定其抗壞血酸含量（見(jiàn)圖3），顯然，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，偏磷酸提取的樣品抗壞血酸含量呈下降趨勢(shì)，24 h后減少40%，可見(jiàn)0.25 mol/L偏磷酸提取液提取的樣品性質(zhì)不穩(wěn)定。而當(dāng)在偏磷酸提取液中加入0.019 mol/L硫代硫酸鈉時(shí)，樣品提取物可以在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜2%，無(wú)顯著性差異（見(jiàn)圖3），且實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)需避光，說(shuō)明加入硫代硫酸鈉保護(hù)劑，可以克服批量檢驗(yàn)周期長(zhǎng)所導(dǎo)致抗壞血酸氧化的問(wèn)題，這與李野[19]研究結(jié)果吻合。

2.1.4 氮吹除氧對(duì)抗壞血酸提取效果的影響

圖4 氮吹除氧對(duì)抗壞血提取效果的影響Fig.4 Effect of the treatment (with or without nitrogen) on the extraction of ascorbic acid

研究表明，在充足的氮?dú)鈼l件下，可以有效避免抗壞血酸的損失[20]。上述 1.3.3步驟中，將提取得到的樣品溶液氮吹10 min，以排除試液和離心管中的氧氣，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖 4，獼猴桃樣品溶液氮吹除氧得到抗壞血酸含量為 93.01 mg/100 g，不除氧測(cè)得 94.20 mg/100 g，兩者無(wú)顯著差異；且除氧操作使得結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大，可能是在氮吹除氧過(guò)程中，氮吹管接觸試液導(dǎo)致樣品損失，引入操作誤差。綜上，只需將提取液預(yù)先氮吹除氧，樣品溶液無(wú)需再次除氧。

表2 提取液對(duì)回收率的影響（n=5）Table 2 Effect of extraction solution on the recoveries of ascorbic acid (n=5)

2.2 方法應(yīng)用-山楂飲料中抗壞血酸含量測(cè)定

稱(chēng)取2～3 g樣品（精確至0.001 g）置于具塞離心管中，加入1 g C18填料用于吸附樣品中的雜質(zhì)，其他操作均按照1.3.3節(jié)進(jìn)行，色譜圖見(jiàn)圖5，色譜峰峰型對(duì)稱(chēng)，兩種抗壞血酸分離度高，有一個(gè)非目標(biāo)化合物峰，無(wú)干擾。此飲料中同時(shí)含有 L-抗壞血酸、D-抗壞血酸，不含脫氫抗壞血酸。根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算，L-抗壞血酸、D-抗壞血酸含量分別為0.93 mg/100 g、1.64 mg/100 g。其中L-抗壞血酸既是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)又是抗氧化劑，D-抗壞血酸有保色的作用，抗氧化作用不大。即該飲料中有生理活性的抗壞血酸含量不到40%。

圖5 山楂飲料的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC of hawthorn beverages

3 結(jié)論

3.1 本文通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、破碎方法、提取劑的探索優(yōu)化，建立了一種同步測(cè)定食品中L-抗壞血酸、D-抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的方法。該方法可以區(qū)分測(cè)定不同構(gòu)型的抗壞血酸，前處理操作簡(jiǎn)單高效、樣品性質(zhì)穩(wěn)定，適用于水果、蔬菜、果汁和乳粉等樣品中抗壞血酸含量的測(cè)定，應(yīng)用范圍廣泛。為食品檢測(cè)行業(yè)建立標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程、準(zhǔn)確測(cè)定食品中各種抗壞血酸組分的含量及客觀評(píng)價(jià)食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供可靠了技術(shù)支持。

3.2 該方法需要將脫氫抗壞血酸還原成L-抗壞血酸，然后計(jì)算得到脫氫抗壞血酸的含量，今后研究的關(guān)鍵應(yīng)該是脫氫抗壞血酸不經(jīng)過(guò)還原而與L-抗壞血酸、D-抗壞血酸同步測(cè)定，這是具有挑戰(zhàn)性的。最佳的解決方案可能是使用通用型探測(cè)器通過(guò)檢測(cè)物理化學(xué)性質(zhì)而同步測(cè)定不同的抗壞血酸。比如，帶電氣溶膠檢測(cè)(CAD)可以分別測(cè)定不同物質(zhì)的性質(zhì)。另外，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用同步測(cè)定 L-抗壞血酸、D-抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的報(bào)道并不多見(jiàn)，這些工作需要在今后的技術(shù)方法開(kāi)發(fā)中進(jìn)一步探索。

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