張婧涵，姚忠，孫蕓，朱本偉，苑蘅，姚遠，姚競

（1.南京工業(yè)大學食品與輕工學院，江蘇南京 211800）（2.昆明旭日豐華農(nóng)業(yè)科技有限公司，云南昆明 650500）

黑木耳，又稱木耳（Auricularia auricula）屬于木耳系真菌類擔子菌綱，為我國珍貴的食用膠質(zhì)真菌。黑木耳含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、纖維素以及多種微量元素等，具有很高的營養(yǎng)價值和多種生理功能[1～5]。大量研究結(jié)果表明，多糖是木耳的主要功效成分，具有增強機體免疫力、抗氧化、抗衰老、抗動脈粥樣硬化、防癌和抗癌等生物學功能[6～10]，并可作為益生元，促進腸道益生菌的生長[11,12]。因此，近年來有關黑木耳多糖的提取及其功能研究十分活躍，研究內(nèi)容涉及木耳多糖提取條件優(yōu)化、結(jié)構(gòu)分析和體外活性評價。目前，木耳多糖的提取方法主要是熱水（或酸、堿）浸提，同時可結(jié)合酶法處理和物理場（超聲、微波）強化等。

桑木耳（Mulberry fungus），又稱桑耳、桑黑耳、桑云耳，屬黑木耳中的一種，以桑枝屑為主要原料通過人工栽培而成[13,14]。桑枝條韌皮部發(fā)達，富含纖維素，因此用桑枝屑栽培木耳，比一般雜木屑栽培木耳產(chǎn)量可以提高10%到20%。《唐本草注》有：“桑、槐、櫧、榆、柳，此為五木耳，而以桑為上乘”的記載。目前國內(nèi)外對于桑木耳多糖的研究報道很少，僅有劉銳等[15]報道了桑木耳中的一些基本成分分析，而有關桑木耳多糖的提取、結(jié)構(gòu)分析及功能性評價均未見報道。

為此，本文以云南昆明石林地區(qū)的桑木耳為原料，對桑木耳多糖水提工藝進行優(yōu)化，通過紅外光譜（FT-IR）、凝膠色譜（HPGPC）和離子色譜（HPAEC）對得到的多糖組分進行表征，并對桑木耳多糖的益生活性和體外抗氧化活性進行了評價，為桑木耳的研究開發(fā)以及資源的充分利用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑木耳，由云南省昆明旭日豐華農(nóng)業(yè)科技有限公司提供；ABTS、單糖標準品（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖），美國 Sigma公司；透析袋（MW14000），美國 GE公司；兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum，CICC 6168）和青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis，CICC 6070），中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；濃硫酸、苯酚、丙酮、石油醚、無水乙醇、氯化鈉、氯仿、正丁醇和抗壞血酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Wtherm-B5開口加熱循環(huán)浴槽，德國WIGGENS公司；RV10控制型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；C410防腐蝕隔膜真空泵，德國WIGGENS公司；高速臺式冷凍離心機 Allegra64R，美國貝克曼公司；Ultrospec 7000紫外-可見光分光光度計，美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1 桑木耳多糖的提取

稱取一定質(zhì)量的桑木耳干粉，加入 25倍體積的80%乙醇，超聲30 min，離心棄上清。得到的殘渣用真空干燥箱干燥后備用。采用熱水浸提法，將預處理后的樣品按一定的料液比、溫度和時間進行回流提取，離心，抽濾取上清，得多糖粗提液。將多糖提取液在55 ℃條件下濃縮至原體積的 1/10，加入4倍體積的無水乙醇，于4 ℃下醇沉過夜。次日離心，多糖沉淀依次用無水乙醇、丙酮和石油醚洗滌；所得沉淀以純水復溶，用Sevage法脫蛋白，透析，冷凍干燥得粗多糖。

1.3.2 桑木耳多糖提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗

對影響多糖得率的因素：料液比，提取溫度和提取時間進行考察。其中，料液比設置1:30、1:50、1:80、1:100、1:120五個水平，提取溫度設置60、70、80、90、100 ℃五個考察水平，提取時間設置 1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 h五個考察水平，改變其中一個因素，其他因素保持不變進行多糖提取。提取完成后，離心，抽濾取上清，用苯酚-硫酸法[16]測定桑木耳多糖含量，確定最佳單因素條件。每組實驗做三個平行。

1.3.2.2 響應面分析試驗

在單因素試驗的基礎上，以料液比（A）、提取溫度（B）和提取時間（C）為自變量，多糖得率（Y）為響應值，進行三因素三水平的響應面優(yōu)化分析。

1.3.3 紫外光譜分析

將凍干后的多糖溶于蒸餾水配成1.0 mg/mL的溶液，在200～400 nm進行全波長掃描，觀察其在260 nm和280 nm處有無吸收峰。

1.3.4 分子量測定

將多糖樣品用 0.05 mol/L NaNO3溶解，配成 2 mg/mL的溶液。取10 μL上樣于UltrahydrogelTM2000和 UltrahydrogelTM120串聯(lián)的水溶性凝膠色譜柱（7.8×300 mm）[17]，洗脫液為0.05 mol/L NaNO3溶液，洗脫流速為0.6 mL/min，示差折光檢測器檢測。

標準葡聚糖用同樣的方法上樣于凝膠色譜柱，制備洗脫標準曲線（方程為：logMr=-0.7139Ve+16.451，R2=0.9845）。

1.3.5 紅外光譜分析

取1.0 mg多糖樣品于瑪瑙研缽中，用藥勺切碎研細后加入100 mg KBr固體粉末，充分研磨混勻，用壓片機壓成薄片，于4000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描。

1.3.6 單糖組成分析

取1 mg多糖樣品溶于1.0 mL蒸餾水中，配成終濃度為1.0 g/L的溶液，向其中加入1.0 mL 8%硫酸溶液，于121 ℃條件下酸解1.0 h。然后，加入80 μL 50%NaOH溶液進行中和，接著離心，過0.22 μm濾膜，將濾液稀釋至5 mg/L后，上樣于CarbopacTMPA10分析柱（250 mm×2 mm），上樣量為20 μL，流動相為200 mM NaOH溶液，流速為 0.3 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測方式為標準四電位脈沖安培電流。

將阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖標準品配成溶液，上樣于CarbopacTMPA10分析柱（250 mm×2 mm），按照同樣的方法進行檢測，通過對比樣品和單糖標準品的出峰時間，確定樣品的單糖組成。

1.3.7 桑木耳多糖益生活性評價

將青春雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌分別接入PTYG液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，之后經(jīng)兩次轉(zhuǎn)管復壯后備用。

配制PTYG液體培養(yǎng)基（不加葡萄糖），調(diào)節(jié)pH至6.8。分別稱取50 mg葡萄糖和桑木耳多糖，加入菌種瓶中，每個樣品做一組平行對照。然后將配制好的液體培養(yǎng)基分裝入瓶中，分裝體積為5 mL，這樣培養(yǎng)基中碳水化合物（即糖含量）的質(zhì)量分數(shù)為 1%。另外，用不加糖的培養(yǎng)基作為對照組。將培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min，冷卻后接入200 μL復壯好的雙歧桿菌菌種，37 ℃厭氧培養(yǎng)，每隔2 h測一次OD值，繪制菌的生長曲線。

1.3.8 桑木耳多糖體外抗氧化活性評價1.3.8.1 ABTS+·自由基清除能力

將7.0 mmol/L ABTS+·溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫條件下避光反應16 h，用PBS緩沖液（pH 7.4）稀釋25倍，使其在734 nm處吸光值為 0.700±0.05，即得 ABTS+·工作液[18]。取不同濃度的多糖溶液0.2 mL，加入0.8 mL ABTS+·工作液，振搖充分混合，避光靜置15 min后，在734 nm波長處測定吸光值。計算公式為：

清除能力(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中，A1為樣品反應后的吸光值；A2為ABTS·+工作液由等體積 PBS緩沖液代替的吸光值；A0為樣品溶液由等體積純水代替的吸光值。

1.3.8.2 羥自由基（·OH）清除能力

采用水楊酸法測定多糖對·OH的清除能力[19]。在4 mL離心管內(nèi)依次加入0.25 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，0.25 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，3 mL不同濃度的多糖溶液和0.25 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，充分混勻后在室溫下靜置1 h，然后在510 nm處測定吸光值。計算公式為：

清除能力(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中，A1為樣品反應后的吸光值；A2為不加H2O2改由等體積純水代替的吸光值；A0為樣品溶液由等體積純水代替的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

分析結(jié)果以平均值±標準偏差（Mean±SD）表示，采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計，組間均數(shù)采用單因素方差分析，用q檢驗作兩兩比較，以p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑木耳多糖提取

2.1.1 單因素試驗

圖1 不同提取條件對桑木耳多糖得率的影響Fig.1 Effects of different extraction conditions on the yield ofMulberry fungus polysaccharide

按照1.3.2的方法考察了料液比、提取溫度、提取時間等單因素對多糖提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖可知，桑木耳多糖的提取得率隨著料液比的增加、提取溫度的升高以及提取時間的延長而增加，最佳的提取參數(shù)為料液比1:100、提取溫度為100 ℃、提取時間為3 h。

2.1.2 響應面試驗結(jié)果

圖2 提取次數(shù)對多糖得率的影響Fig.2 Effects of extraction times on the yield of polysaccharide

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定響應面分析試驗的因素和水平如表1。利用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 7.1.6設計實驗方案，并對實驗結(jié)果進行分析，建立了二次多元回歸方程，該方程為：Y（%）=5.40+0.33A+1.11B+0.27C+0.15AB-0.31AC+0.035BC-0.21A2-0.21B2+0.16C2，R2=0.9805。其回歸方差分析結(jié)果見表2。

表1 響應面分析試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

表2 回歸模型方差分析結(jié)果Table 2 Analysis results of regression model variance

由表2可知，二次回歸模型的p＜0.0001，表明該模型回歸非常顯著（p＜0.01）；失擬項不顯著，表明不存在失擬因素；并且 R2=0.9805，R2Adj=0.9555，說明該模型能很好的擬合實驗結(jié)果。回歸方程分析結(jié)果表明：A、B、C、AC為顯著因素（p＜0.05）。從三個影響因素的F值（A：24.68，B：284.11，C：16.62）可以看出，在所選因素水平范圍內(nèi)，對桑木耳多糖得率的影響大小為：提取溫度＞料液比＞提取時間。

由回歸模型分析結(jié)果得出，提取桑木耳多糖的最佳工藝條件為：料液比 1:107.94（m/V），提取溫度100 ℃，提取時間3.5 h，桑木耳多糖得率為6.80%。為驗證此方法的準確性，并考慮實際操作可行性，將最佳工藝參數(shù)修正為：料液比 1:108（m/V），提取溫度100 ℃，提取時間3.5 h。通過3次平行試驗驗證，結(jié)果多糖得率分別為6.97%，6.89%和7.01%，實際得率平均值為6.96%，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地預測桑木耳多糖得率。

在上述優(yōu)化的提取條件下對桑木耳中多糖進行多次提取，結(jié)果見圖 2。由圖可知，多糖總得率隨提取次數(shù)的增加而增加。當提取次數(shù)超過5次后，多糖總得率增加趨于平緩，提取10次后，桑木耳多糖得率達34.18%。

2.2 桑木耳多糖的紫外/可見光譜分析及分子量測定

圖3 多糖樣品的紫外光譜Fig.3 UV spectra of polysaccharide samples

按照 1.3.3的方法對桑木耳多糖提取物的水溶液進行全波長掃描，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，樣品溶液在260 nm和280 nm處均無明顯的吸收峰，表明樣品純度較高，不含核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。此外，按照1.3.4的方法測得桑木耳多糖的重均分子量Mw為2.09×107u，高于 Zhang[20]和 Zeng 等[21]對黑木耳（Auricularia auricula）多糖的研究結(jié)果。

2.3 紅外光譜（FT-IR）分析

圖4 多糖樣品的紅外光譜Fig.4 Infrared spectra of polysaccharide samples

如圖4所示，桑木耳多糖提取物在3400 cm-1附近的吸收峰可能是由分子間或分子內(nèi)的 O-H的伸縮振動引起的[22]；2939.03 cm-1處的吸收峰表明結(jié)構(gòu)中存在CH2-或H-C=O基團[23]；1645 cm-1附近的吸收峰表示存在C=O或C=C基團[24]；1417 cm-1處的峰可能是由糖類C-H變角振動產(chǎn)生；1251.60 cm-1處的峰是P=O基團伸縮振動吸收峰；1137.81、1068.39、1039.46 cm-1處的特征吸收為吡喃型糖苷環(huán)骨架C-O變角振動吸收峰，說明分子中存在C-O-H和糖環(huán)C-O-C結(jié)構(gòu)[25]；而 902.54 cm-1處的特征吸收表明分子中可能含有β-型糖苷鍵[26]。

2.4 單糖組成

圖5 多糖樣品的離子色譜圖Fig.5 Ion chromatogram of polysaccharide samples

按照1.3.6的方法分析了桑木耳多糖的單糖組成。結(jié)果顯示，桑木耳多糖主要由葡萄糖、木糖和甘露糖組成，其物質(zhì)的量比為1.18:0.65:2.88（圖5）。Kadnikova等[27]對黑木耳（Auricularia auricula-judae）的研究表明，其所含多糖是一種雜多糖，組成為葡萄糖、甘露糖、木糖和半乳糖，物質(zhì)的量比為8.3:5.9:1.0:0.3，這與本文的研究結(jié)果有所差異。桑木耳多糖中不含半乳糖或含量極低，而甘露糖含量則明顯較高。

2.5 桑木耳多糖的益生活性

圖6 多糖對兩歧雙歧桿菌生長的影響Fig.6 Effects of polysaccharides on the growth of Bifidobacterium bifidum

圖7 多糖對青春雙歧桿菌生長的影響Fig.7 Effects of polysaccharides on the growth of Bifidobacterium adolescentis

按照 1.3.7的方法考察了桑木耳多糖對Bifidobacterium bifidum和Bifidobacterium adolescentis生長的影響，結(jié)果見圖6和圖7。由圖可知，多糖的添加對兩種雙歧桿菌的生長均有一定促進作用。與不加糖和加入葡萄糖的培養(yǎng)基相比，添加桑木耳多糖可有效提前兩種益生菌的對數(shù)生長期，其中添加桑木耳多糖對Bifidobacterium bifidum的促進作用優(yōu)于

Bifidobacterium adolescentis。

2.6 桑木耳多糖的體外抗氧化活性

2.6.1 桑木耳多糖對ABTS+·自由基的清除能力

由圖 8可知，桑木耳多糖具有顯著的清除ABTS+·自由基的能力，且清除率與多糖濃度呈良好的劑量效應關系。當濃度為10 mg/mL時，桑木耳多糖對 ABTS+·自由基的清除率高達 98.93%，接近于 Vc對 ABTS+·自由基的清除率，而黑木耳多糖在相同條件下對ABTS+·自由基的清除率僅為81.7%[21]。

圖8 多糖對ABTS+·自由基的清除能力Fig.8 Scavenging ability of polysaccharide on the ABTS free radicals

2.6.2 桑木耳多糖對羥自由基（·OH）的清除能力

圖9 多糖對羥自由基的清除能力Fig.9 Scavenging ability of polysaccharide on the hydroxyl radical

如圖9所示，桑木耳多糖對·OH的清除率也呈一定的量效關系。在濃度為10 mg/mL時，桑木耳多糖對·OH 的清除率最高，可達 71.28%，IC50值為 2.46 mg/mL。Zeng等[21]的研究表明，黑木耳多糖對·OH的清除率IC50值為9.01 mg/mL，可知桑木耳多糖對·OH的清除能力相較于黑木耳多糖更為高效。

3 結(jié)論

本文以產(chǎn)自云南昆明石林地區(qū)的桑木耳為原料，優(yōu)化了桑木耳多糖的水提工藝條件，并對桑木耳多糖提取物的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及活性進行了研究，得到的具體結(jié)論如下：

3.1 通過單因素試驗和響應面優(yōu)化方法得到桑木耳多糖的最佳提取條件為：料液比 1:108（m/V），提取溫度100 ℃，提取時間3.5 h，桑木耳多糖的一次提取率為6.96%。經(jīng)10次重復提取，桑木耳多糖的總得率達34.18%。

3.2 經(jīng)測定，桑木耳多糖的重均分子量為2.09×107u，其中主要的單糖組分是葡萄糖、木糖和甘露糖，物質(zhì)的量比為1.18:0.65:2.88。

3.3 紅外光譜顯示，桑木耳多糖提取物中存在O-H、CH2-（或H-C=O）、C=O（或C=C）和C-H等官能團的特征吸收峰，以及吡喃型糖苷環(huán)骨架C-O變角振動吸收峰（說明分子中存在C-O-H和糖環(huán)C-O-C結(jié)構(gòu)）和β-型糖苷鍵的特征吸收。

3.4 活性分析結(jié)果表明，桑木耳多糖可有效促進Bifidobacterium bifidum和Bifidobacterium adolescentis的生長和增殖，具有顯著的益生活性；同時，桑木耳多糖對ABTS+·自由基、羥基自由基（·OH）也有明顯的清除作用。桑木耳多糖濃度為 10 mg/mL時，對ABTS+·自由基、羥基自由基的清除率分別達到98.93%和71.28%，清除效果優(yōu)于已報道的黑木耳多糖。

綜上所述，桑木耳作為一種我國特有的食用菌資源，其多糖含量、組成、性質(zhì)均與已報道的黑木耳（Auricularia auricula-judae）多糖存在較大差異。此外，桑木耳多糖對益生菌增殖具有明顯的促進作用，并有較好的自由基清除能力。以上研究結(jié)論將有助于進一步豐富對桑木耳多糖結(jié)構(gòu)和活性的認識，并為桑木耳資源的深加工應用奠定理論基礎。

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