★周年 劉波 徐彭（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南昌 330004；2.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 南昌 330029；3.江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心 南昌 330029；4.江西省中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），有自我復(fù)制、更新及多向分化潛能的成體多能干細(xì)胞，在不同的誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等成熟的間質(zhì)細(xì)胞［1-3］，在骨病防治中有重要意義。目前主要采用全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面分子標(biāo)記分選法和細(xì)胞篩選法等方法進(jìn)行分離［4-5］，其中全骨髓貼壁法分離的細(xì)胞活性高，增殖能力強(qiáng)，但對(duì)于細(xì)胞骨向分化和脂向分化能力的明確評(píng)價(jià)并不清楚。因此，本研究主要采用全骨髓貼壁法獲取骨髓細(xì)胞P3代，考察其骨向分化和脂向分化能力，為骨病防治研究和組織工程研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級(jí)雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠，3月齡，體重150g左右，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，室溫控制在20℃～22℃，恒濕，光照與環(huán)境一致，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水，實(shí)驗(yàn)前12h禁食。3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購(gòu)于Sigma公司；4-硝基苯磷酸二鈉購(gòu)于成都西亞試劑公司；Anti-Mouse/Rat CD29 FITC（E17759103）、Anti-Rat CD45 FITC（E17627102）、Anti-Mo/RatCD90.1（Thy1.1） PE（E013771631）、Anti-Rat CD11b/c PE（E15919105）均購(gòu)于eBioscience公司；β-甘油磷酸鈉、胰島素、地塞米松、L-抗壞血酸、油紅O、茜素紅等均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，并配制骨向分化誘導(dǎo)液（β-甘油磷酸鈉、地塞米松、L-抗壞血酸）和脂向分化誘導(dǎo)液（地塞米松、胰島素、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤）。

1.2 方法

1.2.1 全骨髓貼壁法分離骨髓細(xì)胞及傳代培養(yǎng) 3月齡SD雌性大鼠脫臼處死，75%酒精浸泡10min，無(wú)菌條件下分離后肢的雙側(cè)脛骨及股骨，剔除周邊的肌肉、肌腱及結(jié)締組織，剪去兩端的骨骺端，充分暴露骨髓腔，以5mL注射器吸取LG-DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔至變白。收集骨髓懸液置于10mL離心管，低速離心1000rpm×5min，棄上清，以3mL新鮮含15%胎牛血清的LG-DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度以1×106cells/mL進(jìn)行接種，然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，并置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。72h首次半量更換培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基前，輕輕振蕩培養(yǎng)瓶3～4次，充分使非貼壁細(xì)胞通過(guò)更換培養(yǎng)基而清除，以后每4d全量更換培養(yǎng)基1次，同樣采取輕度振蕩篩選細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況，此時(shí)細(xì)胞即為骨髓P0代細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，以胰酶消化，進(jìn)行傳代擴(kuò)增，此時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓P1代細(xì)胞，同樣方法，依次消化傳代并記作骨髓細(xì)胞P2～P3代等，最終取骨髓P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定，以確定其分化功能適合作為種子細(xì)胞。

1.2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)觀(guān)察 自原代培養(yǎng)開(kāi)始通過(guò)顯微鏡下觀(guān)察大鼠骨髓細(xì)胞的形態(tài)。

1.2.2.2 骨髓細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定 取P3代大鼠骨髓細(xì)胞，以不含EDTA的胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為106～107/mL，以直接免疫熒光法針對(duì)細(xì)胞表面抗原檢測(cè)細(xì)胞免疫表型，用胎牛血清配制的FACS緩沖液1500rpm×3min，重懸洗滌后，各管分別加入CD29、CD45、CD11b/c、CD90.1等標(biāo)志物抗體及同型對(duì)照抗體，室溫避光孵育30min，PBS緩沖液洗滌離心3000rpm×3次，1%多聚甲醛固定，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2.3 骨髓細(xì)胞骨向分化能力鑒定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代骨髓細(xì)胞，以1×105cells/mL密度接種于24孔板中，實(shí)驗(yàn)分為兩組，即對(duì)照組和誘導(dǎo)組，每組6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組正常換液，誘導(dǎo)組則加入骨向分化誘導(dǎo)液，每3d換液1次，光鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化。

堿性磷酸酶染色：經(jīng)骨向分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)12 d后取出培養(yǎng)板，以PBS沖洗，95%乙醇固定細(xì)胞10min，以改良鈣鈷法制備，光鏡下觀(guān)察。

堿性磷酸酶活力檢測(cè)（ρNPP法）：經(jīng)骨向分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)12d后取出培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗2遍，每孔加入細(xì)胞裂解液300μL（0.1%Triton X-100），4℃作用30min，收集裂解液采用對(duì)硝基酚磷酸鹽法測(cè)定堿性磷酸酶濃度，以ρNPP為底物，根據(jù)水解磷酸酯鍵所產(chǎn)生的對(duì)硝基酚基測(cè)定酶活力。

礦化結(jié)節(jié)染色：取出誘導(dǎo)21d的培養(yǎng)板，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS清洗，95%乙醇固定20min，以0.1%茜素紅染色，光鏡下觀(guān)察。

1.2.2.4 細(xì)胞脂向分化能力鑒定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代骨髓細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cells/mL接種24孔培養(yǎng)板上。實(shí)驗(yàn)分為兩組，即對(duì)照組和誘導(dǎo)組，每組6個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組正常換液，誘導(dǎo)組則加入脂向分化誘導(dǎo)液，每3d換液1次，光鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。

油紅O染色：誘導(dǎo)12d后取出孔板，PBS清洗，95%乙醇固定10min，PBS清洗1遍，60%異丙醇濕潤(rùn)2min，吸出異丙醇后加入已過(guò)濾好的油紅O工作液染色15min；60%異丙醇分色至背景無(wú)色，光鏡下觀(guān)察。

油紅O染液半定量法：利用異丙醇充分溶解油紅O染液，520nm處檢測(cè)胞內(nèi)殘留染液的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均用表示，SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行One-way ANOVA檢驗(yàn)比較多組數(shù)據(jù)間差異顯著性，P＜0.05為差異具有顯著性，P＜0.01為差異具有極顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨髓細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀(guān)察 原代培養(yǎng)時(shí)，全骨髓貼壁法分離的骨髓細(xì)胞呈圓形，胞體透亮，大小不一，與周?chē)募t細(xì)胞等血系細(xì)胞相互混雜。72h半量換液后可見(jiàn)大量貼壁細(xì)胞，6～7d貼壁分裂細(xì)胞形成不同大小、分散的細(xì)胞集落，9～10d細(xì)胞逐漸融合成片，相互緊密貼附生長(zhǎng)。細(xì)胞消化傳代至第3代，可見(jiàn)細(xì)胞呈均勻分布的紡錘形平均生長(zhǎng)，呈典型的漩渦狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察（×100）

2.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定 流式細(xì)胞法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，P3代細(xì)胞CD90、CD29陽(yáng)性表達(dá)率分別為96.4%和78.5%，而CD45、CD11b/c陽(yáng)性比率分別為2.0%和1.9%，見(jiàn)圖2。由于CD90和CD29為間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD45、CD11b/c為造血系細(xì)胞表面標(biāo)志物，結(jié)果表明，P3骨髓細(xì)胞絕大多數(shù)為大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定P3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力鑒定

2.3.1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化能力鑒定 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)骨向誘導(dǎo)后形態(tài)由原來(lái)的紡錘形逐漸轉(zhuǎn)化為多角形、方形等，較對(duì)照組細(xì)胞體積更大，細(xì)胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，胞外可見(jiàn)許多黑色細(xì)小顆粒（見(jiàn)圖3）。骨向誘導(dǎo)12d后以改良鈣鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶染色，胞漿內(nèi)呈現(xiàn)深棕色或深黑色顆粒狀或大片狀黑色沉淀（見(jiàn)圖4），同時(shí)堿性磷酸酶活力明顯升高（P＜0.05，見(jiàn)圖5）；骨向誘導(dǎo)21d后運(yùn)用茜素紅進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)染色，光鏡下誘導(dǎo)組可見(jiàn)細(xì)胞融合重疊生長(zhǎng)，形成明顯的紅色致密結(jié)節(jié)，周?chē)史派錉钔黄穑砻骷?xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)（見(jiàn)圖6）。

圖3 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)形態(tài)觀(guān)察（×200）

圖4 P3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)12d堿性磷酸酶染色（×100）

圖5 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)堿性磷酸酶活力

圖6 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)礦化結(jié)節(jié)染色（×100）

2.3.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂向分化能力鑒定 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)脂向誘導(dǎo)后形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)閳A形、多角形等，誘導(dǎo)前期可見(jiàn)折光性強(qiáng)的圓形小脂滴，后期小脂滴逐漸增多融合成大脂滴，并將細(xì)胞核擠于一側(cè)，脂向誘導(dǎo)12d后用油紅O染色顯示脂滴呈紅色（見(jiàn)圖7），同時(shí)利用異丙醇充分溶解油紅O染液的原理，對(duì)殘留染液進(jìn)行了半定量檢測(cè)。脂向誘導(dǎo)組較對(duì)照組明顯升高OD值，具有極顯著性差異（P＜0.01，見(jiàn)圖8）。

圖7 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂向誘導(dǎo)倒置顯微鏡下觀(guān)察（×200）

圖8 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞脂向分化脂質(zhì)累積值

3 討論

MSCs是一種起源于中胚層，在體外不同的誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等成熟的間質(zhì)細(xì)胞，在骨髓最為常見(jiàn)，研究得最深入，目前主要采用全骨髓貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)［6-8］。但對(duì)于分離的骨髓細(xì)胞目前并沒(méi)有單一的特異性的方法來(lái)鑒定BMSCs。本研究采用全骨髓貼壁法進(jìn)行分離培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，傳代過(guò)程中充分利用細(xì)胞輕度振蕩來(lái)清除不貼壁細(xì)胞，提高細(xì)胞純度。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞傳至第3代，細(xì)胞在顯微鏡下可見(jiàn)紡錘形生長(zhǎng)，呈典型漩渦狀。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD90與CD29的陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為96.4%和78.5%；CD45和CD11b/c的陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為2.0%和1.9%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9-11］，同時(shí)加入經(jīng)典骨向誘導(dǎo)劑和脂向誘導(dǎo)劑，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，較對(duì)照組細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)明顯的深棕色或大片狀黑色沉淀，顯著升高ALP活力，且可見(jiàn)明顯的紅色致密結(jié)節(jié)，周?chē)史派錉钔黄?，表明?xì)胞聚集生長(zhǎng)，逐漸形成礦化結(jié)節(jié)，充分表明BMSCs成功分化成了成骨細(xì)胞。在脂向誘導(dǎo)劑組初期可見(jiàn)折光性強(qiáng)的圓形小脂滴，經(jīng)油紅O染色后，誘導(dǎo)組可見(jiàn)被染成紅色的脂滴，采用異丙醇溶解油紅O染液半定量檢測(cè)，顯示脂向誘導(dǎo)組OD值明顯升高，進(jìn)一步確定MSCs成功分化為脂肪細(xì)胞。這些結(jié)果一定程度上與國(guó)際社會(huì)公認(rèn)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞依據(jù)相符，即細(xì)胞的貼附特性、細(xì)胞標(biāo)志物CD90，CD45等的表達(dá)和能否分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等。

綜合形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)志物及骨向分化和脂向分化誘導(dǎo)BMSCs結(jié)果，顯示全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，充分利用細(xì)胞輕度振蕩，培養(yǎng)至P3代的BMSCs具有骨向分化和脂向分化能力，可用于骨病防治研究和骨組織工程研究。

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