李雪妹， 劉 暢， 單 羽， 李雪梅

(沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽 110034)

植物生長于自然界會受到諸多因素的影響。在非生物脅迫中水分脅迫對植物產(chǎn)生的影響不容小覷，近年來隨著全球氣候的不斷變化，干旱脅迫已成為水稻生長過程最易遭受的逆境因子之一[1]。干旱引起植物體內(nèi)代謝的變化，嚴重影響了農(nóng)作物的生長和產(chǎn)量。

正常情況下，植物體內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)。但是當植物受到逆境脅迫時，其體內(nèi)會產(chǎn)生大量的氧自由基，于是體內(nèi)清除過剩自由基的抗氧化保護系統(tǒng)會啟動[2]?？寡趸竿っ傅暮铣珊突钚允冀K受到遺傳基因的控制和調(diào)節(jié)，不良環(huán)境常引起基因變異而使酶結(jié)構(gòu)及其活性改變，進而導(dǎo)致同工酶酶譜變化[3]。李國龍的研究表明通常耐旱作物在干旱條件下能使保護酶活力維持在一個較高水平[4]。曾秀存等在對白菜型冬油菜的研究中指出Cu/Zn-SOD基因是低溫誘導(dǎo)條件下差異表達的基因，其表達可減輕或抵抗低溫條件下產(chǎn)生的活性氧對根部傷害[5]。李敬蕊等發(fā)現(xiàn)低氧脅迫下，甜瓜幼苗根系的SOD、POD1、POD2、CAT、APX基因表達水平上調(diào)，根系和葉片的SOD、POD、CAT、APX的活性、同工酶表達增強[6]。Li等也提出較低水平的ROS可以誘導(dǎo)抗氧化酶基因表達上調(diào)[7]。本試驗采用10% PEG預(yù)處理和15% PEG直接處理水稻，檢測抗氧化酶活性以及抗氧化酶相關(guān)基因的表達水平并分析其變化，探討水分預(yù)處理是否能通過對抗氧化酶及其基因表達的調(diào)節(jié)來提高水稻的抗旱性，從而進一步探究水稻的抗旱機制。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)

試驗于2015年在沈陽師范大學(xué)實驗中心進行，將水稻種子(遼星1號)28 ℃浸種48 h，30 ℃催芽24 h。將催芽后的種子播種于裝有改良Hoagland完全營養(yǎng)液的塑料燒杯中，放置在光照強度為300 μmol/(m2·s)，相對濕度為80%，28 ℃光照12 h、22 ℃黑暗12 h為一周期的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試驗處理

幼苗長至2 cm左右時進行如下處理：(1)對照1，水稻始終用完全營養(yǎng)液培養(yǎng)；(2)預(yù)處理復(fù)水組，10% PEG預(yù)處理 3 d(階段一)，進行復(fù)水處理3 d(階段二)，15% PEG脅迫處理3 d(階段三)；(3)對照2，階段一、階段二均為完全營養(yǎng)液培養(yǎng)，階段三為15% PEG脅迫處理；(4)預(yù)處理組，階段一為完全營養(yǎng)液培養(yǎng)，階段二為10% PEG預(yù)處理，階段三為15% PEG脅迫處理。分別在處理階段一的0、6、12、24、48、72 h取對照1、預(yù)處理復(fù)水組的葉片以及處理階段三的24、48、72 h取4種處理的葉片進行抗氧化酶同工酶的檢測。在處理階段三的72 h分析所有處理葉片抗氧化酶的基因表達。

1.3 檢測方法

1.3.1 同工酶檢測 將新鮮的根取1 g加入預(yù)冷pH值為 7.8 的50 mmol/L磷酸緩沖液(含0.1 mmol/L EDTA，10 g/L PVP)，研磨成勻漿，15 000 r/min、4 ℃離心15 min，上清液即為酶液?？寡趸竿っ阜治霾捎么怪卑寰郾０纺z電泳PAGE)法，參照胡能書等的方法[8]制備凝膠，對SOD、POD、CAT同工酶進行分離、染色以及準備電泳條件。

1.3.2 SOD、APX1、CAT1的mRNA表達分析 參照孫德權(quán)等的方法[9]進行RNA提取，SOD、APX1、CAT1的mRNA表達采用RT-PCR檢測。表1為PCR擴增引物。

表1PCR擴增上游和下游引物核酸序列

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG預(yù)處理對水分脅迫下抗氧化酶同工酶的影響

2.1.1 對水稻根系SOD同工酶的影響 水稻在10%PEG(階段一)預(yù)處理下SOD同工酶酶譜變化(圖1-A)，10%PEG預(yù)處理組與對照1相比酶Ⅱ的酶帶變窄，顏色變淺。伴隨著水稻幼苗的生長，酶Ⅱ、Ⅲ譜帶在預(yù)處理組和對照1中均表現(xiàn)為增強的趨勢。在水稻整個脅迫過程中(階段三)SOD同工酶活性呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在脅迫24 h時，酶活性增大最為明顯(圖1-B)。經(jīng)過預(yù)處理的水稻根系的SOD同工酶活性與對照1同工酶活性沒有明顯變化，而未經(jīng)過預(yù)處理的水稻中的SOD同工酶活性有明顯的增大跡象。由此推斷，PEG預(yù)處理可以提高水稻對水分脅迫的抗性。

2.1.2 對水稻根系POD同工酶的影響 水稻在10% PEG(階段一)預(yù)處理下POD同工酶活性主要表現(xiàn)出上升的趨勢(圖2-A)。對照1與預(yù)處理組相比較，酶Ⅲ和酶Ⅳ的酶帶變寬，顏色加深，說明10% PEG預(yù)處理在一定程度上抑制了這2種酶的活性。當水稻在15% PEG(階段三)脅迫時，POD同工酶變化趨勢見圖2-B。此階段水分脅迫相較階段一更加明顯，此階段中酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的酶帶較寬，顏色較深，而酶Ⅳ、Ⅴ的酶帶寬度在預(yù)處理組中隨著脅迫時間的增加呈現(xiàn)出先變窄后變寬的趨勢。在脅迫72 h后對照2出現(xiàn)酶Ⅳ、Ⅴ，而對照1在脅迫過程中一直未出現(xiàn)酶Ⅳ、Ⅴ，相反預(yù)處理組一直有這2種酶。由此推斷酶 Ⅳ、Ⅴ是預(yù)處理后新誘導(dǎo)出與水稻水分脅迫相關(guān)的酶。

2.1.3 對水稻根系CAT同工酶的影響 水稻在10% PEG(階段一)預(yù)處理下CAT總活性較小(圖3-A)。在預(yù)處理后的12 h和6 h，酶Ⅰ、酶Ⅱ才出現(xiàn)，且酶Ⅰ的譜帶在整個脅迫過程逐漸變寬，說明10% PEG在一定程度上抑制了CAT同工酶的表達。當水稻在15% PEG(階段三)脅迫時，CAT同工酶活性整體上表現(xiàn)出先上升后下降然后再上升的趨勢(圖3-B)。預(yù)處理組的CAT同工酶酶帶顏色較深，而預(yù)處理復(fù)水組與對照1的酶帶沒有明顯的差異。由此推斷，PEG預(yù)處理提高了水稻CAT同工酶對再次脅迫的應(yīng)答能力，使其再次遭受更強的脅迫時能夠快速應(yīng)答，減少水分脅迫給植物體帶來的傷害。

2.2 PEG預(yù)處理對水分脅迫下抗氧化酶基因表達的影響

在不同的處理下SOD抗氧化酶基因表達水平不同，預(yù)處理復(fù)水組的Cu/Zn-SOD表達水平明顯低于其他各組，相反直接遭受更強水分脅迫的對照2基因的表達水平遠遠高于其他各組，而預(yù)處理組基因表達水平居于二者之間(圖4)。APX1基因的表達水平在不同處理下也不相同，預(yù)處理復(fù)水組與對照1的表達水平相似并且低于對照2，而預(yù)處理組的基因表達卻遠遠高于其他各組。對于CAT1基因而言，對照2的基因表達水平高于其他各組，預(yù)處理組的表達水平低于預(yù)處理復(fù)水組但高于對照1。整體來看，未經(jīng)過預(yù)處理的對照2中的抗氧化酶Cu/Zn-SOD、APX1和CAT1基因的表達水平要高于經(jīng)過預(yù)處理的各組，說明預(yù)處理可以提高水稻根系的抗性，當其遭受更強的水分脅迫時抗氧化酶基因依舊可以以較低的表達水平應(yīng)對。但預(yù)處理組Cu/Zn-SOD和APX1的表達水平仍然高于預(yù)處理復(fù)水組，以此推斷出復(fù)水階段可以使抗氧化酶基因系統(tǒng)有一個很好的恢復(fù)，使其能應(yīng)對更強的水分脅迫。水分預(yù)處理可以很好地提高水稻根系抵抗水分脅迫的能力，使水稻幼苗更耐旱。

3 討論

3.1 預(yù)處理對水分脅迫下抗氧化酶同工酶的影響

SOD、POD、CAT都是植物重要的保護酶，與品種的抗旱性密切相關(guān)，在植物抗旱過程中發(fā)揮著極大的作用，是衡量作物抗旱性強弱的重要生理指標[10-11]。夏民旋等在超氧化物歧化酶與植物抗逆性的試驗中提到SOD參與植物應(yīng)答水分脅迫，并在其中起到重要的作用[12]。在本試驗中SOD的活性呈現(xiàn)出短時間脅迫升高，長時間脅迫或遭受到更強的水分脅迫時降低的趨勢。這與李曉青等提到的在不同濃度的水分脅迫下抗氧化酶同工酶的活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢相似[13]。有研究結(jié)果表明，不同植物的SOD、POD、CAT活性對干旱的響應(yīng)有所差別，不同干旱程度對SOD、POD、CAT活性的影響也不相同[14]。在左應(yīng)梅等對干旱脅迫下 4種人參屬植物抗性生理指標的研究中顯示，POD在4種人參屬的植物中的變化趨勢和變化幅度都不同[15]。本研究中POD活性在預(yù)處理組中呈現(xiàn)出上升的趨勢，但是在遭受到更強的水分脅迫時其活性表現(xiàn)為先下降后上升的走向，并且還伴有新的酶帶Ⅴ產(chǎn)生，這一系列變化都說明水稻幼苗的根系在適應(yīng)水分脅迫。此外，10% PEG預(yù)處理階段在處理后的12 h和 6 h 出現(xiàn)了CAT同工酶新酶帶酶Ⅰ與酶Ⅱ，這說明在預(yù)處理階段有新的酶帶產(chǎn)生，并且經(jīng)過預(yù)處理的水稻幼苗根系中CAT的活性要高于未經(jīng)處理的對照，此結(jié)論與石鵬的研究結(jié)果[16]相似。

3.2 預(yù)處理對水分脅迫下抗氧化酶基因表達的影響

有研究表示抗氧化酶活性與其基因的表達量具有顯著的相關(guān)性[17]。張秀海等提出植物抗旱性的提高是通過干旱改變基因表達而引發(fā)的，這是一個長期進化的結(jié)果[18]。在不同的器官中，基因的積累表達量存在明顯的差異[19]。不同的抗氧化酶基因在干旱及復(fù)水過程中呈現(xiàn)出不同的表達圖譜，并且相同的酶在不同品種中基因表達水平也不相同[20]。李耀文提到小麥中CAT1和CAT2的表達量隨著干旱條件的變化而發(fā)生改變，尤其在嚴重干旱時表達量顯著增強[21]。在本試驗中干旱脅迫明顯增加了SOD、APX和CAT的表達水平，未經(jīng)預(yù)處理的對照2譜帶顏色明顯比預(yù)處理組深，說明經(jīng)過預(yù)處理的各組抗氧化酶Cu/Zn-SOD、APX1和CAT1基因的表達水平低于未經(jīng)預(yù)處理的對照，這與張玉秀等提到的鎘能在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控抗氧化物同工酶基因的表達，提高其酶活性水平的研究結(jié)果[22]相似。黃靜等通過對麻瘋樹的研究發(fā)現(xiàn)對照組和干旱脅迫組的與滲透感受器相關(guān)的基因表達存在著明顯差異，說明干旱可以誘導(dǎo)麻瘋樹的某些基因表達[23]。在試驗中預(yù)處理組抗氧化酶基因Cu/Zn-SOD和APX1的表達水平要高于預(yù)處理復(fù)水組，這就表示預(yù)處理后的復(fù)水能很好地使植物自身得到一個調(diào)節(jié)，使抗氧化酶基因的表達水平維持在一個正常的水平，使植物可以更好地適應(yīng)更強的水分脅迫。由此可見，適當?shù)乃置{迫可以通過提高抗氧化酶基因的表達水平來應(yīng)對外界環(huán)境給予植物的水分脅迫[24-25]，使植物可以更迅速地適應(yīng)外界環(huán)境。

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