唐飛 徐娟 邵明君

21世紀(jì)人口老齡化對(duì)人類社會(huì)是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)，我國(guó)目前已步入老年型社會(huì)，相關(guān)老年疾病如骨質(zhì)疏松癥、心血管疾病、感染性疾病、尿失禁等嚴(yán)重影響絕經(jīng)婦女的生活質(zhì)量。隨著2002年婦女健康倡議研究問(wèn)世，有關(guān)激素治療的臨床應(yīng)用與利弊分析再次成為世界各國(guó)關(guān)注的熱點(diǎn)。眾所周知，人類內(nèi)分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)相互影響，雌激素（E2）通過(guò)影響細(xì)胞因子分泌而影響免疫功能[1]，然而有關(guān)絕經(jīng)期細(xì)胞因子模式的詳盡報(bào)道國(guó)內(nèi)較少。本研究觀察E2缺乏狀態(tài)下年輕與老齡化小鼠之間是否存在免疫系統(tǒng)的差異，為進(jìn)一步研究E2缺乏和免疫老化的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為臨床E2治療對(duì)絕經(jīng)婦女免疫功能的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雌性C57BL/6小鼠100只，鼠齡2月齡（75只）和10月齡（25只），由杭州師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。2月齡小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為手術(shù)去卵巢組、藥物去卵巢組和發(fā)情間期組，10月齡小鼠擬為自然絕經(jīng)組，每組25只；其中手術(shù)去卵巢組、藥物去卵巢組和自然絕經(jīng)組為3組實(shí)驗(yàn)組，發(fā)情間期組為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作 （1）手術(shù)去卵巢組：每只小鼠腹腔注射3%戊巴比妥40mg/kg麻醉，經(jīng)鼠背面切口切除雙側(cè)卵巢[2]；（2）藥物去卵巢組：每只小鼠背部肌肉注射丙氨瑞林（安徽豐原制藥股份有限公司，批號(hào)：20041904）100μg/（kg·d），連續(xù)3個(gè)月[3]；用藥后20d逐只進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，顯微鏡下觀察小鼠動(dòng)情周期變化，1次/d，連續(xù)5d內(nèi)不出現(xiàn)動(dòng)情周期者為去勢(shì)成功。（3）自然絕經(jīng)組和對(duì)照組：無(wú)干預(yù)措施，普通級(jí)飼養(yǎng)。

1.2.2 小鼠發(fā)情間期和絕經(jīng)期的判定 采用陰道細(xì)胞學(xué)檢查，用小棉簽蘸取少量0.9%氯化鈉溶液，擦取小鼠陰道內(nèi)分泌物順時(shí)針涂在載玻片上晾干，用95%乙醇溶液固定，經(jīng)HE染色后在10×10倍光鏡下觀察。若鏡下見(jiàn)有大量白細(xì)胞及少量有核細(xì)胞為發(fā)情間期[4]，全部是無(wú)核角化細(xì)胞或間有少量上皮細(xì)胞為發(fā)情期；連續(xù)5d鏡下觀察陰道分泌物涂片，呈現(xiàn)不規(guī)則動(dòng)情周期者為絕經(jīng)期[5]。手術(shù)去卵巢組、藥物去卵巢組于手術(shù)或使用藥物后20d開(kāi)始判定，自然絕經(jīng)組和發(fā)情間期于3個(gè)月后開(kāi)始判定，所有小鼠3個(gè)月后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前4h采用刀豆蛋白A（Con A）（10mg/kg）尾靜脈注射直接誘導(dǎo)靜息T細(xì)胞的活化、增殖和分化[6]。

1.2.3 各組血清免疫球蛋白（Ig）M、IgG、IgA和E2水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)采用斷頸處死法取小鼠雙眼眶靜脈血，經(jīng)2 325r/s離心后取出血清，置于-80℃低溫冰箱保存送檢，采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)各組血清IgM、IgG、IgA和E2水平。待測(cè)樣品孔加入樣本40μl，然后各加入抗 E 抗體 10μl、鏈霉親和素-HRP 50μl，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60min；每孔加滿洗滌液，重復(fù)洗滌3次；每孔加入顯色劑100μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min；最后每孔加終止液50μl終止反應(yīng)，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD）值。

1.2.4 CD4/CD8比值檢測(cè) 每管加入熒光抗體CD8a 2μl+CD4 2μl+CD3 5μl+CD45 2μl，加入小鼠全血（EDTA 抗凝）100μl，混勻。陰性對(duì)照管：僅全血 100μl，不加試劑。室溫避光20min，加入1 000μl溶血?jiǎng)?min后1 500r/min離心5min，去除上清液。加入PBS緩沖液（血液分析儀鞘液）1 000μl，混勻，1 500r/min 離心 5min，去上清液，加入PBS緩沖液（血液分析儀鞘液）100μl，混勻。流式細(xì)胞分析儀設(shè)門(mén)，樣本上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。取小鼠新鮮脾臟組織100mg，經(jīng)液氮冰凍后Trizol法提取總RNA用以檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表達(dá)水平，引物由上海生工生物有限公司合 成 ，IL-2 mRNA 正 義 引 物 ：5′-TACAGCGGAAGCACAGCA-3′，反義引物：5′-CGCAGAGGTCCAAGTTCATC-3′；IL-4 mRNA 正義引物：5′-AACGAGGTCACAGGAGAAGG-3′，反義引物：5′-TTGGAAGCCCTACAGACGAG-3′；IL-5 mRNA 正義引物：5′-CCCTCATCCTCTTCGTTGC-3′，反義引物：5′-ATCCTCCTGCGTCCATCTG-3′；IL-10 mRNA 正義引物：5′-TGCACTACCAAAGCCACAAG-3′，反義引物：5′-TGATCCTCATGCCAGTCAGT-3′；以 β-actin 作為內(nèi)參照，正義引物：5′-GCATGGCCTTCCGTGTTC-3′，反義引物：5′-GATGTCATCATACTTGGCAGGTTT-3′。RT-PCR反應(yīng)體系如下:熒光標(biāo)記染料 2×SYBR Green I Master Mix 5μl，正義引物 0.2μl，反義引物 0.2μl，小鼠脾臟 cDNA 1μl，滅菌三蒸水補(bǔ)至總體積 10μl。條件為：95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 10s，72℃ 15s，72℃ 5min，39 個(gè)循環(huán)。將以上 PCR 擴(kuò)增試劑加入96孔反應(yīng)板中，離心3min，3 000r/min，然后放入Bio-Rad CFX-384熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用SDS分析軟件（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清E2水平比較 3組實(shí)驗(yàn)組小鼠血清E2水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；而3組實(shí)驗(yàn)組小鼠血清E2水平兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 各組小鼠血清IgM、IgG、IgA水平比較 3組實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgM、IgG水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。手術(shù)去卵巢組小鼠血清IgM、IgG和IgA水平均低于藥物去卵巢組和自然絕經(jīng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠血清E2水平比較

表2 各組小鼠血清IgM、IgG、IgA水平比較（μg/ml）

2.3 各組小鼠血清CD4/CD8比值比較 自然絕經(jīng)組CD4/CD8比值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；手術(shù)去卵巢組、藥物去卵巢組與對(duì)照組CD4/CD8比值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清CD4/CD8比值比較

2.4 各組小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表達(dá)水平比較 3組實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-2、IL-4、IL-5 mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；各組小鼠IL-10 mRNA表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表4。

3 討論

隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體產(chǎn)生抗體減少，固有免疫和非特異性免疫功能均下降，有證據(jù)表明，除了年齡因素以外，絕經(jīng)期卵巢功能下降導(dǎo)致E2缺乏可能與此變化有關(guān)[7]，而E2治療可以阻止或恢復(fù)部分免疫缺陷，維持細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡[8]。有研究提示性激素與婦女免疫功能關(guān)系密切，可能通過(guò)免疫系統(tǒng)影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[9]。然而，E2缺乏和免疫老化的關(guān)系仍未明確，有關(guān)絕經(jīng)小鼠細(xì)胞因子模式的報(bào)道國(guó)內(nèi)較少。筆者前期的實(shí)驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)去卵巢小鼠進(jìn)行3個(gè)月生理劑量E2補(bǔ)充，未發(fā)現(xiàn)對(duì)Ig有影響[10]，故本研究進(jìn)一步通過(guò)手術(shù)和藥物去卵巢小鼠經(jīng)Con-A刺激后檢測(cè)E2缺乏狀態(tài)下年輕與老齡化小鼠之間是否存在此類細(xì)胞因子表達(dá)的差異，以證實(shí)E2是否影響此類細(xì)胞因子表達(dá)。

表4 各組小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表達(dá)水平比較

本研究發(fā)現(xiàn)3組實(shí)驗(yàn)組小鼠血清E2水平均明顯低于對(duì)照組，自然絕經(jīng)組CD4/CD8比值低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；手術(shù)去卵巢組、藥物去卵巢組與對(duì)照組CD4/CD8比值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kogut等[11]報(bào)道CD4/CD8比值倒置是機(jī)體免疫缺陷的表現(xiàn)；而Hadrup等[12]報(bào)道女性的死亡率增加與CD8+記憶T細(xì)胞的數(shù)量增多有關(guān)，本研究手術(shù)去卵巢組、藥物去卵巢組與對(duì)照組CD4/CD8比值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致[13]。

Han等[14]報(bào)道老年人的B細(xì)胞功能不足還表現(xiàn)在受體多樣性的削弱、對(duì)抗原反應(yīng)的下降、對(duì)抗體親和力的降低，進(jìn)而導(dǎo)致體液免疫下降及外源性自體抗原抗體特異性轉(zhuǎn)變，最終導(dǎo)致自身免疫性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和阿爾茨海默病[15]。本研究3組實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgM、IgG水平均明顯低于對(duì)照組，手術(shù)去卵巢組小鼠血清IgM、IgG和IgA水平均低于藥物去卵巢組和自然絕經(jīng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者認(rèn)為，在手術(shù)去卵巢組中E2的急劇減少將更有可能抑制體液免疫功能，更有效地治療E2相關(guān)的自身免疫性疾病。

IL-2能夠促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞的分化、成熟和增殖，還能促進(jìn)Tc細(xì)胞的活性并轉(zhuǎn)化為腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和NK細(xì)胞的免疫應(yīng)答。IL-4能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞提呈抗原和殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，IL-5能夠促進(jìn)B細(xì)胞分化與生長(zhǎng)、誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞分化、促進(jìn)IgA合成和誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）的生成。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3組實(shí)驗(yàn)組小鼠IL-2、IL-4、IL-5 mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各組小鼠IL-10 mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示老齡化小鼠體內(nèi)IL-2、IL-4、IL-5升高可能由E2缺乏所致，而E2對(duì)IL-10水平作用有限。

綜上所述，Con-A刺激后E2缺乏狀態(tài)下年輕與老齡化小鼠之間細(xì)胞因子模式是有所不同的，3組實(shí)驗(yàn)組IL-2、IL-4、IL-5 mRNA 表達(dá)水平升高，IL-10 mRNA 表達(dá)水平無(wú)明顯變化，提示老齡化小鼠體內(nèi)升高的IL-2、IL-4、IL-5可能由E2缺乏所致，而E2對(duì)IL-10水平作用有限。自然絕經(jīng)組CD4/CD8比值下降，IgM、IgG和IgA抗體水平在手術(shù)去卵巢組最低，藥物去卵巢組中所有的免疫參數(shù)的變化較小。這些結(jié)果表明E2缺乏可能只是老年人容易發(fā)生免疫缺陷的部分原因，至于老年人免疫功能改變的真正原因一直是討論和研究的焦點(diǎn)。

[1]Liu L,Zhao Y,Xie K,et al.Estrogen inhibits LPS-induced IL-6 production in macrophages partially via the nongenomic pathway[J].ImmunolInves,2014,43(7):693-704.doi:10.3109/08820139.2014.917095.

[2]Curran EM,Berghaus LJ,Vernetti NJ,et al.Natural killer cells express estrogen receptor-alpha and estrogen receptor-beta and can respond to estrogen via a non-estrogen receptor-alpha-mediated pathway[J].Cell Immunol,2001,214(1):12-20.doi:10.1006/cimm.2002.1886.

[3]Zhao RQ,Zhou MH,Qu W,et al.Inhibitory effect of alarelin microspheres on experimental endometrosis in rats[J].Acta Pharmaceutica Sinica,1999,34(8):565-568.

[4]Martins RR,Pereira NM,Silva TM.Liquid-base cytology:a new method for oestral cycle study in Wistar's rats[J].Acta Cir Bras,2005,20(1):78-81.doi:/S0102-86502005000700009.

[5]Wang JM,Hou X,Adeosun S,et al.A dominant negative ERβ splice variant determines the effectiveness of early or late estrogen therapy after ovariectomy in rats[J].PLoS One,2012,7(3):e33493.doi:10.1371/journal.pone.0033493.

[6]潘文超,周玉娟,段斐,等.復(fù)方甘草酸苷對(duì)免疫性肝損傷小鼠的保護(hù)作用[J].醫(yī)學(xué)研究與教育,2013,30(1):29-32.

[7]Gameiro CM,Roma o F,Castelo-Branco C.Menopause and aging:changes in the immune system--a review[J].Maturitas,2010,67(4):316-320.doi:10.1016/j.maturitas.2010.08.003.

[8]邵明君,何云芹,胡美旭,等雌二醇和孕酮對(duì)去卵巢小鼠外周血T細(xì)胞反應(yīng)的影響[J].浙江醫(yī)學(xué),2012,12(16):1347-1349.

[9]Hinds L,Price J.Menopause,hormone replacement and gynaecologicalcancers[J].Menopause Int,2010,16(2):89-93.

[10]邵明君,何云芹,胡旻,等.雌激素與去卵巢小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群及免疫球蛋白關(guān)系的研究[J].浙江醫(yī)學(xué),2011,33(12):1793-1795.

[11]Kogut I,Scholz JL,Cancro MP,et al.B cell maintenance and function in aging[J].Seminars Immunology,2012,24(5):342-349.doi:10.1016/j.smim.2012.04.004.

[12]Hadrup SR,StrindhallJ,Kllgaard T,et al.Longitudinalstudies of clonally expanded CD8 T cells reveal a repertoire shrinkage predicting mortality and an increased number of dysfunctional cytomegalovirus-specific T cells in the very elderly[J].J Immunol,2006,176(4):2645-2653.

[13]Shao MJ,Zhu YJ,Qiu YE,et al.Changes in the Level of Immunoglobulins and CD4/CD8 Ratio in Young and Aged Mice with EstradiolDeficiency[J].ImmunologicalInvesttigations,2017,46(3):305-313.doi:10.1080/08820139.2016.1267203.

[14]Han S,Yang K,Ozen Z,et al.Enhanced differentiation of splenic plasma cells but diminished long-lived high-affinity bone marrowplasma cells in aged mice[J].J Immunol,2003,170(3):1267-1273.

[15]Nagele EP,Han M,Acharya NK,et al.NaturalIgG autoantibodies are abundant and ubiquitous in human sera,and their number is influenced by age,gender,and disease[J].PLoS One,2013,8(4):e60726.doi:10.1371/journal.pone.0060726.