王烈 續(xù)力云 劉超武 陸暢暢 樂涵波

肺癌是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)肺癌死亡率居惡性腫瘤之首，5年生存率僅為10%～15%。其中，肺腺癌是絕大多數(shù)國(guó)家最常見的肺癌組織學(xué)亞型。侵犯周圍組織和轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官被認(rèn)為是惡性腫瘤的特征，也是臨床腫瘤治療失敗的主要原因。最近研究表明，不管是侵襲還是轉(zhuǎn)移都依賴于癌細(xì)胞獲得上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）能力[1]，EMT的發(fā)現(xiàn)為研究腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制及治療提供了新的方向和靶點(diǎn)。本研究通過檢測(cè)肺腺癌組織與癌旁組織EMT相關(guān)標(biāo)識(shí)基因并進(jìn)行對(duì)照研究，尋找肺腺癌EMT相關(guān)分子標(biāo)志物，為評(píng)估肺腺癌預(yù)后的新指標(biāo)及抗腫瘤轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2013年1月至2015年12月在本院接受手術(shù)治療的117例肺腺癌患者的資料和手術(shù)切除的肺組織標(biāo)本，男41例，女76例；年齡42～75（52.4±9.8）歲；腫瘤最大徑 1.0～5.9（2.78±1.91）cm。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均經(jīng)術(shù)后病理確診；（2）術(shù)前未經(jīng)放化療治療；（3）無(wú)明顯肝、腎功能損害；（4）術(shù)后臨床病理資料完整，包括性別、年齡、吸煙史、腫塊大小、病理類型、轉(zhuǎn)移情況、分期；（5）排除惡性腫瘤史及其他部位原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移病灶。病理分型參照2011年國(guó)際肺癌研究學(xué)會(huì)（IASLC）、美國(guó)胸科學(xué)會(huì)（ATS）和歐洲呼吸學(xué)會(huì)（ERS）公布的肺腺癌新分類標(biāo)準(zhǔn)，將肺腺癌分為：（1）原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）：局限性，腫瘤細(xì)胞沿肺泡壁呈鱗屑樣生長(zhǎng)，無(wú)間質(zhì)、血管或胸膜浸潤(rùn)的小腺癌（≤3cm）；（2）微浸潤(rùn)腺癌（minimally invasive adenocarcinoma，MIA）：孤立性、以鱗屑樣生長(zhǎng)方式為主且浸潤(rùn)灶≤0.5cm 的小腺癌（≤3cm）；（3）浸潤(rùn)性腺癌（invasive adenocarcinoma，IA）：含有浸潤(rùn)灶＞0.5cm，可被分為以鱗屑樣、腺泡樣、乳頭狀、實(shí)性生長(zhǎng)方式為主的亞型，推薦新增“微乳頭狀生長(zhǎng)方式”亞型。AIS和MIA通常劃分為非浸潤(rùn)性腺癌。

1.2 方法

1.2.1 肺腺癌組織及癌旁組織RNA的抽提及逆轉(zhuǎn)錄取 100mg新鮮肺腺癌組織及癌旁組織加入1ml Trizol（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），勻漿器進(jìn)行勻漿；采用試劑盒 RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation（Cat#AM1975,Ambion,美國(guó)）提取石蠟組織總RNA。加入300μl氯仿，震蕩混勻，室溫靜置10min；13 000r離心15min，吸取上清液加入等體積異丙醇，混勻；13000r離心10min，棄上清液，加入700μl 75%焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制乙醇；12 000r離心10min，棄上清液，干燥，加入20μl DEPC水溶解RNA。以上述RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，冰上操作，按下述順序依次加樣：2.5μl RNA、1.5μl反轉(zhuǎn)錄引物、1μl RNA 酶抑制劑、2μl 10×Buffer、2μl 10nmol/L dNTP、1μl聚合酶，總體積為10μl，在旋渦混旋器上混勻 30s，12 000r離心 30s，放入ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems，美國(guó)）中，程序如下：16℃ 30min，42℃ 30min，85℃ 5min，4℃冷卻。此反應(yīng)產(chǎn)物置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 所有引物設(shè)計(jì)均來(lái)自NCBI、Primer designing tool，且所有引物設(shè)計(jì)均滿足以下條件：（1）引物長(zhǎng)度為 17～25bp；（2）GC 含量 45%～55%；（3）熔鏈溫度 60℃左右；（4）A、C、G、T 堿基分布均勻。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。本實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參基因。GAPDH引物序列：上游引物 5′-ACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′，下游引物 5′-CGACCAAATCCGTTGACTCC-3′；鈣黏附蛋白 E（E-cadherin）引物序列：上游引物5′-ATTCTGATTCTGCTGCTCTTG-3′，下游引物5′-AGTAGTCATAGTCCTGGTCTT-3′；波形蛋白（Vimentin）引物序列：上游引物5′-CGGGAGAAATTGCAGGAGGA-3′，下游引物5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′；Snail引物序列：上游引物5′-CAACCCACTCAGATGTCAA-3′，下游引物 5′-CATAGTTAGTCACACCTCGT-3′；Slug引物序列：上游引物5′-GGTCAAGAAGCATTTCAAC-3′，下游引物5′-GGTAATGTGTGGGTCCGA-3′。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，擴(kuò)增內(nèi)參 GAPDH、E-cadherin、Vimentin、Snail及 Slug，反應(yīng)體系如下：5μl Taqman Universal Master MixⅡ（大連寶生物工程有限公司）、0.5μl引物、0.67μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、3.83μl DEPC水，總體積為10μl。在旋渦混旋器上振蕩混勻5s，12 000r離心10s，放入ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，以下述條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 60s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本取3個(gè)重復(fù)孔Ct值的平均數(shù)，獲得各樣本組織ΔCt值（各目的基因Ct值-內(nèi)參 Ct值），最終獲得各樣本 2-ΔΔCt值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織與癌旁組織 E-cadherin、Vimentin、Snail和Slug mRNA表達(dá)水平比較 與癌旁組織相比，肺腺癌組織上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin mRNA表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034）；而肺腺癌組織間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin mRNA表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016）；此外，肺腺癌組織中誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug mRNA表達(dá)水平亦上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 1。

圖1 E-cadherin、Vimentin、Snail和Slug mRNA在肺腺癌組織及癌旁組織表達(dá)情況（N：癌旁組織；C：癌組織）

2.2 EMT相關(guān)標(biāo)識(shí)基因的表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者癌組織E-cadherin mRNA表達(dá)水平下調(diào)者所占比例高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（16/20 vs 44/97），而 Vimentin、Snail mRNA 表達(dá)水平上調(diào)者所占比例高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（15/20 vs 40/97，14/20 vs 37/97），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。IA 組 Vimentin mRNA表達(dá)水平上調(diào)者所占比例高于AIS+MIA組（52/86 vs 12/31），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。含微乳頭結(jié)構(gòu)（MPP）成分組癌組織E-cadherin mRNA表達(dá)水平下調(diào)者所占比例高于不含MPP成分組（27/37 vs 37/80），而 Vimentin、Snail、Slug mRNA 表達(dá)水平上調(diào)者所占比例高于不含MPP成分組（26/37 vs 39/80，25/37 vs 37/80，28/37 vs 35/80），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與Ⅰ/Ⅱ期肺腺癌組相比，Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌組癌組織E-cadherin mRNA表達(dá)水平下調(diào)者所占比例較高（23/39 vs 30/78），而 Vimentin、Snail、Slug mRNA 表達(dá)水平上調(diào)者所占比例較高（26/39 vs 34/78，24/39 vs 33/78，27/39 vs 38/78），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

3 討論

全球范圍內(nèi)肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首[2]。近年來(lái)，肺腺癌已超過肺鱗狀細(xì)胞癌，躍居肺癌病理類型首位[3]。目前，針對(duì)肺腺癌的研究是肺癌研究領(lǐng)域的重要課題。2011年IASLC、ATS和ERS提出了AIS、MIA和IA的肺腺癌國(guó)際多學(xué)科新分類標(biāo)準(zhǔn)，為肺腺癌的診斷和治療提供了重要的指導(dǎo)[4-5]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是惡性腫瘤的特征，也是臨床腫瘤治療失敗的主要原因[6]。因此，尋找有效的預(yù)測(cè)標(biāo)志物尤為重要。EMT是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程[7]。眾多研究表明，通過EMT，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲等間質(zhì)表型[8-11]。EMT是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程[12]。因此本研究分析117例肺腺癌患者的癌組織EMT相關(guān)標(biāo)識(shí)基因的表達(dá)水平及與臨床病理特征的關(guān)系，旨在篩選出具有預(yù)測(cè)肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物及評(píng)估肺腺癌預(yù)后的新指標(biāo)。

在EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)水平下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達(dá)水平上調(diào)，以及誘導(dǎo)EMT的轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug等表達(dá)水平亦上調(diào)。本研究顯示，與癌旁組織相比，肺腺癌組織E-cadherin mRNA表達(dá)水平下調(diào)，Vimentin、Snail和Slug mRNA表達(dá)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究結(jié)果提示肺腺癌細(xì)胞具有間質(zhì)表型。EMT作為腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析了EMT相關(guān)標(biāo)識(shí)基因的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者，其癌組織E-cadherin mRNA表達(dá)水平下調(diào)者所占比例較高，而Vimentin、Snail mRNA表達(dá)水平上調(diào)者所占比例較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2011年肺腺癌新分類標(biāo)準(zhǔn)中指出，相對(duì)于IA，通常將AIS和MIA劃分為非浸潤(rùn)性腺癌。本研究結(jié)果表明，IA組Vimentin mRNA表達(dá)水平上調(diào)者所占比例較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示惡性程度更高的肺腺癌病理亞型，其間質(zhì)表型更明顯。在肺腺癌新分類中微乳頭狀肺腺癌（mi－cropapillary predominant lung adenocarcinoma,MPPAC）以其特殊的病理學(xué)特征被單列出定義為一種新的IA組織學(xué)亞型，并建議只要該成分所占比例達(dá)到5%就應(yīng)該在診斷中進(jìn)行描述。MPPAC因其高度的淋巴管侵犯、高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等預(yù)后不良的生物學(xué)行為，近年來(lái)越來(lái)越受到臨床醫(yī)師、病理醫(yī)師及國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視[13-15]，而關(guān)于MPPAC高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制及相關(guān)因素的研究尚少。本研究以肺腺癌組織是否含MPP成分分為兩組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含MPP成分組癌組織E-cadherin mRNA表達(dá)水平下調(diào)者所占比例高于不含MPP成分組，而Vimentin、Snail、Slug mRNA表達(dá)水平上調(diào)者所占比例高于不含MPP成分組，提示EMT可能是MPPAC高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。此外，本研究結(jié)果亦顯示，Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌組織的E-cadherin mRNA表達(dá)水平下調(diào)者所占比例較高，而Vimentin、Snail、Slug mRNA表達(dá)水平上調(diào)者所占比例較高，提示晚期肺腺癌具有間質(zhì)表型，可能是其具有較高惡性程度的重要原因。

綜上所述，肺腺癌組織上皮表型相關(guān)標(biāo)識(shí)基因表達(dá)水平下調(diào)，間質(zhì)表型相關(guān)標(biāo)識(shí)基因表達(dá)水平下調(diào)，尤其是在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者、IA患者、含MPP成分者、晚期肺腺癌患者。本研究提示，肺腺癌組織EMT相關(guān)標(biāo)識(shí)基因表達(dá)水平改變，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、腫瘤分期相關(guān)，提示其可能是評(píng)估肺腺癌預(yù)后的新指標(biāo)及腫瘤治療的新靶點(diǎn)。由于本研究病例數(shù)較少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

表1 EMT相關(guān)標(biāo)識(shí)基因的表達(dá)水平與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系（例）

[1]Mittal V.Epithelial mesenchymal transition in tumor metastasis[J].Annu Rev Patho,2018,13:395-412.doi:10.1146/annurev-pathol-020117-043854.

[2]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.doi:10.3322/caac.21166.

[3]Tomizawa K,Shimizu S,Ohara S,et al.Clinical significance of tumor cavitation in surgically resected early-stage primary lung cancer[J].Lung Cancer,2017,112:57-61.doi:10.1016/j.lungcan.2017.08.004.

[4]Travis WD,Brambilla E,NoguchiM,et al.Internationalassociation for the study of lung cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society International Multidisciplinary Classification of Lung Adenocarcinoma[J].J Thorac Oncol,2011,6(2):244-285.doi:10.1097/JTO.0b013e318206a221.

[5]Travis WD,Brambilla E,Riely GJ.New pathologic classification of lung cancer:relevance for clinical practice and clinical trials[J].J Clin Oncol,2013,31(8):992-1001.doi:10.1200/JCO.2012.46.9270.

[6]Brambilla E,Gazdar A.Pathogenesis of lung cancer signalling pathways:roadmap for therapies[J].The European Respiratory Journal,2009,33(6):1485-1497.doi:10.1183/09031936.00014009.

[7]Piva F,GiuliettiM,SantoniM,et al.Epithelialto mesenchymaltransition in renal cell carcinoma:Implications for cancertherapy[J].Mol Diagn Ther,2016,20(2):111-117.doi:10.1007/s40291-016-0192-5.

[8]CaiHK,Chen X,Tang YH,et al.MicroRNA-194 modulates epithelial-mesenchymal transition in human colorectal cancer metastasis[J].Oncologyand Therapy,2017,10:1269-1278.doi:10.2147/OTT.S125172.

[9]Liu J,Li W,Liu S,et al.Knock down of collagen triple helix repeat containing 1(CTHRC1)iInhibits epithelial-mesenchymal tra-nsition and cellular migration in glioblastoma cells[J].Oncol Res,2017,25(2):225-232.doi:10.3727/096504016X14732772150587.

[10]Du L,Ning Z,Zhang H,et al.Corepressor metastasis-associated protein 3 modulates epithelial-to-mesenchymaltransition and metastasis[J].Chinese Journal of Cancer,2017,36(1):28.doi:10.1186/s40880-017-0193-8.

[11]Zhou S,Sun X,Yu L,et al.Differential expression and clinical significance of epithelial-mesenchymal transition markers among different histological types of triple-negative breast cancer[J].J Cancer,2018,9(3):604-613.doi:10.7150/jca.19190.eCollection 2018.

[12]Liu J,Lu C,Xiao M,et al.Long non-coding RNA SNHG20 predicts a poor prognosis for HCC and promotes cell invasion by regulating the epithelial-to-mesenchymal transition[J].Biomed Pharmacother,2017,89:857-863.doi:10.1016/j.biopha.2017.01.011.

[13]CaiYR,Dong YJ,Wu HB,et al.Micropapillary:Acomponent more likely to harbour heterogeneous EGFR mutations in lung adenocarcinomas[J].SciRep,2016,6:23755.doi:10.1038/srep23755.

[14]Zhang Y,Wang R,Cai D,et al.A comprehensive investigation of molecular features and prognosis of lung adenocarcinoma with micropapillary component[J].J Thorac Oncol,2014,9(12):1772-1778.doi:10.1097/JTO.0000000000000341.

[15]Dai C,Xie H,Kadeer X,et al.Relationship of lymph node micrometastasis and micropapillary component and their joint influence on prognosis of patients with stage i lung adenocarcinoma[J].Am J Surg Pathol,2017,41(9):1212-1220.doi:10.1097/PAS.0000000000000901.