李旭升 洪麗霞 金慶躍

復發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠28周以內(nèi)2次以上連續(xù)發(fā)生的自然流產(chǎn)[1]，是妊娠期婦女的常見并發(fā)癥之一[2]，發(fā)病率約占育齡夫婦的5%[3]。引起RSA的因素復雜多樣，約50%的RSA的發(fā)病機制尚不明確[4]。有許多未知的體內(nèi)外刺激能夠引起子宮平滑肌細胞異常收縮，從而造成流產(chǎn)[5]。前列腺素（prostaglandin，PG）是一類普遍存在于人和動物體內(nèi)的具有多種生理作用的活性脂質[6]，它通過環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和不同的膜相關前列腺素E合成酶（membrane-associated prostaglandin E synthase，mPGES）催化產(chǎn)生[7]。子宮的PG主要來源于子宮內(nèi)膜，前列腺素E受體（EP）主要在肌細胞膜上表達[8]。PG能引起子宮強烈的收縮，非妊娠子宮的EP含量高于妊娠子宮[9]。筆者推測前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及其受體EP表達水平的異常可能與RSA有關。然而RSA患者的PGE2的合成水平和子宮平滑肌細胞EP受體的分布情況鮮有報道，其機制尚有待于進一步研究。本研究測定了RSA患者子宮蛻膜組織中COX-2、mPGES和PGE2的表達和子宮平滑肌細胞中EP受體的分布及其下游的信號分子鈣離子和環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的水平，以探討 PGE2/EP系統(tǒng)在RSA中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2015年6月至2016年10月金華市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科門診收治的37例RSA患者作為RSA組。RSA患者入組標準：（1）B超提示胚胎已死亡，自然流產(chǎn)次數(shù)＞2 次；（2）孕 12周以內(nèi)；（3）染色體核型、婦科檢查、抗人球蛋白實驗（Coombs試驗）、優(yōu)生4項（TORCH檢測）、抗心磷脂抗體檢測等均無異常；（4）無其他急慢性疾??；（5）丈夫精液檢查正常。選擇同期正常早期妊娠的采用吸宮術人工流產(chǎn)的48例孕婦作為對照組。RSA 組年齡 22～30（26.8±3.1）歲，孕周 8～13（8.9±2.2）周，未接受任何藥物保胎治療；對照組年齡21～30（25.9±2.7）歲，孕周 8～11（9.2±1.9）周；兩組對象年齡和孕周比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

1.2 實驗材料與儀器 PGE2ELISA試劑盒、cAMP ELISA試劑盒購自美國Abcam公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒和SYBY Green Mix購自北京全式金生物技術公司；熒光定量PCR擴增儀購自美國Bio-Rad公司；鈣離子檢測染料Fluo-3 AM購自日本東仁化學公司；PCR引物由上海博尚生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 子宮平滑肌細胞分離與鑒定 子宮肌膜組織通過宮腔鏡活檢獲得，并立即進行后續(xù)子宮平滑肌細胞分離。取子宮肌膜組織約0.5g，置于冰冷的Hank′s平衡緩沖液（HBSS）中，洗凈組織表面血污。于10ml培養(yǎng)皿內(nèi)，用眼科剪將組織剪碎成漿樣，加入HBSS緩沖液5ml，吹打制成組織懸液，8 000r/min離心2min，棄上清液。留下的組織內(nèi)加入20%FBS 2ml，吹打，再次離心夾取組織塊，點種于6孔板或12孔板，向培養(yǎng)孔內(nèi)緩慢加入20%FBS約2ml，使液面剛好沒過組織塊。將培養(yǎng)板轉入孵箱。前4d可不必觀察。每4～6d換液1次，若有組織塊漂起，可吸除。觀察至組織塊之間的細胞互相融合，即可直接用于實驗處理，或傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。利用α-actin熒光抗體進行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下可看到細胞被染成綠色熒光。

1.3.2 蛻膜組織中COX-2、mPGES和子宮平滑肌細胞中EP受體表達水平檢測 采用RT-PCR。蛻膜組織通過負壓吸引術獲得，于液氮中保存使用。將蛻膜組織從液氮中取出，置于1ml Trizol試劑中。對于分離的培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)板的子宮平滑肌細胞，每孔中加入Trizol試劑中，刮下細胞轉移至離心管中。振蕩混勻后冰上放置5min，12 000g離心15min，吸取澄清部分加入等體積異丙醇中，混勻后冰上靜置10min，12 000g離心15min，棄上清液，向離心管中加入1ml預冷的75%乙醇溶液，輕輕振蕩后7 500g離心5min，棄上清液，沉淀用無RNA酶的雙蒸水溶解。按說明書所述方法提取mRNA。采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，作為RTPCR的模板。各目標分子的引物序列見表1。引物合成后稀釋為2μM。反應體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 5μl，上游引物和下游引物各 1μl，cDNA 模板 1∶10 稀釋后取1μl，剩余用不含RNA酶的水補足，總體積10μl。PCR反應條件如下：預變性95℃ 30s；變性95℃ 3s；退火延伸60℃30 s；構建溶解曲線。表達量的計算采用2-ΔΔCt。

1.3.3 蛻膜組織中PGE2表達水平檢測 向解凍的蛻膜組織加入蛋白酶抑制劑后，超聲破碎，23 000g離心15min，取上清液。根據(jù)ELISA檢測試劑盒的說明書按照不同的稀釋倍數(shù)制備標準品，并將樣本按1∶10稀釋到ED1樣品緩沖液內(nèi)。按照說明書操作步驟在酶標儀上測量450nm處的光密度（OD）值，根據(jù)標準曲線計算出實際的PGE2的含量。

表1 PCR引物序列

1.3.4 子宮平滑肌細胞中cAMP表達水平檢測 子宮平滑肌細胞中cAMP表達水平按照ELISA試劑盒要求處理細胞并進行測定。

1.3.5 胞內(nèi)鈣離子信號檢測 將1～5mM的鈣離子熒光探針Fluo-3 AM母液用HBSS緩沖液配制成1～5μM的工作液，取出分離的子宮平滑肌細胞，除去培養(yǎng)基，用HBSS緩沖液洗滌細胞3次；加入Fluo-3 AM工作液，溶液量以覆蓋細胞為準，37℃細胞培養(yǎng)箱孵育10～60min；去除殘留的Fluo-3 AM工作液，然后加入HBSS緩沖液覆蓋細胞，37℃培養(yǎng)箱孵育約20～30min，以確保鈣離子熒光探針Fluo-3 AM在細胞內(nèi)被酯酶剪切從而與鈣離子結合。采用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測細胞，激發(fā)波長480～500nm，發(fā)射波長525～530nm。利用IPWIN32軟件分析兩組數(shù)據(jù)熒光強度差異。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組蛻膜組織中COX-2、mPGES和PGE2表達水平比較 RSA組蛻膜組織中COX-2和mPGES表達水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1。RSA組蛻膜組織中PGE2表達水平為（72.26±27.42）pg/ml，顯著高于對照組的（61.61±18.2）pg/ml，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 兩組蛻膜組織中COX-2和mPGES表達水平比較（與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 兩組子宮平滑肌細胞中EP受體表達水平比較RSA組子宮平滑肌細胞中EP1和EP3表達水平均高于對照組（均P＜0.01），而EP2表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而兩組子宮平滑肌細胞中EP4表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 兩組子宮平滑肌細胞中鈣離子濃度和cAMP表達水平比較 RSA組子宮平滑肌細胞胞內(nèi)鈣離子濃度顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖3（插頁）。RSA組子宮平滑肌細胞中cAMP表達水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖4。

圖2 兩組子宮平滑細胞中EP受體表達水平比較（與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 兩組子宮平滑肌細胞中cAMP表達水平比較（與對照組比較，*P＜0.01）

3 討論

RSA是困擾育齡婦女的頑疾之一，近年隨著環(huán)境變化等因素的影響RSA發(fā)病率有明顯上升的趨勢，且RSA復發(fā)的風險隨著自然流產(chǎn)次數(shù)的增加而增加，有3次流產(chǎn)經(jīng)歷的RSA患者如果得不到及時有效的治療，多數(shù)將再次自然流產(chǎn)，給孕婦心理和身體造成了極大的損傷[10]，目前已經(jīng)成為臨床研究的焦點。染色體異常是公認的最常見因素[11]；其次還有解剖因素，包括子宮畸形、宮頸功能不全等；另外，內(nèi)分泌因素、環(huán)境因素等也是RSA的常見因素之一；除此之外，子宮平滑肌的不正常收縮也可能與RSA的發(fā)生有關[12]。在妊娠的早期階段，適當?shù)淖訉m平滑肌收縮有利于受精和著床。著床后至分娩前，子宮處于不規(guī)則、無痛性、稀發(fā)和不對稱收縮的相對靜止狀態(tài)。然而，如果受到體內(nèi)外不確定因素的影響，子宮收縮的穩(wěn)態(tài)被打破，就有可能導致流產(chǎn)的發(fā)生。

王育等[13]研究發(fā)現(xiàn)絨毛組織中COX-2及其催化的PG通過影響胚胎的著床，從而參與RSA的發(fā)病機制。Popovic等[14]報道PGE2在RSA患者的蛻膜組織中的含量高于手術流產(chǎn)組，而在硫前列酮誘導的藥物流產(chǎn)人群中，其蛻膜組織中PGE2水平和RSA患者相當。這提示PGE2急劇上升造成子宮收縮，進一步導致了流產(chǎn)的發(fā)生。本研究也得到了與類似結果，RSA組蛻膜組織中PGE2表達水平顯著高于對照組。同時，負責合成PGE2的mPGES表達水平也高于對照組。RSA患者蛻膜組織中mPGES水平上調，導致PGE2的合成水平增加，這揭示了PGE2的上調參與了RSA的疾病進程。

PG主要通過和其位于細胞膜上的受體結合來發(fā)揮其生理作用。PGE2至少能夠和4個亞型的EP受體結合，這些EP亞型受體均是G蛋白偶聯(lián)受體，每一種受體會介導不同的信號通路[15]。第二信使鈣離子、三磷酸肌醇（IP3）和cAMP在子宮收縮中起著關鍵性的作用。Slater等[16]報道維持妊娠期間蛻膜的正常功能，需要較低的PG水平和較高的cAMP水平，流產(chǎn)的發(fā)生往往是出現(xiàn)了是較高的PG水平和較低的cAMP水平。鈣離子能夠促進平滑肌細胞的收縮，而cAMP則能夠促進子宮的靜止。為了解在RSA中哪些EP受體及其偶聯(lián)的G蛋白以及第二信使在發(fā)病過程中起到了重要的作用，筆者利用RT-PCR分析了子宮平滑肌細胞中EP的分布情況，發(fā)現(xiàn)EP1和EP3表達上調，而EP2表達下調。EP2和EP4通過異三聚體的G蛋白Gαs刺激腺苷酸環(huán)化酶的活性，促進cAMP的合成；而EP3則通過Gαi抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，降低cAMP的合成；EP1通過Gq蛋白促進磷脂酶C（PLC）的活性，使胞內(nèi)鈣離子水平升高。綜合上述結果發(fā)現(xiàn)，EP1的上調促進了胞內(nèi)鈣離子的升高，而EP3上調和EP2下調則造成了cAMP水平的下降，其產(chǎn)生的共同結果就是子宮平滑肌細胞異?；钴S的收縮。

綜上所述，RSA患者子宮蛻膜組織的COX-2和mPGES表達上升，增加了子宮蛻膜PGE2的合成。PGE2作用于子宮肌層的EP受體，激活了下游信號通路，而子宮平滑肌細胞的EP1和EP3上調進一步促進胞內(nèi)鈣離子濃度和cAMP水平的變化，從而造成了子宮異常的收縮，可見PGE2/EP系統(tǒng)異?？赡軈⑴c了RSA的發(fā)病。本研究為抗RSA藥物的開發(fā)提供了新的思路。

[1]Romero R,Dey SK,Fisher SJ.Preterm labor:one syndrome,many causes[J].Science,2014,345(6198):760-765.doi:10.1126/science.1251816.

[2]ElHachem H,Crepaux V,May-Panloup P,et al.Recurrent pregnancy loss:current perspectives[J].Int J Womens Health,2017,9:331-345.doi:10.2147/IJWH.S100817.eCollection 2017.

[3]Tur-Torres MH,Garrido-Gimenez C,Alijotas-Reig J.Genetics of recurrent miscarriage and fetal loss[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol,2017,42(1):11-25.doi:10.1016/j.bpobgyn.2017.03.007.

[4]Sotiriadis A,Makrigiannakis A,Stefos T,et al.Fibrinolytic defects and recurrent miscarriage:a systematic review and meta-analysis[J].Obstet Gynecol,2007,109(5):1146-1155.doi:10.1097/01.AOG.0000260873.94196.d6.

[5]Namavar Jahromi B,Salarian L,Shiravani Z.Maternal risk factors and neonataloutcome of the admitted patients for preterm spontaneous uterine contraction[J].Iranian Red Crescent med J,2011,13(12):877-883.

[6]金戈,明海,董曉麗,等.前列腺素及異前列腺素的臨床應用研究進展[J].甘肅中醫(yī)學院學報,2011,28(5):65-68.

[7]Cornejo-Garcia JA,Perkins JR,Jurado-Escobar R,et al.Pharmacogenomics of prostaglandin and leukotriene receptors[J].Front Pharmacol,2016,7:316.doi:10.3389/fphar.2016.00316.

[8]Carrarelli P,Funghi L,Bruni S,et al.Naproxen sodium decreases prostaglandins secretion from cultured human endometrial stromal cells modulating metabolizing enzymes mRNA expression[J].Gynecological endocrinology,2016,32(4):319-322.doi:10.3109/09513590.2015.1115973.

[9]Konopka CK,Glanzner WG,Rigo ML,et al.Responsivity to PGE2 labor induction involves concomitant differential prostaglandin E receptor gene expression in cervix and myometrium[J].Genet Mol Res,2015,14(3):10877-10887.doi:10.4238/2015.September.9.25.

[10]Rebordo MR,Galvo A,Pinto-Bravo P,et al.Endometrial prostaglandin synthases,ovarian steroids,and oxytocin receptors in mares with oxytocin-induced luteal maintenance[J].Theriogenology,2017,87:193-204.doi:10.1016/j.theriogenology.2016.08.028.

[11]鄧月月,劉文華,戴鶯鶯.420例流產(chǎn)物染色體核型分析[J].浙江醫(yī)學,2017,39(5):365-366.doi:10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.5.2016-2119.

[12]BarilL,Rosillon D,Willame C,et al.Risk of spontaneous abortion and other pregnancy outcomes in 15-25 year old women exposed to human papillomavirus-16/18 AS04-adjuvanted vaccine in the United Kingdom[J].Vaccine,2015,33(48):6884-6891.doi:10.1016/j.vaccine.2015.07.024.

[13]王育,林其德,陳曉翔,等.環(huán)加氧酶-2及其催化的前列腺素分子在復發(fā)性流產(chǎn)中的研究[J].上海醫(yī)學,2010,33(7):674-677.

[14]Popovic JK,Grujic Z,Grujic I,et al.Prostaglandin E2,trace elements and levels of oxidative processes in spontaneous miscarriages[J].Eur Rev Med PharmacolSci,2016,20(22):4786-4790.

[15]Mosher AA,Rainey KJ,Giembycz MA,et al.Prostaglandin E2 represses interleukin 1 beta-induced inflammatory mediator outputfrom pregnant human myometrialcells through the EP2 and EP4 receptors[J].BiolReprod,2012,87(1):1-10.doi:10.1095/biolreprod.112.100099.

[16]Slater DM,Astle S,Woodcock N,et al.Anti-inflammatory and relaxatory effects of prostaglandin E2 in myometrial smooth muscle[J].MolHum Reprod,2006,12(2):89-97.doi:10.1093/molehr/gal005.