呂 哲,張 穎,時(shí)美娟,孟 晴,宋永周,路 虹△

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院:1.耳鼻咽喉科;2.骨科，石家莊 050000)

研究表明腦缺血再灌注時(shí)缺血缺氧、自由基蓄積及三磷酸腺苷耗竭等都可能導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[1-2]。過度ERS可以引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重腦損傷。據(jù)報(bào)道聽力缺失與腦卒中密切相關(guān)[3]。眾所周知，聽皮層是聽覺系統(tǒng)的最高級中樞。初級神經(jīng)元的退行性變及凋亡將導(dǎo)致中樞對傳入信息的感知能力下降，對聲音信息的認(rèn)知和處理的能力下降。以往對缺血再灌注損傷導(dǎo)致的聽力損傷研究多集中于外周聽覺系統(tǒng)，而對中樞病變研究較少[4-6]。本研究通過建立局灶性腦缺血再灌注模型，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-12(Caspase-12)在聽皮層的表達(dá)，闡述腦缺血再灌注對聽力損害的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性清潔級SD大鼠30只，體質(zhì)量250～280 g，無耳毒性藥物使用史，無噪聲暴露史，耳廓反射靈敏，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物許可證號：SCXK(冀)2013-1-003。飼養(yǎng)條件：以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，恒溫20～25 ℃，晝夜交替。采用隨機(jī)數(shù)字表法把實(shí)驗(yàn)動物分為兩組：缺血再灌注組(I/R組)15只，假手術(shù)組(Sham組)15只。

1.2儀器與試劑 ICS-CHARTR-EP型ABR電位儀(麥德森醫(yī)療器)，Tunel試劑盒(Roche公司)，三苯氯化四氮唑(TTC， Sigma公司)，兔抗鼠Caspase-12抗體、GRP78抗體(Santa Cruz公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒(渤海生物工程有限公司)，羊抗兔IgG熒光抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1MACO模型建立 大鼠以10%水合氯醛全身麻醉后，依次分離頸總動脈和頸內(nèi)、頸外動脈，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端，頸外動脈上剪一小口，把標(biāo)記好的栓線從切口處插入頸內(nèi)動脈，隨后向上深入，大約距頸總動脈分叉處(18.5±0.5)mm，此時(shí)堵住大腦中動脈開口，隨即結(jié)扎固定，計(jì)時(shí)60 min，然后輕輕取出線栓。Sham組只進(jìn)行血管分離并不插入線栓。24 h后進(jìn)行檢測和處死、取材。

1.3.2神經(jīng)功能缺失評分 采用改良Longa法，即單盲 6級5分法進(jìn)行評分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀表現(xiàn)；1分：提尾時(shí)不能伸展對側(cè)的前肢；2分：提尾時(shí)對側(cè)的前肢屈曲；3分：行走時(shí)輕度向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分：行走時(shí)向?qū)?cè)嚴(yán)重轉(zhuǎn)圈；5分：向?qū)?cè)跌倒，不能自主行走。

1.3.3聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response,ABR)測試 分別對造模前和造模24 h后的兩組動物進(jìn)行檢測。檢測方法為：水合氯醛麻醉后置于隔聲屏蔽室內(nèi)，選用聽性腦干誘發(fā)電位檢測儀，采用短聲為刺激聲，增益為50 k，速率為每秒21.1次，極性為交替波，觀察時(shí)程10 ms[7]。將初始刺激強(qiáng)度定為90 dB SPL，隨后以5 dB SPL逐漸遞減。直到遞減至出現(xiàn)2次ABR Ⅲ波的波形不一致,此時(shí)增加5 dB SPL進(jìn)行檢測，當(dāng)重復(fù)波形出現(xiàn)一致時(shí),即可記為ABR的反應(yīng)閾值。

1.3.4腦梗死體積測定 麻醉后每組取5只大鼠斷頭取腦，將其均勻切成5片冠狀切片，隨即浸入2%TTC溶液中染色30 min，在多聚甲醛溶液中固定24 h，取出拍照，計(jì)算梗死體積。腦梗死體積百分比=[總梗死體積-(梗死側(cè)半球體積-梗死對側(cè)半球體積)]/梗死對側(cè)半球體積×100%。

1.3.5HE染色觀察聽皮層組織學(xué)改變 大鼠全身麻醉后暴露心臟，自心尖處將灌注針插入，以4%多聚甲醛灌注，固定后取腦。準(zhǔn)確取材聽皮層區(qū)域(參照《大鼠腦立體定位圖譜》)，組織置于固定液中24 h以上，之后石蠟包埋、切片。切片常規(guī)經(jīng)脫蠟、初染、復(fù)染、脫水、封片等工序處理后進(jìn)行觀察。

1.3.6原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測凋亡神經(jīng)細(xì)胞 常規(guī)處理制備好的石蠟切片后，按試劑盒說明書進(jìn)行操作后，置于光鏡下觀察，若細(xì)胞核內(nèi)為棕黃色即為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選擇并計(jì)算5個(gè)高倍視野中的凋亡指數(shù)(AI)。AI=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.7免疫組織化學(xué)觀察聽皮層GRP78、Caspase-12表達(dá) 將經(jīng)抗原修復(fù)，滅活酶后的石蠟切片，滴加一抗、二抗，DAB顯色及復(fù)染，封固后于顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野進(jìn)行圖像分析(采用Image-Pro Plus6.0軟件)。

1.3.8蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測GRP78、Caspase-12蛋白表達(dá) 麻醉后取出大鼠梗死側(cè)聽皮層腦組織，迅速制備腦組織勻漿，在離心機(jī)中離心30 min后取上清液，進(jìn)行蛋白定量。按說明書操作變性、上樣之后，電泳、轉(zhuǎn)膜，將其置入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗Caspase-12多克隆抗體，兔抗GRP78多克隆抗體，孵育過夜后洗膜，再加入羊抗兔IgG熒光抗體，孵育1 h，應(yīng)用遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)，以β-actin的表達(dá)為內(nèi)參照，測定目標(biāo)帶單位密度， GRP78/β-actin、Caspase-12/β-actin比值代表蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1神經(jīng)功能缺失評分、腦梗死體積比較 I/R組表現(xiàn)出不同程度的腦缺血性損傷，Sham組無行為學(xué)改變，經(jīng)TTC染色后Sham組腦組織顯示出均勻的紅色。與Sham組比較，I/R組腦組織顯示為大范圍蒼白色梗死區(qū)域，兩組腦梗死體積、神經(jīng)功能缺失評分、AI比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2ABR反應(yīng)閾 造模前兩組ABR反應(yīng)閾比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，造模后兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。I/R組造模前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Sham組造模前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積、AI比較

表2 ABR檢測結(jié)果

2.3聽皮層HE染色檢測組織學(xué)改變 經(jīng)HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，Sham組神經(jīng)元邊界清楚，結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)正常，高倍鏡下核仁清晰，細(xì)胞核圓而大， I/R組正常組織結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞周圍空泡變，細(xì)胞質(zhì)嗜伊紅，細(xì)胞核固縮、深染(圖1)。

2.4TUNEL法檢測凋亡神經(jīng)細(xì)胞 缺血再灌注后24 h后，I/R組陽性細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞形態(tài)上有改變，兩組AI比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示缺血再灌注可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(表1、圖2)。

A：Sham組；B：I/R組

圖1聽皮層神經(jīng)細(xì)胞HE染色(×200)

A：Sham組；B：I/R組；C：兩組AI比較,*：P<0.01，與Sham組比較

圖2聽皮層神經(jīng)細(xì)胞TUNEL染色(×200)

A、D：Sham組；B、E：I/R組；C、F：兩組GRP78、Caspase-12蛋白表達(dá)比較;*：P<0.01，與Sham組比較

圖3聽皮層神經(jīng)細(xì)胞GRP78 、Caspase-12免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)

2.5免疫組織化學(xué)觀察聽皮層GRP78、Caspase-12表達(dá) GRP78抗原陽性細(xì)胞為深棕色，細(xì)胞質(zhì)淡染；染色陰性細(xì)胞胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)未見染色。Sham組中，GRP78陽性細(xì)胞呈現(xiàn)少量表達(dá)，缺血再灌注后24 h，I/R組陽性細(xì)胞明顯增多，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Caspase-12抗原陽性細(xì)胞呈棕黃色，以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主，在Sham組中微量表達(dá)，再灌注24 h后，I/R組陽性細(xì)胞較Sham組明顯增多，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

A、B：GRP78；C、D：Caspase-12;*：P<0.01,與Sham組比較

圖4 Western blot檢測GRP78和Caspase-12蛋白表達(dá)

2.6Western blot檢測GRP78、Caspase-12蛋白表達(dá) Sham組大鼠腦組織僅有少量GRP78、Caspase-12蛋白表達(dá)，I/R組24 h表達(dá)GRP78、Caspase-12蛋白較Sham組明顯增加，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

3 討 論

聽皮層是大腦皮質(zhì)的一個(gè)亞皮質(zhì)區(qū)域，也是聽覺系統(tǒng)的最高級中樞，是眾多下調(diào)通路的源頭，能在聽覺系統(tǒng)的各個(gè)層面上影響神經(jīng)信息處理。聽覺皮質(zhì)接受來自大腦中動脈的血供，皮層的功能也與缺血性損傷密切相關(guān)。聽覺皮質(zhì)神經(jīng)元在缺血缺氧情況下容易發(fā)生細(xì)胞凋亡。課題組在前期的工作中采用夾閉雙側(cè)頸總動脈方法造成全腦缺血再灌注模型，觀察了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及相關(guān)因子在聽皮層的變化[7-8]。在本研究中，通過建立局灶性缺血再灌注模型，并通過神經(jīng)功能評分、TTC染色證實(shí)模型制作成功。從形態(tài)學(xué)上可以觀察到I/R損傷區(qū)細(xì)胞有明顯的變化。對兩組大鼠進(jìn)行ABR測試發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，I/R組顯示出ABR反應(yīng)閾明顯升高。因此筆者推斷聽皮質(zhì)損傷可能是聽力損傷早期階段最重要的改變。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成以及修飾的主要場所，同時(shí)也是細(xì)胞內(nèi)鈣離子的儲存庫[9-11]。神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)高度發(fā)達(dá)，對內(nèi)外部環(huán)境的刺激如缺血缺氧、氧化應(yīng)激及營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等非常敏感。當(dāng)遇到各種有害刺激時(shí)，可以引起ERS，此時(shí)大量蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)未正確折疊或錯(cuò)誤折疊并大量堆積，從而導(dǎo)致鈣離子紊亂。當(dāng)這些蛋白質(zhì)少量出現(xiàn)時(shí)，可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解途徑進(jìn)行清除。但大量出現(xiàn)并且超出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自身清除能力時(shí)，細(xì)胞內(nèi)一系列級聯(lián)反應(yīng)通路被激活，促使具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)生成，使細(xì)胞免受應(yīng)激反應(yīng)的損傷，維護(hù)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和生理平衡，稱為非折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse，UPR)。但是如果嚴(yán)重而持續(xù)的ERS超過自身調(diào)節(jié)能力，則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織損傷[12-13]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性凋亡及凋亡相關(guān)蛋白近年來成為研究的熱點(diǎn)。ERS誘導(dǎo)的UPR主要通過轉(zhuǎn)錄激活因子-6(activating transcription factor 6,ATF-6)、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(phosphorylated extracellular signal regulated kinase,PERK)、肌醇依賴性蛋白激酶(inositol requiring enzyme 1,IRE1)3種感應(yīng)蛋白介導(dǎo)的信號通路來實(shí)現(xiàn)[14]。GRP78被認(rèn)為是ERS的經(jīng)典標(biāo)志物之一。在正常情況下與上述3個(gè)感應(yīng)蛋白結(jié)合，封閉了它們的信號。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)下，GRP78首先被釋放出來與非折疊蛋白結(jié)合，達(dá)到阻止這些非折疊蛋白輸出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的目的，進(jìn)而對細(xì)胞起保護(hù)作用[15]。在本研究中，局灶性缺血再灌注24 h后GRP78表達(dá)明顯上調(diào)提示，缺血再灌注啟動了ERS過程。

Caspase-12途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)凋亡的一個(gè)重要途徑。正常情況下Caspase-12是ERS誘發(fā)凋亡的特異性介質(zhì)，非ERS相關(guān)刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中不被激活。研究表明,抑制Caspase-12介導(dǎo)的ERS通路后，缺血再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡可以減少。對于Caspase-12基因缺陷大鼠，可以抵抗由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的凋亡，對于其他死亡刺激并不能抵抗凋亡的發(fā)生[16-17]。在本研究中，局灶性腦缺血再灌注后，缺血側(cè)聽皮層凋亡陽性細(xì)胞明顯增多，Caspase-12蛋白表達(dá)明顯增高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動了相關(guān)凋亡途徑，并進(jìn)一步激活相關(guān)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生凋亡。

在腦缺血再灌注損傷過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡途徑可能是腦缺血損傷聽皮層引發(fā)聽力下降的可能機(jī)制之一。因此，如何抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其相關(guān)凋亡途徑，可為治療伴有腦血管疾病的突發(fā)性耳聾提供了新的研究思路及研究方向。

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