陳雄飛，袁俊建，張執(zhí)全，郭忠健，郭 堯，劉汝海，李鳳山

(河北省滄州市中心醫(yī)院：1.普外一科；2.病理科；3.中心實(shí)驗(yàn)室 061001)

包含轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子(FXYD)結(jié)構(gòu)域的FXYD6蛋白作為FXYD家族蛋白成員之一，為Ⅰ型跨膜蛋白，通過調(diào)節(jié)鈉、鉀泵的活性發(fā)揮部分生物學(xué)功能[1]，其在神經(jīng)元中高表達(dá)，利于突觸體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]，在維持神經(jīng)元正常形態(tài)和功能方面發(fā)揮了重要作用[3]，且FXYD6與精神分裂癥相關(guān)[4]。同時(shí)，F(xiàn)XYD6作為一種腫瘤相關(guān)蛋白，在膽管癌[5-6]、肝癌[7]、鼻咽癌[8]等惡性腫瘤中高表達(dá)，可促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞增殖與侵襲[9]。為研究FXYD6蛋白的組織學(xué)分布和生物學(xué)作用，并為相關(guān)腫瘤的靶向治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，本課題組現(xiàn)制備抗人FXYD6特異性多肽單克隆功能性抗體庫，并對(duì)其胞外區(qū)單克隆抗體生物學(xué)作用進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1材料 人FXYD6胞內(nèi)區(qū)-G4S-FXYD6胞外區(qū)-G4S-GST-His6TAG基因序列的原核表達(dá)質(zhì)粒、BSA-FXYD6胞外區(qū)偶聯(lián)蛋白(中國華大蛋白基因有限公司合成)；大腸桿菌BL21(中國北京康潤誠業(yè)生物技術(shù)公司)；Ni Sepharose 6 Fast Flow純化柱(中國GE Healthcare生物科學(xué)公司)；SPF級(jí)BALB/c小鼠(中國科學(xué)院遺傳所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞(中國華大基因蛋白生物有限公司)；pcDNA3.1-FXYD6質(zhì)粒(前期制備)；293T細(xì)胞株、HepG2細(xì)胞株(ATCC中科院生物物理所凍存)；胎牛血清,1640培養(yǎng)基，次黃嘌呤、甲氨喋呤、胸腺嘧啶核苷(HAT)培養(yǎng)基、次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷(HT)培養(yǎng)基、聚乙二醇(美國Sigma公司)；抗體亞類試劑盒(美國Southern Biotech公司)；鼠抗Myc單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體、鼠單克隆抗體IgG(中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(中國武漢博士德生物工程有限公司)；Western blot高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(中國北京康為世紀(jì)生物有限公司)；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L，中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；健康人腦顳葉組織、肝癌組織、正常肝組織(滄州市中心醫(yī)院病理科留存的石蠟標(biāo)本)。

1.2方法

1.2.1抗原蛋白的表達(dá) 將人FXYD6胞內(nèi)區(qū)-G4S-FXYD6胞外區(qū)-G4 S-GST-His6TAG 基因序列的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)載體BL21(DE3)，BL21菌生長至對(duì)數(shù)期后，0.5 mmo/L異丙基-β-8-D硫代半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)，為誘導(dǎo)組，同時(shí)設(shè)未加ITPG的非誘導(dǎo)組，37 ℃培養(yǎng)4 h，離心收菌，制備蛋白樣品，12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察表達(dá)蛋白條帶。

1.2.2抗原蛋白純化 離心收集IPTG誘導(dǎo)后的BL21菌，25 mmol/L Tris 150 mmol/L、NaCl的裂解液重懸，冰上超聲破碎，離心，分離制備上清液和沉淀，蛋白制品 SDS-PAGE，考馬斯亮染色，脫色后發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要集中在上清液中。上清液流經(jīng)Ni-NTA金屬螯合柱行層析純化，30 mmol/L咪唑磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫雜蛋白，200 mmol/L咪唑PBS洗脫目的蛋白，將目的蛋白超濾換至PBS并濃縮。

1.2.3動(dòng)物免疫 參照脾內(nèi)注射方法[10]，選擇6～8周齡的SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠，脾臟內(nèi)注射50 μg抗原蛋白，免疫7 d后，小鼠內(nèi)眥取血，間接酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)，初次免疫2周后用抗原蛋白每只30 μg腹腔注射沖擊免疫達(dá)到效價(jià)要求的小鼠。

1.2.4雜交瘤細(xì)胞融合、篩選、鑒定 取加強(qiáng)免疫3 d后的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0小鼠骨髓瘤(1∶5)，應(yīng)用聚乙二醇(PEG)細(xì)胞融合法進(jìn)行融合，HAT培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，有限稀釋法篩選陽性克隆，即用FXYD6重組蛋白及標(biāo)簽蛋白通過間接ELISA法篩選針對(duì)重組FXYD6抗原有免疫反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株，同時(shí)去除對(duì)標(biāo)簽蛋白有免疫反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株，即得到針對(duì)分泌FXYD6胞內(nèi)區(qū)或胞外區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株。抗體亞類測(cè)定試劑盒檢測(cè)雜交瘤分泌抗體亞型，應(yīng)用BSA-FXYD6胞外區(qū)多肽通過間接ELISA方法在分泌FXYD6胞內(nèi)區(qū)或胞外區(qū)特異性強(qiáng)的單克隆抗雜交瘤中篩選針對(duì)其分泌胞外區(qū)單抗的細(xì)胞株，陽性反應(yīng)的即為分泌胞外區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株，陰性反應(yīng)的即為分泌胞內(nèi)區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞株。間接ELISA法測(cè)定FXYD6單抗的特異性與效價(jià)，用于特異性鑒定的非相關(guān)抗原包括FXYD1、FXYD2、FXYD3、FXYD4、FXYD5、FXYD7。選取分泌特異性強(qiáng)及效價(jià)高的針對(duì)胞外區(qū)多肽的單克隆雜交瘤行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

人腦顳葉組織、肝癌、正常肝組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，在0.3%過氧化氫溶液中避光30 min，5%馬血清封閉1 h后，滴加已篩選出針對(duì)胞外區(qū)或胞內(nèi)區(qū)的雜交瘤分泌的上清液(1∶3稀釋)，4 ℃過夜，1∶200的生物素標(biāo)記馬抗小鼠IgG 37 ℃孵育1 h，1∶200的辣根過氧化物標(biāo)記鏈卵白素37 ℃孵育40 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，逐級(jí)脫水，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察單抗與組織中FXYD6結(jié)合情況。

1.2.5陽性雜交瘤染色體數(shù)目分析 取對(duì)數(shù)生長期雜交瘤細(xì)胞，終濃度0.25 μmol/L秋水仙素處理2 h，離心收集細(xì)胞，37 ℃低滲KCl溶液處理15 min，加入甲醇、冰醋酸固定液(3∶1)固定4 min，離心，棄去上清液。在細(xì)胞沉淀中加入固定液，室溫靜置30 min后離心，棄去上清液。重復(fù)該步驟。滴加細(xì)胞懸液到4 ℃載玻片上，室溫自然干燥后用10%的Giemsa溶液染色30 min，洗去染液，二甲苯通透、中性樹脂封片，鏡下觀察選擇分散良好和完整的中期分裂象并照相，統(tǒng)計(jì)染色體平均數(shù)目(計(jì)數(shù)大于或等于50個(gè)細(xì)胞染色體/樣品)。

1.2.6FXYD6胞外區(qū)單克隆抗體制備 BALB/c小鼠腹腔注射500 μL石蠟油，1周后腹腔注射1 mL PBS洗滌并定量5×105～9×105/mL分泌胞外區(qū)單抗的雜交瘤細(xì)胞。1周后取腹水，離心，應(yīng)用蛋白G親合層析法純化抗體，間接ELISA法測(cè)抗體效價(jià)。

1.2.7FXYD6胞外區(qū)單克隆抗體功能性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期的293T細(xì)胞，以1×105/mL接種24 h后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1-FXYD 6∶2 μg質(zhì)粒pcDNA3.1-FXYD6稀釋于500 μL Opti-MEM中，另一培養(yǎng)皿加500 μL培養(yǎng)基作對(duì)照(未轉(zhuǎn)染組)，混勻后加入2 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕柔混勻，室溫放置15 min，6 h后更換成DMEM培養(yǎng)基，再培養(yǎng)30 h，制備蛋白樣品，用Myc單抗和胞外區(qū)單抗Western blot檢測(cè)真核質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)后的293T細(xì)胞FXYD6的表達(dá)。收集已轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞，0.3%BSA洗滌細(xì)胞后加入以PBS稀釋的胞外區(qū)單克隆抗體(1∶200 PBS稀釋)，以小鼠IgG作為空白對(duì)照，4 ℃孵育45 min，0.3%BSA 洗滌，加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)，4 ℃避光孵育30 min，0.3%BSA 洗滌，細(xì)胞重懸于PBS，行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

取對(duì)數(shù)生長期高表達(dá)FXYD6蛋白的HepG2細(xì)胞[8]，以4×103/mL，100 μL接種于96孔板完全培養(yǎng)基中，每孔加入不同濃度的FXYD6胞外區(qū)單克隆抗體(終濃度分別為5、10、20 μg/mL)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)小鼠單抗IgG同型對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)5 h，棄上清液，每孔200 μL PBS洗滌，加入100 μL DMSO溶解藍(lán)紫色結(jié)晶顆粒后測(cè)定A490。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1抗原蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 經(jīng)SDS-PAGE、脫色后，誘導(dǎo)組較非誘導(dǎo)組出現(xiàn)明顯的梭形條帶，表達(dá)出目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)期相符，見圖1。

1、2、3、5:誘導(dǎo)組；4:非誘導(dǎo)組；M:蛋白marker

2.2抗原蛋白的純化 全菌經(jīng)超聲破碎后，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白主要集中在上清液中(圖2)。因重組蛋白含有His標(biāo)簽，選用鎳柱純化目的蛋白，在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)目的蛋白與鎳柱結(jié)合較弱，較低濃度咪唑就可以將目的蛋白洗脫，確定以30 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，高濃度咪唑洗脫目的蛋白，超濾換PBS后，目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度達(dá)90%左右，見圖3。

1：上清液；2：沉淀；M：蛋白marker

1:上清液;2:穿透液;3:穿透液;4:200 mmol/L咪唑洗脫液;5:純化的目的蛋白；M:蛋白marker

2.3雜交瘤細(xì)胞株的建立及單克隆抗體鑒定 經(jīng)過1年的反復(fù)凍存和復(fù)蘇培養(yǎng)，成功篩選出3株穩(wěn)定分泌效價(jià)高、特異性強(qiáng)的FXYD6單克隆抗體的雜交瘤，這3株陽性雜交瘤行Giemsa染色，鏡下觀察均有106條染色體，為脾淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)量之和。2株雜交瘤細(xì)胞分泌針對(duì)胞內(nèi)區(qū)的單克隆抗體，抗體亞型分別為IgG2a、IgG2b，輕鏈均為k鏈；1株雜交瘤細(xì)胞分泌針對(duì)胞外區(qū)的單克隆抗體，抗體亞型為IgG1，輕鏈為λ鏈。制備的3株雜交瘤的上清液均可以識(shí)別腦組織中的神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)元彌漫著色，細(xì)胞核未見著色，而膠質(zhì)細(xì)胞未見明顯著色(圖4A)，肝癌組織較正常肝組織高表達(dá)FXYD6蛋白，見圖4B、C。

A.FXYD6蛋白在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)(×400)； B.FXYD6蛋白在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)(×400)；C.FXYD6蛋白在正常肝細(xì)胞中不表達(dá)(×100)

2.4FXYD6胞外區(qū)單抗功能性檢測(cè) 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FXYD6胞外區(qū)單克隆抗體可以特異性識(shí)別真核表達(dá)載體pcDNA3.1-FXYD6瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞表達(dá)的天然構(gòu)象人FXYD6蛋白(圖5)，真核表達(dá)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞后表達(dá)的人FXYD6蛋白位于14×103～20×103。FXYD6胞外區(qū)單克隆抗體可以抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，中濃度(10 μg/mL)單抗較低濃度(5 μg/mL)單抗對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，有一定的濃度依賴性，然而高濃度(20 μg/mL)單抗較中濃度(10 μg/mL)單抗抑制細(xì)胞增殖不明顯(圖6)。新制備的FXYD6胞外區(qū)單抗為功能阻斷性抗體。

A:FCM檢測(cè)；B:Western blot檢測(cè)。1:未轉(zhuǎn)染組;2、3:轉(zhuǎn)染組;2:Myc單抗；3:FXYD6胞外區(qū)單抗

圖6 FXYD6胞外區(qū)單克隆抗體抑制HepG2細(xì)胞增殖

3 討 論

FXYD家族蛋白是跨膜蛋白，因其胞外近跨膜區(qū)含較固定的PFXYD氨基酸序列而得名[11]。通過調(diào)節(jié)不同鈉鉀泵同工酶發(fā)揮部分功能，而FXYD2本身就是Na,K-ATPase γ亞基[12]。部分成員還是腫瘤相關(guān)蛋白，與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。FXYD3在多種腫瘤中高表達(dá)，與直腸癌放療抵抗、局部復(fù)發(fā)相關(guān)，是直腸癌患者預(yù)后較差的指標(biāo)[13]。FXYD5是表達(dá)于多種癌細(xì)胞和少量正常細(xì)胞表面的糖化膜蛋白，通過下調(diào)E-鈣黏素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，其高表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)[14]。FXYD6蛋白沒有糖基化及磷酸化[11]。本研究通過原核表達(dá)制備有效的抗原片段來制備識(shí)別天然構(gòu)象抗原的單克隆抗體，在對(duì)抗原設(shè)計(jì)時(shí)去除蛋白功能區(qū)中的跨膜序列；胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)氨基酸序例串聯(lián)與GST融合表達(dá)，不僅有助于抗原蛋白的正確折疊，將FXYD6胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)序列完全暴露于融合蛋白表面，提高抗原的免疫原性，同時(shí)也提高目的蛋白可融性，便于后續(xù)蛋白純化。

大腸桿菌BL21表達(dá)出的目的蛋白穩(wěn)定性高，不易被降解。本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的人FXYD6胞內(nèi)區(qū)-G4S-FXYD6胞外區(qū)-G4S-GST-His6TAG基因序列表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌BL21，誘導(dǎo)獲得FXYD6重組蛋白可溶性的高效表達(dá)。因重組蛋白有His標(biāo)簽，本研究選用鎳柱純化蛋白，重組蛋白與鎳柱結(jié)合力較弱，選用30 mmol/L咪唑洗脫雜蛋白，高濃度咪唑洗脫目的蛋白，濃縮、超濾換PBS液后，獲得高純度的FXYD6重組蛋白。

LIU等[15]制備的單抗不能識(shí)別天然構(gòu)象的抗原蛋白，為非功能性胞外區(qū)單抗?；诖耍狙芯坑眉兓闹亟MFXYD6抗原免疫小鼠，制備針對(duì)胞外區(qū)或胞內(nèi)區(qū)的單克隆抗體，同時(shí)以期獲得識(shí)別天然構(gòu)象功能性胞外區(qū)單克隆抗體。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠直接脾內(nèi)注射免疫的方法，此法周期短，抗原直接接觸免疫細(xì)胞，有免疫原性和反應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)[11]。加強(qiáng)免疫后，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞融合，篩選出融合的雜交瘤細(xì)胞株后再用標(biāo)簽蛋白篩選去除對(duì)標(biāo)簽蛋白或串聯(lián)多肽序列有陽性反應(yīng)的雜交瘤，即得到分泌針對(duì)FXYD6胞內(nèi)區(qū)或胞外區(qū)單抗的雜交瘤，BSA-FXYD6胞外區(qū)多肽篩選出分泌胞外區(qū)單抗雜交瘤細(xì)胞株。在對(duì)FXYD6胞外區(qū)單抗特異性鑒定中發(fā)現(xiàn)：制備的單抗與其他FXYD蛋白無明顯交叉反應(yīng)；可以特異性識(shí)別腦組織中的FXYD6蛋白。本研究還發(fā)現(xiàn)FXYD6蛋白在肝癌組織中高表達(dá)；FXYD6胞外區(qū)單克隆抗體可以特異性識(shí)別天然構(gòu)象的FXYD6蛋白。

近期研究發(fā)現(xiàn)FXYD6蛋白與多種腫瘤相關(guān)，F(xiàn)XYD6過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移[8,10]。在對(duì)FXYD6胞外區(qū)單抗功能進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)其可抑制高表達(dá)FXYD6蛋白的肝癌HepG2細(xì)胞增殖，其抑制作用與制備的胞外區(qū)單抗有一定的濃度依賴性，胞外區(qū)單抗屬于阻斷性抗體，然而高濃度單抗較中濃度單抗抑制細(xì)胞增殖作用無明顯差異。

總之，本研究成功制備了分泌針對(duì)FXYD6胞內(nèi)區(qū)或胞外區(qū)的單抗雜交瘤細(xì)胞株，并制備了FXYD6胞外區(qū)功能阻斷性單抗，這為研究FXYD6蛋白的組織分布、具體作用機(jī)制和一些腫瘤的靶向治療奠定了良好基礎(chǔ)。

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