吳良宇，向平，劉玲娟，何通川，房松華，呂鐵偉，田杰，李謐

心力衰竭是小兒心血管疾病中由多種因素引發(fā)的一組心功能受損的嚴重綜合征，是兒童致死的常見原因之一[1]。目前，傳統(tǒng)藥物治療只能在一定程度上保護心肌、延緩心臟疾病的進程，卻無法使功能性心肌細胞再生，難以從根本上逆轉(zhuǎn)慢性心衰的發(fā)展進程[2]。心臟移植是治療心衰的最終方法，但因供體受限、術(shù)后長期免疫抑制、免疫排斥等原因，很難在臨床上大規(guī)模推廣[3-4]。細胞移植修復受損心肌具有誘人的前景[5]。近十余年，國內(nèi)外學者在通過Wnt信號通路誘導干細胞向心肌細胞分化做了大量的研究，并取得了肯定的效果。wnt5a是非經(jīng)典Wnt信號通路的代表配體。研究發(fā)現(xiàn)，wnt5a表達上調(diào)可通過激活Notch信號促進內(nèi)皮祖細胞向心肌細胞分化[6]，wnt5a也能夠通過激活蛋白激酶C δ(PKC δ)從而增加人類循環(huán)前體細胞的心臟基因表達[7]，由此可見，wnt5a在心肌細胞分化和心臟形成過程中具有重要作用。然而，wnt5a在心肌祖細胞向心肌細胞分化成熟及其在心肌受損修復中的作用仍有待進一步研究。本研究旨在探討非經(jīng)典Wnt信號途徑中的wnt5a對心肌祖細胞向心肌細胞分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 心肌祖細胞CP15-5a、wnt5a重組腺病毒、綠色熒光蛋白(GFP)重組腺病毒、HEK293細胞均來自美國芝加哥大學分子腫瘤實驗室。DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基及優(yōu)質(zhì)胎牛血清FBS購自美國Gibco公司，全蛋白提取試劑盒、Western blotting配膠試劑盒和Super ECL檢測液購自中國凱基公司，RNA提取試劑盒、Real-time PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，鼠抗β-actin單克隆抗體購自中國鐘鼎生物公司，兔抗鼠CX43單克隆抗體購自美國Cell signaling公司，鼠單抗cTnT單克隆抗體購自英國Abcam公司，HRP標記羊抗兔二抗和HRP標記羊抗鼠二抗購自中國中杉生物公司，Dylight 488抗山羊二抗購自中國Abbkine公司，0.22μm PVDF膜購自美國Millipore公司，一抗二抗洗脫液購自中國碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 HEK293細胞和CP15-5a細胞培養(yǎng) 取HEK293細胞和CP15-5a細胞快速復溫移至含5ml DMEM高糖培養(yǎng)基的離心管中，1000r/min離心5min，用培養(yǎng)基重懸至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待細胞長至培養(yǎng)瓶壁約75%時用PBS洗3次，胰酶消化、1000r/min離心5min，按1:3傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 wnt5a重組腺病毒和GFP重組腺病毒的擴增當培養(yǎng)的HEK293細胞融合至75%時加入1μl病毒原液，培養(yǎng)3d左右，待大部分細胞變圓脫落，用槍頭吹下未脫落細胞，1000r/min離心5min，得到病毒細胞沉淀進行冷凍、融化，劇烈振蕩，重復4次后，4℃、14 000r/min離心15min，取上清即為病毒液。多次重復以上步驟直至得到適當?shù)母叩味认俨《?。采用GFP熒光標記法，分別按10–2~10–6梯度稀釋擴增的腺病毒，取對數(shù)生長期HEK293細胞，計數(shù)，鋪24孔板，每孔500μl(5×105細胞/ml)。每個病毒梯度設3個復孔，每孔滴加50μl待測病毒樣品，培養(yǎng)48h。直接熒光顯微鏡下計數(shù)每視野熒光細胞數(shù)。視野下每個熒光細胞視為一個熒光單位，病毒滴度以綠色熒光形成單位/ml(GFU/ml)表示要。綠色熒光蛋白形成單位/ml(GFU/ml)=[(綠色熒光細胞數(shù)/視野)×(視野/孔)]/[病毒體積(ml)×稀釋系數(shù)]。

1.2.3 Adwnt5a和AdGFP轉(zhuǎn)染CP15-5a細胞 計數(shù)CP15-5a細胞，取5×105個細胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中，設置為3個組，分別是wnt5a組(wnt5a腺病毒轉(zhuǎn)染)、GFP組(GFP腺病毒轉(zhuǎn)染)和空白對照組(未轉(zhuǎn)染)。第2天棄培養(yǎng)基，加入新鮮無血清培養(yǎng)基，wnt5a組和GFP組分別加入4.71μl的wnt5a腺病毒和3.08μl的GFP腺病毒，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)12h再次換液，24h后觀察兩組細胞GFP的表達及細胞生長情況。

1.2.4 流式細胞儀檢測腺病毒對CP15-5a細胞的轉(zhuǎn)染效率 腺病毒轉(zhuǎn)染細胞24h后，取1×106個Adwnt5a轉(zhuǎn)染的細胞作為實驗組，同時取1×106個CP15-5a細胞作為陰性對照組，將細胞消化、離心，用PBS洗2次，200μl PBS重懸至EP管中，在488nm紫外光激發(fā)下計數(shù)GFP陽性細胞比率。

1.2.5 qRT-PCR 腺病毒轉(zhuǎn)染CP15-5a細胞1周后，用RNA提取試劑盒提取分別提取wnt5a組、GFP組和空白對照組細胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參檢測GATA4、MEF2C的mRNA表達量。數(shù)據(jù)分析采用比較Ct法(ΔΔCt)，數(shù)據(jù)取3次重復的平均值，所用引物見表1。

1.2.6 Western blotting檢測CX43、cTnT的表達 腺病毒轉(zhuǎn)染CP15-5a細胞2周后，按照凱基全蛋白提取試劑盒說明書分別提取wnt5a組、GFP組和空白對照組細胞的全蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，配膠，按濃度加樣電泳，半干轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗14h(兔單抗CX43按1:1000稀釋，鼠單抗cTnT按1:10 000稀釋)，TBST洗膜30min，孵育二抗1h(羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗稀釋比例均為1:10 000)，TBST洗膜30min，配制ECL顯影液曝光顯影。數(shù)據(jù)取3次重復的平均值。

表1 PCR引物序列[8]Tab.1 Primer sequence used for PCR assay[8]

1.2.7 免疫熒光技術(shù)檢測CX43的表達 CP15-5a細胞鋪板，wnt5a病毒組和GFP病毒組細胞分別處理2周，漂洗；多聚甲醛固定，漂洗；TritonX-100破膜，漂洗；山羊血清封閉，孵育一抗兔單抗CX43按1:100過夜，漂洗；孵育二抗，漂洗，DAPI染色，封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.8 全細胞膜片鉗技術(shù) wnt5a病毒組和GFP病毒組細胞分別處理2周，對3組細胞進行爬片處理6h，細胞開始貼壁且呈圓形時開始實驗。在時程300ms的去極化脈沖下保持電位–80mV，以10mV間距給予幅值為–120~+50mV的鉗制電壓。應用Clampex程序采樣，采樣頻率為10kHz，濾波頻率2kHz，記錄不同鉗制電壓下的膜電流。采用Axon-patch700B膜片鉗放大器記錄電流，經(jīng)過Digidatal320A轉(zhuǎn)化器和pclamp9.2分析軟件系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，記錄在細胞外液中加入鈉通道阻滯劑河豚毒素(TTX)前后的鈉電流(INa)。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett's T3檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒擴增結(jié)果 腺病毒加入HEK293細胞48h后，熒光顯微鏡觀察可見大部分HEK293細胞出現(xiàn)變亮、變圓、飄落。GFP熒光標記法測得wnt5a腺病毒滴度為1.7×1010GFU/ml，GFP腺病毒滴度為2.6×1010GFU/ml。

2.2 Ad-wnt5a和Ad-GFP感染的CP15-5a細胞形態(tài)改變 Ad-wnt5a和Ad-GFP分別感染CP15-5a細胞24h后，繼續(xù)培養(yǎng)2周，在倒置相差顯微鏡下wnt5a組細胞排列緊密有序且細胞呈長梭形，GFP組細胞排列混亂無方向性。在熒光顯微鏡下觀察可見兩者均有大量綠色熒光(圖1)。

圖1 CP15-5a細胞倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察(×100)Fig.1 Contrast diagram of inverted phase contrast microscope and fluorescence microscope for CP15-5a cells (×100)

2.3 流式細胞儀檢測的病毒轉(zhuǎn)染效率 Ad-wnt5a和Ad-GFP轉(zhuǎn)染CP15-5a細胞24h后，檢測轉(zhuǎn)染效率分別為42.8%、44.3%。

2.4 各組GATA4、MEF2C的表達情況 qRTPCR檢測結(jié)果顯示，wnt5a組中GATA4基因的表達量(1.717±0.220)明顯高于GFP組和空白對照組(1.003±0.087、0.961±0.063)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而GFP組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；wnt5a組中MEF2C基因的表達量(1.847±0.190)明顯高于GFP組和空白對照組(0.456±0.042、0.500±0.095)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而GFP組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

2.5 各組CX43、cTnT蛋白的表達情況 Western blotting檢測結(jié)果顯示，wnt5a組CX43、cTnT蛋白的表達(分別為1.597±0.267、0.727±0.100)明顯高于GFP組和空白對照組(CX43：0.723±0.047、0.783±0.1333；cTnT：0.217±0.021和0.253±0.102)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，而GFP組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖3)。

2.6 免疫熒光技術(shù)檢測CX43的細胞內(nèi)定位 wnt5a組CX43在細胞質(zhì)中有明顯表達，而GFP組CX43在細胞質(zhì)中未見明顯表達(圖4)。

圖2 qRT-PCR檢測GATA4、MEF2C的表達Fig.2 mRNA expression of GATA4 and MEF2C by qRT-PCR

圖3 各組CX43、cTnT的蛋白表達(Western blotting)Fig.3 CX43 and cTnT protein levels in each group (Western blotting)

2.7 全細胞膜片鉗技術(shù)檢測INa經(jīng)腺病毒誘導后，3組細胞中僅wnt5a組可以檢測出INa，且具有一定時間依賴性，INa在–70mV左右開始激活，在–10mV左右時達到最大，在達到+30mV左右時開始消失(圖5A)。在細胞外液加入鈉通道阻滯劑TTX 5min后電流明顯減弱(圖5B)。圖5C為根據(jù)在300ms內(nèi)不同鉗制電壓下測得的各電流峰值均值繪制的I-V曲線。GFP組和空白對照組均未見特異性INa。

圖4 免疫熒光技術(shù)檢測CX43的細胞內(nèi)定位(×200)Fig.4 Intracellular localization of CX43 (Immunofluorescent technique ×200)

3 討 論

干細胞移植治療心臟疾病是近年的研究熱點。隨著臨床病例數(shù)的增多，細胞移植成分逐漸向組成單一、純度高的組織定向干細胞群過渡。但是外源性干細胞移植成分復雜，它們在心肌微環(huán)境的誘導下可表現(xiàn)出向心肌樣細胞、腫瘤細胞等分化的多向性，并由此帶來微梗死、心律失常、腫瘤等一系列的移植并發(fā)癥[9-10]。相對于其他外源性干細胞，心肌祖細胞屬于成體干細胞，能誘導分化為心肌細胞、血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞[11]，采用心肌祖細胞進行細胞移植可能會減少上述移植并發(fā)癥的發(fā)生。此外，心肌損傷后與胚胎發(fā)育的心肌微環(huán)境不同，原始狀態(tài)的干細胞在成熟心肌環(huán)境中不能被正常調(diào)控，移植后只有少數(shù)細胞停留在心臟歸巢現(xiàn)象[12]，而心肌祖細胞是心臟來源的干細胞，在心臟微環(huán)境中有較好的適應性，可能更適合移植后的細胞歸巢。在成體心臟受損時，心肌祖細胞會動員修復受損心肌，但是其代償修復功能有限[13]。原始的心肌祖細胞增殖周期有限，用于細胞體內(nèi)外的研究有很大的局限性。本課題組前期成功建立了心肌祖細胞株[14]，為誘導心肌祖細胞向心肌細胞分化提供了實驗基礎。

圖5 全細胞膜片鉗技術(shù)檢測CP15-5a細胞的INaFig.5 INa in CP15-5a cells (Whole-cell patch clamp technique)

GATA4和MEF2C是心臟早期發(fā)育的重要因子[15-16]。本實驗通過上調(diào)wnt5a培養(yǎng)心肌祖細胞1周后，qRTPCR檢測GATA4和MEF2C的表達明顯增高，從基因?qū)用娉浞肿C明了wnt5a的作用。CX43和cTnT是心肌的特異性蛋白，尤其是cTnT，在心肌中具有高度的特異性[17]，一般只在心肌細胞中表達，可作為鑒定心肌分化的指標。上調(diào)wnt5a干預心肌祖細胞培養(yǎng)2周后，本研究結(jié)果顯示實驗組心肌特異性蛋白cTnT、CX43表達量較對照組明顯增高，提示上調(diào)wnt5a干預心肌祖細胞可促進其分化為心肌細胞。此外CP15-5a細胞要成為成熟的心肌細胞，必須具備同步的自主收縮功能，這除了需要心肌特異性的收縮蛋白以外，心肌特異性的電生理功能也必不可少。本實驗在wnt5a腺病毒感染CP15-5a細胞2周后可以檢測到INa的發(fā)生。INa是心臟發(fā)育過程的重要因子[18]，作為心肌細胞興奮或去極化的第一個離子流，其變化對興奮的發(fā)生及傳導均有重要意義，且在房室樣細胞的分化晚期可以充分表達。而INa的出現(xiàn)進一步說明經(jīng)wnt5a感染后的CP15-5a細胞在電生理上較空白對照組和GFP組細胞更為成熟和完善。以上實驗結(jié)果可以有力地證明wnt5a誘導后的CP15-5a細胞在電生理特性上較空白對照組和GFP組細胞與心肌細胞更為相似，更有可能成功分化為成熟的心肌細胞。此外，與空白對照組和GFP組細胞相比，wnt5a組CP15-5a細胞與正常成熟的心肌細胞有著更好的同質(zhì)性。

Wnt5a是Wnt蛋白家族的成員之一，是非經(jīng)典Wnt信號途徑的代表，在細胞成熟、胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要作用[19-21]。Wnt5a信號在干細胞自我更新、分化及心臟發(fā)生中有著重要的調(diào)控作用，可通過激活非經(jīng)典Wnt信號通路上調(diào)wnt5a的表達，誘導帶有Sca1+/c-kit+的鼠脂肪源性血管基質(zhì)細胞分化為自發(fā)搏動的心肌細胞[22]。本實驗采用wnt5a誘導心肌祖細胞成功分化為了心肌細胞。此外，本實驗通過重組腺病毒穩(wěn)定高效地轉(zhuǎn)染心肌祖細胞，wnt5a基因在細胞中得到穩(wěn)定表達。重組腺病毒具有對宿主細胞致病率低，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達目的基因，無致突變性，并可通過HEK293細胞擴增出理想的高滴度病毒，以及較為經(jīng)濟等多個優(yōu)點[23]。

綜上所述，本研究在體外通過Ad-wnt5a成功誘導了心肌祖細胞向心肌細胞的分化，從而為進一步的體內(nèi)細胞移植修復受損心肌奠定了實驗基礎。后續(xù)將進行體內(nèi)實驗驗證心肌祖細胞移植的效果和并發(fā)癥發(fā)生情況。

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