王博，趙峰，公茂偉，段明達(dá)，霍修林，龔潔，傅強(qiáng)

有效控制術(shù)后疼痛可以提高患者的滿意度和舒適度，加速患者康復(fù)，減少慢性疼痛綜合征的發(fā)生。阿片類(lèi)藥物曾廣泛用于術(shù)后疼痛的治療，但惡心、嘔吐、呼吸抑制等副作用限制了其臨床使用[1]。隨著神經(jīng)阻滯技術(shù)的推廣和應(yīng)用，局部麻醉藥物的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[2-3]，局部注射局麻藥進(jìn)行圍術(shù)期鎮(zhèn)痛也受到了醫(yī)生和患者的青睞。盡管局麻藥可有效減輕患者的疼痛，但臨床常用的局麻藥作用時(shí)間較短，不能有效長(zhǎng)時(shí)間地鎮(zhèn)痛[4-5]，需要間斷注射或通過(guò)植入導(dǎo)管持續(xù)泵入給藥[6]，不僅需要相應(yīng)的設(shè)備，增加了患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，同時(shí)留置的導(dǎo)管容易移位、脫出或引起感染[7]。

隨著藥物緩釋技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)局麻藥緩釋給藥系統(tǒng)進(jìn)行了研究，如水凝膠、脂質(zhì)囊、微球技術(shù)等[8]。微型成球技術(shù)利用天然的或合成的高分子聚合物作為控制藥物釋放的載體，可使藥物緩慢釋放，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間。該技術(shù)的應(yīng)用不僅延長(zhǎng)了局部單次給藥后的鎮(zhèn)痛時(shí)間，減少了給藥次數(shù)，同時(shí)也降低了局麻藥物血藥濃度的波動(dòng)及其毒性反應(yīng)。本研究以生物降解聚合物乳酸-蓖麻油作為載體材料，鹽酸羅哌卡因?yàn)榘幬?，采用雙重乳化-溶劑揮發(fā)法合成一種緩釋制劑羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球，將其植入小鼠坐骨神經(jīng)旁，通過(guò)小鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)阻滯時(shí)效和體內(nèi)血藥濃度來(lái)評(píng)估其緩釋作用效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 羅哌卡因?qū)φ掌?中國(guó)藥品生物制品檢定所)；乳酸-蓖麻油共聚物(實(shí)驗(yàn)室自制)；氫氧化鈉、氯仿等試劑均為市售化學(xué)純或分析純。ZH-YLS-6B智能熱板儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；LC-1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；FJ200-S數(shù)顯高速均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；DF-Ⅱ型恒溫磁力攪拌器(金壇市杰瑞爾電器有限公司)。

1.2 藥物的制備 采用雙重乳化-溶劑揮發(fā)法制備乳酸-蓖麻油共聚物微球。精密稱(chēng)取一定量的羅哌卡因，用蒸餾水溶解作為內(nèi)水相；另取適量乳酸-蓖麻油共聚物和乳化劑溶于二氯甲烷作為有機(jī)相。將兩相混合，采用高速分散均質(zhì)機(jī)均質(zhì)90s，制成初乳。將初乳移入外水相聚乙烯醇水溶液中，用高速分散均質(zhì)機(jī)均質(zhì)90s，制得復(fù)乳。將復(fù)乳在磁力攪拌器上攪拌2h后離心、過(guò)濾，用超純水洗滌3次，收集微球，真空冷凍干燥24h后，–4℃儲(chǔ)藏備用。對(duì)照組不加羅哌卡因，同種方法制備成不含藥的乳酸-蓖麻油共聚物空白微球。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選 取體重20~25g的雄性昆明小鼠，置于50℃ ZH-YLS-6B智能熱板上，以小鼠舔后足反應(yīng)的潛伏期為痛閾指標(biāo)，每只小鼠測(cè)定3次，每次間隔5min，取3次測(cè)定結(jié)果的平均值作為基礎(chǔ)痛閾。將反應(yīng)潛伏期小于5s或大于30s的小鼠剔除，并保證小鼠雙側(cè)下肢感覺(jué)運(yùn)動(dòng)無(wú)明顯差異。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 將篩選后符合標(biāo)準(zhǔn)的150只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為3組：空白微球?qū)φ战M(A組，n=50)、羅哌卡因組(B組，n=50)、羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球組(C組，n=50)。小鼠經(jīng)2%七氟醚吸入麻醉后俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剔除臀部鼠毛，切開(kāi)皮膚和皮下組織，鈍性分離暴露雙下肢坐骨神經(jīng)，在其周?chē)鶆虬裎⑶蚧蜃⑷臌}酸羅哌卡因(0.2ml，0.5%)建立動(dòng)物模型。

1.5 小鼠坐骨神經(jīng)感覺(jué)阻滯評(píng)估 每組分別在給藥后10min、30min、1h、3h、5h、7h、10h、15h、30h、48h時(shí)間點(diǎn)采用熱踏板法測(cè)定小鼠舔后足潛伏時(shí)間，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定5只小鼠。

1.6 小鼠坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分 熱板實(shí)驗(yàn)30s后提尾觀察小鼠后爪的伸展及屈曲能力并進(jìn)行評(píng)分。1分為足部及趾部伸展及屈曲正常；2分為足部及趾部屈曲正常，伸展能力受抑制；3分為足部及趾部尚能屈曲，但無(wú)伸展能力；4分為足部及趾部無(wú)屈曲及伸展能力，步態(tài)異常甚至出現(xiàn)拖腿現(xiàn)象。

1.7 高效液相色譜法測(cè)定小鼠血漿中羅哌卡因濃度 色譜條件：色譜柱InertSustain C18，5μm，4.6mm×250.0mm；流動(dòng)相為乙腈-磷酸二氫鈉-三乙胺(48:52:0.15)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.15；流速1.0ml/min；進(jìn)樣量20μl；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。血漿樣品處理：各組小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)完成坐骨神經(jīng)感覺(jué)阻滯評(píng)估及運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分后行眼眶取血，肝素抗凝，3500r/min離心8min，離心后提取血漿0.3ml，置于–20℃冰箱中備用。分析測(cè)定時(shí)，室溫下溶解血漿標(biāo)本，取200μl，加入100μl甲醇，漩渦混勻3min，10 000r/min離心10min后取上清液，注入液相色譜儀。血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取空白小鼠血清0.5ml，加入不同濃度的羅哌卡因?qū)φ掌啡芤海渲瞥蓾舛葹?.025~1μg/ml羅哌卡因血漿樣品，按樣品處理方法操作進(jìn)行色譜分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，符合正態(tài)分布者采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者采用Wilcoxon秩檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 感覺(jué)阻滯的評(píng)估 在植入羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球后3h，C組小鼠給藥側(cè)肢體出現(xiàn)明顯的感覺(jué)阻滯效果，反應(yīng)時(shí)間較B組明顯延長(zhǎng)，10h時(shí)藥效達(dá)到最強(qiáng)，30h時(shí)藥效明顯降低，48h時(shí)藥效基本消退。C組給藥后起效時(shí)間與B組相比較慢(表1)。

表1 小鼠熱踏板縮足反應(yīng)潛伏時(shí)間(s，±s，n=5)Tab. 1 Paw withdrawal thermal latency of the mice measured by hot plate (s, ±s, n=5)

表1 小鼠熱踏板縮足反應(yīng)潛伏時(shí)間(s，±s，n=5)Tab. 1 Paw withdrawal thermal latency of the mice measured by hot plate (s, ±s, n=5)

(1)P<0.05 compared with group A; (2)P<0.05 compared with group B

Time Group A Group B Group C 10min 12.31±1.21 13.35±1.22 13.54±1.45 30min 12.51±1.82 15.51±1.88(1) 13.81±1.82 1h 13.12±1.33 26.12±0.93(1) 13.41±2.00 3h 12.30±1.51 17.30±1.45(1) 16.31±1.55(1)5h 11.51±1.72 15.51±1.82(1) 18.31±0.81(1)7h 13.32±2.01 13.32±1.02 20.31±2.20(1)(2)10h 12.31±1.20 12.11±1.24 22.31±1.45(1)(2)15h 11.31±0.91 12.00±1.11 22.31±1.65(1)(2)30h 11.81±1.81 13.81±0.82 18.31±1.89(1)(2)48h 13.45±1.14 12.20±1.22 15.31±1.14

2.2 運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分 A組小鼠肢體均無(wú)運(yùn)動(dòng)阻滯現(xiàn)象，運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分為1分。B組小鼠1h時(shí)30%運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分為3分，70%運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分為2分，阻滯效果達(dá)到最強(qiáng)(P=0.003)；10h后基本恢復(fù)正常。C組小鼠3h時(shí)75%給藥側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分為2分，25%為1分(P=0.015)；10h后80%運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分為2分，20%為3分，阻滯效果達(dá)到最強(qiáng)(P=0.008)；30h時(shí)40%運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分為1分，60%運(yùn)動(dòng)阻滯評(píng)分為2分，運(yùn)動(dòng)阻滯開(kāi)始恢復(fù)(P=0.05)；48h后基本恢復(fù)正常(P=0.317)。各時(shí)間點(diǎn)各組小鼠行走及步態(tài)均未見(jiàn)明顯異常。

2.3 血藥濃度測(cè)定結(jié)果 C組小鼠羅哌卡因血藥濃度在3h內(nèi)上升較快，隨后繼續(xù)上升，10h達(dá)峰值，為121.25ng/ml，此后開(kāi)始逐漸下降，48h后降至較低濃度。B組小鼠羅哌卡因血藥濃度在1h內(nèi)迅速上升，并于1h時(shí)達(dá)峰值，為199.87ng/ml，此后迅速下降，7h后基本消除完全。與B組比較，C組小鼠血漿羅哌卡因濃度上升速度較慢，波動(dòng)范圍較小(圖1)。

3 討 論

圖1 小鼠血漿羅哌卡因濃度-時(shí)間曲線Fig. 1 Plasma ropivacaine concentration - time curve of mice

羅哌卡因是臨床上大量用于治療急、慢性疼痛的局麻藥物，具有高度的感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)阻滯分離特性，低濃度時(shí)以感覺(jué)神經(jīng)阻滯為主，無(wú)進(jìn)行性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)阻滯，提高了患者迅速恢復(fù)運(yùn)動(dòng)的可能性，而且具有中樞神經(jīng)和心血管毒性低、作用時(shí)間較長(zhǎng)的特點(diǎn)[9-10]，更適用于各種疼痛的治療。聚乳酸(polylactic acid，PLA)是一種可生物降解材料，能被自然界中微生物完全降解為二氧化碳和水，不污染環(huán)境，因此在環(huán)保材料和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景，已有眾多學(xué)者將其用于藥物緩釋微球技術(shù)的研究[11-14]。蓖麻油是從蓖麻籽中提取的一種幾乎無(wú)色或微帶黃色的澄清黏稠液體，其中將近90%的成分為蓖麻油酸，其余的脂肪酸包括亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸等。已有蓖麻油與乳酸共聚合成高聚物作為藥物緩釋載體的相關(guān)報(bào)道[15-18]。

本實(shí)驗(yàn)室前期已成功將乳酸-蓖麻油共聚物作為羅哌卡因的載體材料，合成了羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物緩釋微球，研究發(fā)現(xiàn)其在體外可緩慢穩(wěn)定釋放，7d內(nèi)約釋放80%。乳酸-蓖麻油共聚物空白微球?qū)π∈笞巧窠?jīng)無(wú)阻滯作用，因此本實(shí)驗(yàn)中用于空白對(duì)照組。本研究結(jié)果表明，羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球在小鼠坐骨神經(jīng)旁可發(fā)揮較好的緩釋作用，其熱痛覺(jué)阻滯時(shí)間較羅哌卡因注射液明顯延長(zhǎng)，可達(dá)到48h的感覺(jué)阻滯效果，而運(yùn)動(dòng)阻滯作用輕微，在臨床鎮(zhèn)痛方面具有重要的研究?jī)r(jià)值。血藥濃度測(cè)定結(jié)果表明羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球清除時(shí)間明顯延長(zhǎng)，血藥濃度低，波動(dòng)幅度小。因?yàn)檠芯砍跗诤铣傻奈⑶蛄酱螅d藥量較少，血藥濃度低，使鎮(zhèn)痛效果降低，后續(xù)研究中將進(jìn)一步探討如何提高微球載藥量、提高血藥濃度。

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