馬英輝,李利軍*,盧美歡

(陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)是一種膜結(jié)合糖蛋白［1］,廣泛存在于人體血液中。ACE是一種多功能酶,在腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)中,通過形成活性血管緊張素Ⅱ使血壓升高［2］；在激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein kinin system,KKS)中,通過使緩激肽失活,從而引起高血壓［3］。所以,抑制ACE的活性是減少或治療高血壓的重要途徑。ACE抑制劑是具有抑制ACE抑制活性的多肽類物質(zhì),是一種含有3～10個(gè)氨基酸殘基的小分子多肽類物質(zhì),分子質(zhì)量在300～10 000 Da之間［4］,1979年,OSHIMA G等［5］通過細(xì)菌膠原酶將明膠酶解后,從酶解液中分離出6組ACE抑制活性較好的組分,這是最早從食源性蛋白中提取到的ACE抑制肽。而后,科研人員開始研究各種食源性ACE抑制肽,LIY等［6］利用篩選出的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)Z17菌株發(fā)酵牛乳,并采用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜分離純化出2種ACE抑制肽。程龍等［7］從31株來源于云南傳統(tǒng)發(fā)酵食品的乳酸菌中篩選出了具有產(chǎn)高效ACE抑制劑植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)YM-4-3,ACE抑制率達(dá)到 81.23%。WUQ 等［8］采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶水解蠶蛹蛋白,經(jīng)分離純化后得到ACE抑制活性最高的多肽,半抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC50)值為102.15μg/mL。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,王志國［9］以牛蛙肌肉蛋白來源的ACE抑制肽為基礎(chǔ),構(gòu)建大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)系統(tǒng),制備ACE抑制肽,并通過體外和體內(nèi)檢測(cè)證明重組ACE抑制肽具有較高活性。但國內(nèi)對(duì)于以大豆蛋白為基質(zhì)微生物發(fā)酵法制備ACE抑制劑的研究還處起步階段。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的已經(jīng)在釀造行業(yè)工業(yè)化應(yīng)用的菌株進(jìn)行ACE抑制活性的篩選,并采用單因素試驗(yàn)對(duì)所篩選的菌株進(jìn)行ACE抑制劑發(fā)酵條件優(yōu)化,以期為后續(xù)工業(yè)法生產(chǎn)ACE抑制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

米曲霉(Aspergillus oryzae)KL、米曲霉(Aspergillus oryzae)1、米曲霉(Aspergillusoryzae)2、米曲霉(Aspergillus oryzae)3、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)90、黑曲霉(Aspergillusniger)3324、毛霉(Mucor sp.)309均為實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextroseagar,PDA)培養(yǎng)基)：實(shí)驗(yàn)室自制；液體篩選培養(yǎng)基：大豆分離蛋白1%,葡萄糖2%,氯化鈉0.5%,定容至1000mL,pH自然；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆分離蛋白20%,葡萄糖2%,氯化鈉0.5%,pH自然；淺盤固體培養(yǎng)基：大豆500 g,1∶1(g∶mL)加水浸泡24 h,121℃滅菌30 min,其余培養(yǎng)基在121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)、馬尿酰-組胺酰-亮氨酸(hippurly-histidyl-leucine,HHL)(純度99%)：美國Sigma公司；L-亮氨酸、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)(G-250)：美國Amresco公司；鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)、三氯乙酸、甲醇、乙腈：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；C-18柱：大連依利特分析儀器有限公司。其他無特殊說明的試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TV-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；1260高效液相色譜儀(highperformance liquid chromatography,HPLC)：美國安捷倫公司；DHZ-D恒溫?fù)u床：江蘇太倉儀器設(shè)備廠；DH-250A電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京科偉儀器公司；3K15冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)方法

(1)發(fā)酵液中多肽含量測(cè)定［10］

蛋白水解所產(chǎn)生的α-氨基與鄰苯二甲酸(OPA)在含有三氯乙酸溶液中會(huì)形成加成化合物,該化合物在波長(zhǎng)340nm處具有強(qiáng)烈的吸收,以此來反映樣品溶液中多肽的含量。按照亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品溶液中的多肽含量。

(2)蛋白水解度測(cè)定

蛋白水解度(degree of hydrolysis,DH)測(cè)定方法參照文獻(xiàn)［11］。

(3)發(fā)酵液中ACE抑制率測(cè)定［12］

ACE以Hip-His-Leu(HHL)為底物催化產(chǎn)生馬尿酸,其生成量與ACE的活性成線性關(guān)系,但加入ACE抑制肽后,會(huì)抑制ACE活性,從而產(chǎn)生更少的馬尿酸,因此根據(jù)馬尿酸的含量,對(duì)比ACE活性,即可獲得ACE抑制率。

發(fā)酵液中ACE抑制率測(cè)定采用高效液相色譜法,其檢測(cè)條件：C-18色譜柱(4.6 mm×250 mm)；檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm；柱溫20℃；流動(dòng)相水∶甲醇=40∶60(均含0.1%甲酸,V/V)；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10μL。

馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別配制馬尿酸濃度為0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液,過0.22μm的濾膜后,采用高效液相色譜法檢測(cè)馬尿酸含量,以峰面積(y)為縱坐標(biāo),馬尿酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中馬尿酸測(cè)定：50μL HHL溶液、20μL發(fā)酵上清液、50μL ACE溶液,于37℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min,加入120μL乙腈終止反應(yīng),振蕩10s,離心10min,取上清液10μL過0.22μm的濾膜,待測(cè)。以緩沖液替代反應(yīng)體系中的發(fā)酵上清液為空白對(duì)照組。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)菌種篩選

分別將米曲霉KL、米曲霉1、米曲霉2、米曲霉3、枯草芽孢桿菌90、黑曲霉3324、毛霉309活化后,按10%的接種量接種于液體篩選培養(yǎng)基中,細(xì)菌于37℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h,真菌于28℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)后,4 000 r/min離心20 min,取上清液測(cè)定多肽含量和ACE的抑制率,以此為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定高產(chǎn)ACE抑制劑的生產(chǎn)發(fā)酵菌株。

(2)發(fā)酵條件優(yōu)化

將菌株在液體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行活化,并按10%接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基(或淺盤固體培養(yǎng)基)中,以產(chǎn)生的ACE抑制率和蛋白水解度為考察指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)方式(淺盤固態(tài)發(fā)酵、液體發(fā)酵)、發(fā)酵時(shí)間(0、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h)、培養(yǎng)基初始pH值(4、5、6、7、8、9、10)、培養(yǎng)溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)、基質(zhì)(大豆分離蛋白)含量(2%、5%、10%、15%、20%、25%)等因素進(jìn)行優(yōu)化,尋求最佳的ACE抑制劑的發(fā)酵參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以亮氨酸含量(x)為橫坐標(biāo),吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖1a；以蛋白質(zhì)含量(x)為橫坐標(biāo),吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖1b；以馬尿酸含量(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖1c。

由圖1a可知,亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2.103 9x-0.021 5,相關(guān)系數(shù)R2為0.994 5,表明二者線性關(guān)系良好；由圖1b可知,蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.207 0x-0.004 7,相關(guān)系數(shù)R2為0.998 6,表明二者線性關(guān)系良好；由圖1c可知,馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5×106x+33 468,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3,表明二者線性關(guān)系良好。

圖1 亮氨酸(a)、牛血清蛋白(b)及馬尿酸(c)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of leucine(a),bovine serum albumin(b)and hippuric acid(c)

2.2 菌株篩選

由圖2可知,各個(gè)菌株在相同條件下,所產(chǎn)生的多肽含量差異明顯,因?yàn)椴煌暝谝缘鞍诪榈孜飼r(shí),所產(chǎn)生的蛋白酶能力、性質(zhì)不同,導(dǎo)致所生成的產(chǎn)物的能力不一。其中米曲霉KL、枯草芽孢桿菌BS90、米曲霉1、米曲霉2、米曲霉3都能產(chǎn)生超過0.5 g/L的多肽,分析可能是因?yàn)檫@些菌株都主要以產(chǎn)生蛋白酶為主,而毛霉和黑曲霉是以產(chǎn)淀粉酶或糖化酶為主,所以生成的多肽含量少于前者。理論上講,多肽含量高,所具有能夠抑制ACE活性的潛在的多肽也可能相對(duì)較多［13-14］,而從HPLC測(cè)定ACE抑制率的結(jié)果來看,米曲霉KL、枯草芽孢桿菌BS90、米曲霉1、2發(fā)酵液能夠抑制ACE活性50%以上,其中,枯草芽孢桿菌BS90的抑制率最高,能夠達(dá)到64.2%。且相對(duì)于真菌,芽孢桿菌在抗逆性、生長(zhǎng)周期上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此,以枯草芽孢桿菌BS90作為下一步實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。

圖2 不同菌株發(fā)酵液中的多肽含量及對(duì)ACE的抑制率的影響Fig.2 Effects of polypeptide contents in fermentation broth of different strains on ACE inhibition rate

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵方式的影響

將枯草芽孢桿菌BS90活化后,分別接種在液體發(fā)酵培養(yǎng)基和淺盤固態(tài)培養(yǎng)基中,液體培養(yǎng)條件為37℃、140r/min、培養(yǎng)48 h,淺盤培養(yǎng)方式為37℃靜置培養(yǎng)至出現(xiàn)基質(zhì)拉絲狀態(tài),不同培養(yǎng)方式對(duì)枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 不同培養(yǎng)方式對(duì)枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影響Fig.3 Effects of different culture methods on protein hydrolysis degree and ACE inhibition rate of B.subtilis BS90 fermentation broth

由圖3可知,對(duì)枯草芽孢桿菌BS90而言,液體發(fā)酵條件下,蛋白的水解度19.6%,ACE抑制率68.42%都明顯好于淺盤固態(tài)發(fā)酵的8.3%和21.15%。分析可能是因?yàn)閷?duì)細(xì)菌而言,液體培養(yǎng)更有利于氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞,所產(chǎn)生的蛋白酶能夠更有效的跟底物結(jié)合,而在固體狀態(tài)下,底層基質(zhì)的通氧及物質(zhì)的傳輸都存在空間上的阻礙,所以發(fā)酵效率比較低,基質(zhì)分解不完全。因此,液體發(fā)酵條件下更有利于蛋白的水解及ACE抑制率的提高。

2.3.2 培養(yǎng)時(shí)間的影響

不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度,ACE抑制率及OD600nm值的影響結(jié)果見圖4。

由圖4可知,菌體在4 h后進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,16 h到達(dá)第一個(gè)生長(zhǎng)高峰(OD600nm=1.49),在此階段,菌體以消耗快速碳源為主,蛋白水解度(DH=5.9%)及發(fā)酵液中ACE抑制率(13.6%)稍有升高,但變化不明顯。隨著菌體的生長(zhǎng),菌體開始分泌蛋白酶作用于蛋白基質(zhì),基質(zhì)開始慢慢分解,到24 h后出現(xiàn)一個(gè)快速分解期,這是因?yàn)榫w在培養(yǎng)24 h,產(chǎn)酶量增加,同時(shí)分解所產(chǎn)生的營養(yǎng)用于菌體的繼續(xù)生長(zhǎng),出現(xiàn)了菌體OD600nm第二個(gè)快速增長(zhǎng)期,而此時(shí)DH和ACE抑制率也開始快速增加。在40 h時(shí),抑制率達(dá)到最大(72.1%),而后快速降低,這可能是因?yàn)樵诘鞍酌傅淖饔孟?具有抑制率的多肽在逐漸被降解,多肽產(chǎn)生量小于降解量。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度、ACE抑制率及OD600 nm值的影響Fig.4 Effects of different culture time on protein hydrolysis degree,ACE inhibition rate and OD600 nm of B.subtilis BS90 fermentation broth

在整個(gè)發(fā)酵過程中,ACE抑制肽的活性隨著蛋白基質(zhì)的分解一直處于動(dòng)態(tài)變化中,在前期隨著蛋白被水解成各個(gè)分量的多肽,ACE抑制率會(huì)因多肽的積累而升高［15］,但隨著水解的進(jìn)行,具有ACE抑制率的多肽在蛋白酶的作用下繼續(xù)水解而失去了ACE的抑制率。所以,對(duì)于水解程度的掌握是ACE抑制肽高效率生產(chǎn)的關(guān)鍵。因此,最佳發(fā)酵時(shí)間為40 h。

2.3.3 發(fā)酵液初始pH值的影響

不同發(fā)酵液初始pH值對(duì)枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 不同初始pH對(duì)枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影響Fig.5 Effects of different initial pH on protein hydrolysis degree and ACE inhibition rate of B.subtilis BS90 fermentation broth

由圖5可知,枯草芽孢桿菌BS90具有較強(qiáng)的pH耐受性,在初始pH值為4.0～10.0范圍內(nèi)都能夠產(chǎn)生蛋白酶,分解底物生成具有ACE抑制率的多肽,但總體趨勢(shì)上,枯草芽孢桿菌BS90喜偏堿性,分析可能是因?yàn)樗a(chǎn)生的蛋白酶屬于堿性蛋白酶,在弱堿性條件下活性最高［16］。當(dāng)初始pH值為9.0時(shí),所產(chǎn)生的抑制肽活性最高。因此,最佳的初始pH值為9.0。

2.3.4 培養(yǎng)溫度的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)枯草孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知,在30～40℃培養(yǎng)時(shí),發(fā)酵液中ACE抑制率可達(dá)近80%,且在此溫度范圍內(nèi),培養(yǎng)溫度對(duì)蛋白水解度與ACE抑制劑的影響不明顯,都可作為枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵產(chǎn)ACE抑制肽的溫度范圍,但ACE抑制率最高(79.9%)出現(xiàn)在35℃,因此推薦35℃為本試驗(yàn)最佳的培養(yǎng)溫度。

圖6 不同培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影響Fig.6 Effects of different culture temperatures on protein hydrolysis degree and ACE inhibition rate of B.subtilis BS90 fermentation broth

2.3.5 不同基質(zhì)含量的影響

理論上,不同的基質(zhì)含量直接決定了蛋白酶作用底物的多少,即在一定含量范圍內(nèi),底物越多,所產(chǎn)生的具有ACE抑制率的多肽越多,但效率并不是最高的,實(shí)際上,底物過少,水解效率高,但由于菌體生長(zhǎng)所需,所產(chǎn)生的多肽很快被消耗,ACE抑制率肽也不能被留存下來,所以,合適的蛋白基質(zhì)含量不但關(guān)系到菌體的生長(zhǎng),而且還關(guān)系到ACE抑制劑產(chǎn)生的效率。不同基質(zhì)含量對(duì)枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影響結(jié)果見圖7。

由圖7可知,2%的基質(zhì)(大豆分離蛋白)含量,蛋白水解度高,但ACE抑制率低。當(dāng)基質(zhì)含量為5%時(shí),無論是DH(89.1%)還是ACE抑制率(81.8%)都具有較好的效果。當(dāng)基質(zhì)含量≥10%,ACE抑制劑的活性下降不明顯,但DH卻明顯降低。因此,選擇基質(zhì)含量5%最合適。

圖7 不同基質(zhì)濃度對(duì)枯草芽孢桿菌BS90發(fā)酵液蛋白水解度和ACE抑制率的影響Fig.7 Effects of different substrate concentration on protein hydrolysis degree and ACE inhibition rate of B.subtilis BS90 fermentation broth

3 結(jié)論

本研究通過發(fā)酵法篩選獲得了一株高產(chǎn)ACE抑制肽的枯草芽孢桿菌BS90,通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化了枯草芽孢桿菌BS90液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)ACE抑制肽的最佳條件,即大豆蛋白含量5%,初始pH值9.0,培養(yǎng)溫度35℃,培養(yǎng)時(shí)間40 h時(shí)。在此優(yōu)化條件下,DH達(dá)到89.1%,ACE抑制率達(dá)81.8%,較優(yōu)化前分別提高69.5%、13.4%。

就微生物發(fā)酵法生產(chǎn)ACE抑制肽來講,雖然原料充足,但由于ACE抑制肽本身就是一類多肽,分子質(zhì)量大小不一,保守氨基酸組成、結(jié)構(gòu)和抑制效應(yīng)還未完全闡明［17］,這些對(duì)后期的分離純化都會(huì)有一定的障礙,所以工業(yè)化應(yīng)用還需要更加深入的研究。

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