張 江，關(guān)靜姝，趙裕川, 張 琳，劉揚科

（1. 林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司，農(nóng)業(yè)部飼用抗生素替代技術(shù)重點實驗室，河南林州 456550；2.北京中農(nóng)穎泰生物技術(shù)有限公司，北京 100193；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070）

隨著抗生素引起的藥物殘留及耐藥性問題的產(chǎn)生，尋找飼用抗生素替代品成為畜牧行業(yè)研究熱點。目前，抗菌肽（Antibacterial Peptides）、微生態(tài)、植物提取物以及酸化劑等作為潛在的抗生素替代品被廣泛應(yīng)用?？咕氖巧矬w產(chǎn)生的一種具有先天性免疫作用小分子活性多肽，由于其獨特的破膜殺菌機(jī)制，不易產(chǎn)生耐藥性，同時可提高機(jī)體的免疫能力[1]?？咕牟粌H具有廣譜的抗菌活性，還具有抗病毒、真菌以及原蟲的活性[2]。大量試驗研究結(jié)果顯示，抗菌肽可替代抗生素類飼料添加劑在豬、雞、鴨等動物上的使用[3-5]。

20世紀(jì)90年代初，腸桿菌肽由Raul等[6]在腸道微生物中發(fā)現(xiàn)，隨后一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)其具有抑制大腸桿菌和沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的作用[7]。腸桿菌肽是由21個氨基酸組成的套索肽，分子量為2.09 ku，性質(zhì)非常穩(wěn)定，對胃蛋白酶、胰蛋白酶以及高溫環(huán)境有良好耐受性[8]。目前，該抗菌肽在國內(nèi)由國家飼料工程技術(shù)研究中心實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，中農(nóng)穎泰集團(tuán)生產(chǎn)并進(jìn)行市場推廣。此外，土霉素鈣作為四環(huán)素類抗生素，具有抗菌抗腹瀉促進(jìn)生長的作用，廣泛應(yīng)用于教保料、小豬料以及部分雛雞料。本試驗通過體外試驗比較腸桿菌肽（商品名穎泰二號）和土霉素鈣對10株大腸桿菌和10株沙門氏菌的抑菌效果，以及腸桿菌肽在人工胃液和腸液中的穩(wěn)定性，旨在為腸桿菌肽替代抗生素應(yīng)用于生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實際指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌制劑與樣品 大腸桿菌、沙門氏菌等來源見表1。除標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922外，其他由不同機(jī)構(gòu)分離于養(yǎng)殖場。

穎泰二號（林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司提供）中腸桿菌肽含量為0.5%，其他成分為主要載體玉米芯粉、麥芽糊精。20%土霉素鈣（購自河北圣雪大成制藥有限責(zé)任公司）。

1.1.2 主要試劑 YPD、MRS肉湯、MRS瓊脂、營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物科技有限公司）、雙歧桿菌BS培養(yǎng)基（青島海博生物）、胰蛋白胨、酵母粉、NaCl 、瓊脂粉、無水乙醇、NaOH等。

1.2 試劑配置 抗菌肽前處理液的配置：量取400 mL超純水，加入58.44 g NaCl搖晃至溶解，然后向其中加入500 mL無水乙醇充分混勻，再向溶液中加超純水定容至1 000 mL，并用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5～8.0，密封保存。

LB液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)大腸桿菌和沙門氏菌）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加入1 000 mL ddH2O完全溶解后，調(diào)pH至（7.3±0.1），121℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基加入1%～2%的瓊脂。

1.3 指示菌菌懸液的準(zhǔn)備

1.3.1 指示菌的復(fù)蘇和培養(yǎng) 大腸桿菌或沙門氏菌：菌株平板劃線于LB瓊脂，37℃培養(yǎng)20 h；挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基，置37℃振蕩培養(yǎng)12～14 h，然后轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h待用。

乳酸菌和雙歧桿菌：菌株劃線于MRS瓊脂（乳酸菌）和BS瓊脂（雙歧桿菌），37℃厭氧培養(yǎng)20 h；挑取單菌落于相應(yīng)肉湯液體培養(yǎng)基，置37℃厭氧培養(yǎng)12～14 h，然后轉(zhuǎn)接到相應(yīng)培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h待用。

芽孢菌方法同大腸桿菌，所用培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂。釀酒酵母方法同大腸桿菌，所用培養(yǎng)基為YPD，培養(yǎng)溫度為30℃。

1.3.2 指示菌稀釋 指示菌用生理鹽水將菌液稀釋至OD600吸光值為0.1（約108CFU/mL），備用。

1.4 待測樣品處理

1.4.1 抗菌肽產(chǎn)品的前處理 先配制產(chǎn)品原液，稱取5.12 g樣品定容于50 mL前處理液，制成102 400 μg/mL的樣品液，震蕩混合均勻。吸取適量上述溶液于具塞滅菌離心管中，5 000 r/min離心2 min，取上清液于0.22 μm濾膜過濾，取過濾液，將前面過濾的1 mL左右液體棄去，收集后面過濾的液體，備用。

1.4.2 土霉素鈣樣品前處理 精確稱量5.12 g，加2%草酸溶液適量使pH為1.5～2.0，充分?jǐn)嚢?，暗處放?5 min后加滅菌水定容50 mL。

1.5 抑菌試驗 ①取無菌試管（15 mm×150 mm）9支，排成一排，將原液樣品按照不同倍數(shù)依次稀釋為10 240、5 120、2 048、1 024、512、256、12 840 μg/mL。第8管為無樣品管（濃度為0），第9管為對照，不加藥物和菌。②將培養(yǎng)好的指示菌調(diào)節(jié)到OD600=0.1后，用滅菌的肉湯按照1:100稀釋指示菌，然后在1～8管內(nèi)加入等體積上述含菌肉湯，使每管最終菌液濃度約為106CFU/mL。此時，1～8管的濃度為5 120、2 560、1 024、512、256、128、64、0 μg/mL，第 9 管為無藥物無菌試管?；靹蚝笈囵B(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，肉湯澄清的試管該藥物濃度對此指示菌的最低抑菌濃度（MIC）。③乳酸菌和雙歧桿菌在厭氧手套箱中進(jìn)行操作。

1.6 人工胃液和人工腸液的配置 人工胃液按照《中華人民共和國藥典》（2015年版Ⅳ部）配制（取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1 000 mL）。不同時間點取樣加NaOH 中和pH至7，85℃處理5 min滅活蛋白酶。人工腸液按照《中華人民共和國藥典》（2015年版Ⅳ部）配制（取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL）不同時間點取樣，85℃處理5 min滅活蛋白酶。MIC測定方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸桿菌肽與土霉素鈣的抑菌效果分析 如表1所示，20%土霉素鈣和0.5%腸桿菌肽對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922都有很強(qiáng)的抑菌效果；0.5%腸桿菌肽對大部分野生型大腸桿菌菌株抑菌效果較好，MIC在64～256 μg/mL，20%土霉素鈣對大部分野生型菌株MIC高于0.5%腸桿菌肽。這說明0.5%腸桿菌肽對大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于20%土霉素鈣。

如表2所示，土霉素鈣對CVCC50094表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌效果，但對野生型沙門氏菌，0.5%腸桿菌肽對大部分沙門氏菌的MIC小于20%土霉素鈣，效果較好，土霉素鈣對大部分沙門氏菌菌株沒有抑菌效果或效果較弱。這說明0.5%腸桿菌肽對沙門氏菌的抑菌效果優(yōu)于20%土霉素鈣。

2.2 腸桿菌肽在人工胃液、腸液及熱處理不同時間對MIC的影響 如表3所示，腸桿菌肽在人工胃液和人工腸液中處理1、2、4 h，抑菌活性不變，MIC仍然為128 μg/mL。85℃熱處理腸桿菌肽1 h和2 h時，抑菌活性不變，4 h MIC為256 μg/mL，表明腸桿菌肽對胃酸、腸液以及高溫條件均表現(xiàn)出很強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.3 腸桿菌肽與土霉素鈣對益生菌的抑制作用 如表4所示，腸桿菌肽對10株益生菌均無抑菌作用，除釀酒酵母菌株外，土霉素鈣對其他益生菌菌株均有抑菌作用。

表1 0.5%腸桿菌肽與20%土霉素鈣對不同大腸桿菌菌株的抑菌效果 μg/mL

表2 0.5%腸桿菌肽和20%土霉素鈣對不同沙門氏菌的抑菌試驗結(jié)果 μg/mL

表3 人工胃液、腸液處理腸桿菌肽不同時間對ATCC25922MIC的影響 μg/mL

3 討 論

作為評價抗菌物質(zhì)的重要指標(biāo)，MIC能夠客觀地評價抗菌劑的體外抗菌效果，從而為進(jìn)一步的體內(nèi)試驗提供理論依據(jù)。許多研究表明，腸桿菌肽對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌和沙門氏菌有很強(qiáng)的殺滅作用。目前認(rèn)為，腸桿菌肽通過2種方式抑制病原微生物：一方面通過抑制RNA聚合酶活性來干擾細(xì)菌mRNA以及蛋白質(zhì)的合成。其依據(jù)：①RNA聚合酶的β亞基發(fā)生突變后，其對腸桿菌肽產(chǎn)生耐受性，從而確定其靶位點為RNA聚合酶[9]。②通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)現(xiàn)，腸桿菌肽與RNA聚合酶次級通道的結(jié)合會阻礙核苷酸進(jìn)入酶的活性位點，從而抑制mRNA的形成和進(jìn)一步蛋白質(zhì)的合成[10]。另一方面腸桿菌肽通過改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)菌細(xì)胞膜破碎，內(nèi)容物外滲，病原細(xì)菌死亡。其試驗依據(jù)如下：沙門氏菌中加入腸桿菌肽后，其生長受到明顯抑制，活菌數(shù)量下降，而當(dāng)沙門氏菌從培養(yǎng)介質(zhì)中移出后，清洗然后在培養(yǎng)基中重懸，細(xì)胞活力沒有恢復(fù)，說明沙門氏菌受到結(jié)構(gòu)性的破壞；采用熒光探針DiSC3研究沙門氏菌膜電勢，發(fā)現(xiàn)沙門氏菌中加入腸桿菌肽后，膜電勢明顯下降，說明其通透性增加[11]。以上表明，腸桿菌肽首先通過改變膜通透性使細(xì)胞膜破損，隨后進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部與RNA聚合酶結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而使細(xì)菌破裂死亡。

表4 腸桿菌肽和20%土霉素鈣對不同益生菌的抑菌試驗結(jié)果 μg/mL

腸桿菌肽是第一個被發(fā)現(xiàn)的索套結(jié)構(gòu)的多肽分子，而套索肽是目前抗菌肽領(lǐng)域研究的一大熱點，其抑菌機(jī)制與傳統(tǒng)的抗生素有所不同，不易產(chǎn)生耐藥性，其作為新藥開發(fā)來對抗細(xì)菌感染的潛力巨大[12-13]。Lopez等[14]采用體內(nèi)和體外評價腸桿菌肽對沙門氏菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)腸桿菌肽體外經(jīng)過24 h在全血、血漿以及血清中保持完全活性，且不會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象；與對照組比較，處理組會使全血、同源的血漿和血清中沙門氏菌的數(shù)量顯著降低；使用3 mg/kg腸桿菌進(jìn)行治療的小鼠，其肝臟和脾臟中沙門氏菌活菌數(shù)顯著降低了2～3個數(shù)量級，且用24 h給藥和6 d給藥方式結(jié)果一致。以上說明腸桿菌肽能在體外和體內(nèi)殺滅沙門氏菌。Sophie等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌肽能抑制腹瀉型大腸桿菌O157，對于治療大腸桿菌引起的腹瀉具有一定的意義。

本試驗發(fā)現(xiàn)，針對標(biāo)準(zhǔn)菌株，土霉素鈣和腸桿菌肽都表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌作用，但是針對近期分離的野生型菌株，土霉素鈣抑菌效果較差，這可能與四環(huán)素類抗生素在動物生產(chǎn)中的大量使用造成耐藥性的產(chǎn)生有關(guān)。根據(jù)農(nóng)業(yè)部公告第2328號，土霉素鈣在飼料中的添加量由以前的55 mg/kg增加到400 mg/kg，即20%土霉素鈣可添加2 kg/t。藥敏試驗驗證，目前土霉素鈣確實具有很高的耐藥性，需要加大劑量才能起到效果，這與農(nóng)業(yè)部公告的推薦使用劑量一致。同時發(fā)現(xiàn)，抗菌肽腸桿菌肽針對大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果較好，其MIC遠(yuǎn)低于土霉素鈣，按照其體外抑菌試驗，穎泰二號理論推薦劑量在64～256 g/t，即添加量小，成本較低。通過人工胃液、腸液及熱處理，腸桿菌肽不影響其活性，故其在腸道中性質(zhì)穩(wěn)定。不同于廣譜性抗生素土霉素鈣，由于腸桿菌肽只作用于革蘭氏陰性細(xì)菌[7]，故對腸道益生菌如乳酸菌、雙歧桿菌等沒有抑制作用，抗菌肽腸桿菌肽可以作為潛在的抗生素替代品在動物生產(chǎn)中應(yīng)用。

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