孫 宏，李園成，吳逸飛，沈 琦，姚曉紅，湯江武，王 新

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所，浙江杭州 310021）

固態(tài)發(fā)酵飼料是一種利用有益微生物對飼料原料進行固態(tài)發(fā)酵處理，獲得含有活性益生菌、酶、礦物質和多種未知促生長因子等活性組分的高品質生物飼料[1]。單一原料的固態(tài)發(fā)酵飼料（如發(fā)酵豆粕、發(fā)酵棉籽粕、發(fā)酵菜籽粕等）中含有低分子量多肽、寡糖、有機酸（丁酸）等活性物質[2-4]；同時固態(tài)發(fā)酵處理可降解這些飼料原料中的抗營養(yǎng)成分，提高其消化率，從而顯著提高其營養(yǎng)品質[3-4]。動物試驗也證實飼喂固態(tài)發(fā)酵飼料可顯著提高動物的生長性能，改善動物腸道消化功能和健康水平[3]。

近年來，固態(tài)發(fā)酵飼料的研究逐漸轉向對多種混合飼料原料的發(fā)酵處理。釀酒酵母是最為常見的發(fā)酵菌株，其不但富含齊全的營養(yǎng)物質，且經(jīng)酵母菌發(fā)酵過的飼料也具有獨特的色、香、味，飼料適口性得到顯著改善[5-6]。目前，有關采用酵母菌制備固態(tài)發(fā)酵飼料的工藝參數(shù)的報道較少，特別是現(xiàn)有工藝主要通過單因素、正交試驗分析，缺乏對多種發(fā)酵參數(shù)交互作用的評價。本試驗擬以酵母菌為發(fā)酵菌株，對發(fā)酵原料的組成、糖化酶添加量、接種量等參數(shù)進行優(yōu)化，并采用響應面設計確定最佳發(fā)酵工藝，對發(fā)酵后的飼料進行初步營養(yǎng)評價，以期為酵母菌制備固態(tài)發(fā)酵飼料提供合理應用技術參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵原料與菌株 玉米、豆粕和麩皮均購自紹興科盛飼料有限公司。玉米含水率12.2%、粗蛋白含量8.6%；豆粕含水率9.4%、粗蛋白含量47.2%；麩皮含水率10.5%、粗蛋白含量19.3%。發(fā)酵前原料粉碎過40目篩備用。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Yn由浙江省農(nóng)業(yè)科學院植物保護與微生物研究所酶與發(fā)酵工程實驗室選育和保藏。

1.2 試劑及培養(yǎng)基 糖化酶購于北京索萊寶科技有限公司，酶活大于1.0×105U/g；羧芐青霉素、葡萄糖、麥芽糖、硫酸銨、蛋白胨、酵母浸粉和尿素均為市售分析純。釀酒酵母Yn培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、水1 000 mL、自然pH，121℃滅菌30 min；固體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂粉；使用前加入羧芐青霉素，使其最終濃度達100 μg/ mL。

1.3 固態(tài)發(fā)酵飼料的制備

1.3.1 釀酒酵母Yn發(fā)酵種子液的制備 取酵母菌Yn斜面刮取一環(huán)接種于含有20 mL PDA液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，放入30℃ 搖床培養(yǎng)箱中180 r/min培養(yǎng)24 h，制成種子液（平板計數(shù)菌數(shù)為3.1×108CFU/mL），備用。

1.3.2 不同發(fā)酵底物比例對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響發(fā)酵底物為玉米、豆粕和麩皮以不同質量比（4:2:4、5:2:3、6:2 :2、7:2 :1和8:2:0）混合的原料100 g，將上述原料混勻后，裝入500 mL三角瓶中，接種5%（v/w）釀酒酵母Yn后，加水控制料水比至1:0.8（w/w），自然pH，放置于30℃培養(yǎng)36 h。發(fā)酵完畢后，取樣采用涂布平板法測定酵母菌活菌數(shù)（CFU/g，以干質量計），每組3個重復。

1.3.3 不同糖化酶添加量對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響初始發(fā)酵底物為玉米、豆粕和麩皮（質量比為5:2:3）混合的原料100 g，底物混合均勻后加入終濃度分別為0、200、400、600、 800 U/g的糖化酶，其余操作同1.3.2，確定不同糖化酶添加量對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響。

1.3.4 不同接種量對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響 初始發(fā)酵底物為玉米、豆粕和麩皮（質量比為5:2:3）混合的原料100 g，糖化酶的添加量為200 U/g，酵母菌Yn接種量（v/w）分別為3%、5%、8%、10%，其余操作同1.3.2，確定不同接種量對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響。

1.3.5 不同料水比對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響 糖化酶的添加量為200 U/g，接種量為5%（v/w），料水比（w/w）分別為1:0.6、1:0.8、1:1和1:1.2，其余操作同1.3.4，確定不同料水比對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響。

1.3.6 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響 初始發(fā)酵底物為玉米、豆粕和麩皮（質量比為5:2:3）混合的原料100 g，糖化酶添加量為200 U/g，料水比為1:0.8（w/w），分別于 25、28、30、35、37℃ 下恒溫發(fā)酵36 h，其余操作同1.3.4。

1.3.7 響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵條件 根據(jù)單因素試驗結果，選取影響顯著的接種量、料水比以及加酶量進行響應面分析，試驗設計和分析通過Design-Expert.v8.0.6軟件完成，每個因素設置3個編碼水平，以酵母菌Yn在固態(tài)發(fā)酵飼料中的活菌數(shù)為響應值（酵母菌的濃度轉化成對數(shù)），試驗因素水平和編碼見表1。每個處理設置3個重復。

表1試驗因素水平與編碼表

1.3.8 酵母菌Yn制備固態(tài)發(fā)酵飼料的最適條件驗證采用響應面試驗所獲得的最佳發(fā)酵條件進行發(fā)酵飼料制備。為了避免水分對菌數(shù)計數(shù)的影響，發(fā)酵后一部分取樣直接采用涂布平板法測定酵母菌活菌數(shù)（CFU/g，以干質量計）[6]，另一部分樣品放置于50℃條件下烘干，粉碎過60目篩待測飼料營養(yǎng)成分。

1.4 指標測定方法 水分、粗蛋白、粗脂肪、總磷、低分子肽、總酚和維生素B2含量的檢測均參照文獻[7]的報道。

1.5 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析（ANOVA），組間多重比較采用Duncan′s分析，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵底物比例對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響由圖1可見，隨著發(fā)酵底物中玉米添加量的增加和麩皮添加量的減少，酵母的活菌數(shù)先升后降，在玉米、豆粕和麩皮質量比為5:2:3時，酵母活菌數(shù)最高，達到6.5×109CFU/g（干重）。當玉米添加量繼續(xù)增加時，酵母活菌數(shù)降低。因此，玉米、豆粕和麩皮的適宜質量比為5:2:3。

圖1 不同發(fā)酵底物比例對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響

2.2 不同糖化酶添加量對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響添加糖化酶可將玉米中的淀粉轉化為糖類物質，供酵母菌體的生長和繁殖。由圖2可知，添加糖化酶對酵母菌數(shù)提高的效果明顯，當添加量達200 U/g時菌數(shù)最高，為8.8×109CFU/g，之后效果趨于平緩。考慮到成本因素，選取200 U/g為糖化酶的最適添加量。

圖 2 不同糖化酶添加量對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響

2.3 不同接種量對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響 由圖3所示，接種量為5%時，酵母菌數(shù)最高，達到1.15×1010CFU/g。因此選取酵母菌Yn的最適接種量為5%。

2.4 不同料水比對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響 由圖4可知，料水比為1:0.8時，酵母菌數(shù)最高，為1.18×1010CFU/g。同時，不同料水比對固態(tài)發(fā)酵后酵母菌活菌數(shù)的影響較大，在本試驗條件下的最適料水比為1:0.8。

圖3 不同接種量對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響

2.5 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響 由圖5所示，隨著發(fā)酵溫度增加，酵母菌數(shù)也升高，在30℃時酵母菌數(shù)最高，達到9.81×109CFU/g。之后隨著溫度增加，菌數(shù)逐漸下降，因而選取30℃為最適發(fā)酵溫度。

2.6 響應面模型的建立與顯著性分析 為了獲得更為準確的酵母菌制備發(fā)酵活性飼料的參數(shù)，結合上述單因素試驗結果，選取了接種量、加酶量和料水比進行Box-Behnken響應面設計，以活菌數(shù)為響應值進行尋優(yōu)，結果如表2所示。

圖4 不同料水比對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響

圖5 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響

由多元線性和二項式擬合得到各因素對應酵母活菌數(shù)的數(shù)學模型：lnY=4.8-0.017A+0.071B-0.055C+8.894E-004AB+9.789E-003AC-0.059BC-0.011 A2-0.2B2-0.24C2，決定系數(shù)R2= 0.949 6。由方差分析可知（表3），模型P值為0.000 9，失擬項P值為0.123 4，說明此模型數(shù)據(jù)可靠，回歸方程可滿足對結果的分析和預測。對各因素的顯著性分析可知，加酶量、料水比對固態(tài)發(fā)酵后酵母菌數(shù)的影響顯著（P＜0.05）。

由圖6可知，在不同接種量、加酶量和料水比下，酵母活菌數(shù)都出現(xiàn)先增后減的趨勢。通過軟件獲得最佳條件：接種量1.4%、加酶量220 U/g、料水比1:0.8，理論活菌數(shù)可達到1.24×1010CFU/g（干重）。

2.7 酵母菌Yn制備固態(tài)發(fā)酵飼料的最適條件驗證 由表4可知，原料經(jīng)過酵母菌固態(tài)發(fā)酵后，酵母活菌數(shù)折算干重達到1.30×1010CFU/g，與響應面預測值相比誤差僅為4.83%。同時，粗蛋白、總酚、維生素B2和低分子量肽含量在發(fā)酵后顯著提高（P＜0.05），而粗脂肪含量則顯著降低（P＜0.05）。發(fā)酵處理對物料中總磷的含量沒有影響（P＞0.05）。

表2 發(fā)酵條件的響應面優(yōu)化結果

3 討 論

圖6 接種量、加酶量和料水比的響應面圖與等高線圖

表3 響應面模型的方差分析

表4 最優(yōu)條件下發(fā)酵前后飼料中營養(yǎng)成分的含量分析

3.1 不同發(fā)酵底物與發(fā)酵條件對發(fā)酵飼料中酵母菌數(shù)的影響 研究表明，固態(tài)發(fā)酵的程度與發(fā)酵底料中的可利用碳源含量直接相關[8]。玉米的含糖量顯著高于麩皮，因而初期隨著玉米添加量的提高，菌數(shù)呈不斷增加的趨勢。但粉碎的玉米在發(fā)酵過程中黏度較大，同時隨著玉米的增加麩皮的比例會有所下降，從而減少了物料的通氣性，導致本試驗中酵母菌數(shù)因玉米含量過高而下降。趙國群等[9]研究表明，固態(tài)發(fā)酵中添加麩皮可降低培養(yǎng)基的含水率，增加物料氧氣供給，而且改善培養(yǎng)基的營養(yǎng)。本研究結果表明，發(fā)酵基質中玉米、豆粕和麩皮的最佳質量配比為5:2:3。另一方面，糖化酶的加入可提高物料中可溶性糖類的含量，從而提高發(fā)酵基質中碳源的含量。本研究顯示，最適宜的糖化酶添加量為200 U/g，該結果與潘麗娜等[6]添加300 U/g糖化酶用于酵母菌發(fā)酵糖渣的結果相似。同時，本研究結果表明酵母菌合適的添加量為5%，有研究表明過高的接種量可能會導致微生物的生長處于競爭狀態(tài)，不利于菌體生長；同時接種量過小會導致固態(tài)發(fā)酵時啟動較慢，增加污染雜菌的幾率，也不利于酵母菌生長[10]。料水比是固態(tài)發(fā)酵中的一個重要因素，通過影響菌種與發(fā)酵基質的附著來影響發(fā)酵的效果[8]。一般認為酵母菌固態(tài)發(fā)酵含水率在50%～60%為宜[11]，本研究結果與此一致。本研究結果還顯示，較為適宜的發(fā)酵溫度為30℃，而有研究報道酵母菌固態(tài)發(fā)酵秸稈、淀粉和豆粕為主的基質時最佳溫度為28℃[12]，這可能與發(fā)酵底料中營養(yǎng)成分的不同有關。

3.2 最佳發(fā)酵條件的確定 響應面優(yōu)化所獲得的回歸方程精度較正交優(yōu)化手段相比，由于考慮了不同因素間的相互作用，因而精度更高[10,13]。黎繼烈等[10]通過響應面設計優(yōu)化了油茶粕固態(tài)發(fā)酵枯草芽孢桿菌的發(fā)酵條件后發(fā)現(xiàn)，活菌數(shù)較優(yōu)化前可提高5倍，達到2.04×1010CFU/g（干重）。施俊風等[14]采用響應面法獲得酵母液態(tài)發(fā)酵的最佳條件為溫度26℃、接種量1.2%，驗證所測濃度為2.56×109CFU/mL。以上結果提示，不同的發(fā)酵方式可能對酵母菌發(fā)酵后的數(shù)量具有直接影響。潘麗娜等[6]在黃酒糟固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)酵母菌的研究中，通過正交試驗對酵母菌數(shù)進行優(yōu)化，獲得最高菌數(shù)為4.0×109CFU/g（干重）。而本試驗通過優(yōu)化獲得的最大酵母菌數(shù)達到1.30×1010CFU/g（干重），且與響應面預測最大值較為接近，表明該優(yōu)化手段在本試驗中科學可行。

3.3 酵母菌固態(tài)發(fā)酵后飼料營養(yǎng)品質的評價 本試驗結果顯示，采用酵母菌固態(tài)發(fā)酵后，飼料組分中粗蛋白、低分子量肽、總酚和維生素B2的含量均有顯著提高，表明通過酵母菌發(fā)酵可改善飼料的營養(yǎng)組成。一般認為，物料中粗蛋白含量提高可能與發(fā)酵過程中微生物優(yōu)先利用糖分，從而使發(fā)酵后物料損耗，總質量減少而間接提高其他營養(yǎng)組分有關[2]，如Sharawy等[3]發(fā)現(xiàn)，采用釀酒酵母發(fā)酵豆粕后可顯著提高發(fā)酵豆粕的粗蛋白含量。低分子量肽含量的提升是由于微生物在發(fā)酵過程中分泌的蛋白酶對物料中的蛋白進行降解所致[5]。張連忠[11]研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌發(fā)酵玉米秸稈等農(nóng)副產(chǎn)品可顯著提高發(fā)酵后物料的粗蛋白含量至10.5%，同時酵母在發(fā)酵過程中能夠將反應物中小分子肽含量提高222.86%。Chi等[5]同樣在采用釀酒酵母發(fā)酵豆粕后發(fā)現(xiàn)，低于5 ku的低分子肽含量顯著提高。總酚和維生素B2是2類生物活性物質，這些物質含量的提高可能與酵母在固態(tài)發(fā)酵過程中分泌氨基酸和多種生物活性物質有關[15]，但具體機制仍需進一步研究。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)飼料中的粗脂肪含量在酵母菌發(fā)酵后顯著降低，這與吳逸飛等[9]的結果一致，可能是微生物利用了物料中的脂肪進行生長。

4 結 論

本試驗條件下，確定了釀酒酵母Yn制備發(fā)酵飼料的合適參數(shù)：玉米、豆粕和麩皮質量比為5:2:3、接種量1.4%、加酶量220 U/g、料水比為1:0.8，發(fā)酵溫度30℃。在此條件下，酵母活菌數(shù)折算干重達到1.30×1010CFU/g，粗蛋白、總酚、維生素B2和低分子量肽含量在發(fā)酵后顯著提高，而粗脂肪含量則顯著降低。因此，本試驗獲得的發(fā)酵參數(shù)在飼料發(fā)酵方面具有較好的應用前景。

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