高 山， 梁 建， 李永仁， 馬云坤， 郭永軍

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)許多弧菌可引起人類和水產(chǎn)動(dòng)物疾病，創(chuàng)傷弧菌為革蘭氏陰性的嗜鹽細(xì)菌，主要生長(zhǎng)于近?？谒小Ⅳ~(yú)類及貝類等體內(nèi)[1]，是人畜共患的條件致病菌。鑒于弧菌病的危害性，尋找病原弧菌的主要防治和治療方法迫在眉睫。

創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)，又稱為海洋弧菌，可從牡蠣等海產(chǎn)品中分離得到，是一種棲息于海洋中的細(xì)菌。主要通過(guò)傷口接觸海水造成感染，也可經(jīng)口感染，導(dǎo)致菌血癥或敗血癥。將傷口暴露在含有該菌的海水中，創(chuàng)傷弧菌會(huì)在傷口上繁殖，可能引發(fā)潰爛，甚至導(dǎo)致組織壞死。若人食用了遭其污染的海鮮，也有患腸胃炎的可能。在2003年12月，中國(guó)臺(tái)灣衛(wèi)生研究院主導(dǎo)的基因體定序團(tuán)隊(duì)，完成了創(chuàng)傷弧菌的基因體定序與分析工作。

各種抗生素在規(guī)?；瘎?dòng)物養(yǎng)殖中用于防病治病、提高飼料利用率和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。使用后抗生素通常以藥物原形隨糞尿排出[2-3]。研究表明，規(guī)?；B(yǎng)殖動(dòng)物糞便普遍富含抗生素[4]，本試驗(yàn)采用鹽酸土霉素、四環(huán)素、金霉素3種四環(huán)素類抗生素作用于創(chuàng)傷弧菌，以檢測(cè)比較該類藥物對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果。

鹽酸土霉素，別稱地霉素、氧四環(huán)素為廣譜抑菌劑，本品在水中易溶，在乙醇中略溶，在三氯甲烷或乙醚中不溶。

四環(huán)素，該鹽酸鹽為黃色結(jié)晶性粉末；無(wú)臭，味苦；有引濕性；遇光色漸變深，在堿性溶液中易破壞失效。在水中溶解，在乙醇中略溶，在三氯甲烷或乙醚中不溶。該品為廣譜抑菌劑，高濃度時(shí)具殺菌作用。

金霉素(chlortetracyline，簡(jiǎn)稱CTC)是四環(huán)素類廣譜抗生素的一種。鹽酸金霉素在20世紀(jì)40年代被發(fā)現(xiàn)并展現(xiàn)出良好的抗菌性質(zhì)。由于鹽酸金霉素具有抗菌范圍較廣、療效顯著、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)[4]，因此在中國(guó)被廣泛用于畜禽、水生生物、藥物添加劑等產(chǎn)業(yè)，并能有效地預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，防治動(dòng)物腸道感染等，由此帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益[5]。同時(shí)，由于鹽酸金霉素的廣泛使用甚至濫用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的增加等一系列問(wèn)題，給人類疾病控制和環(huán)境控制帶來(lái)難題[6]。另外，食用含鹽酸金霉素殘留的動(dòng)物食品及其制品后，多數(shù)會(huì)引起胃、腸、肝臟的損害與牙齒的染色以及過(guò)敏反應(yīng)、二重感染、生殖毒性[7]等，嚴(yán)重時(shí)甚至還會(huì)出現(xiàn)中毒死亡現(xiàn)象。

四環(huán)素類抗生素具有良好的抗菌效果，但是對(duì)于水產(chǎn)致病菌的抗菌效果報(bào)道較少， 本試驗(yàn)通過(guò)3種四環(huán)素類藥物對(duì)

海水創(chuàng)傷弧菌抗菌效果的觀察測(cè)定，找出該3種藥對(duì)創(chuàng)傷弧菌的最低抑菌濃度和殺菌濃度，為養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中創(chuàng)傷弧菌的預(yù)防和治療提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海水創(chuàng)傷弧菌由天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 陳海水的配制 陳海水的配制：稱取28.571 4 g海水晶，用量筒稱取1 000 mL蒸餾水，將海水晶溶于燒杯中的 1 000 mL蒸餾水中，即為1 000 mL的陳海水。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 海水固體培養(yǎng)基的制備：稱取蛋白胨5 g、酵母膏1 g、磷酸鐵0.01 g、瓊脂粉16 g，置于燒杯中，量取1 000 mL陳海水，倒入燒杯中，攪勻，調(diào)節(jié)pH值至7.6～7.8，均勻攪拌后，在電爐上加熱至完全溶解，分4份倒入4個(gè)三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋滅菌(30 min，121 ℃)，取出后在無(wú)菌條件下倒入平板備用。

海水液體培養(yǎng)基的制備：稱取蛋白胨5 g、酵母膏1 g、磷酸鐵0.01 g，置于燒杯中，稱取1 000 mL陳海水，倒入燒杯中，攪勻，調(diào)節(jié)pH值至7.6～7.8，均勻攪拌后，在電爐上加熱至完全溶解，分4份倒入4個(gè)三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋滅菌(30 min，121 ℃)，取出后在無(wú)菌條件下倒入試管中備用。

1.2.3 菌懸液的制備 采用平板劃線法，將待測(cè)菌接種于海水固體培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)12 h后，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)將菌落刮入盛有無(wú)菌液體培養(yǎng)基的試管中備用。

1.2.4 菌液濃度的測(cè)定 在一定的范圍內(nèi)濃度和吸光度呈線性關(guān)系。以分光光度計(jì)為檢測(cè)工具，將事先培養(yǎng)好的菌種用液體培養(yǎng)基溶解，將上層菌液倒入試管中，使其溶解搖勻便于測(cè)量。先配制一定濃度的細(xì)菌母液，另取15支試管依次加入9 mL液體培養(yǎng)基，利用10倍稀釋法稀釋。再將不同濃度的菌液在波長(zhǎng)為600 nm條件下測(cè)量，記錄D600 nm，將第13、14、15支試管進(jìn)行涂布后置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況并記錄，制得菌液濃度與D600 nm的關(guān)系曲線(圖1)。

1.2.5 3種水產(chǎn)抗菌藥物母液的配制 分別稱取鹽酸土霉素、金霉素和四環(huán)素各0.8 g，用50 mL容量瓶定容，則儲(chǔ)備液濃度均為16 000 mg/L，4 ℃儲(chǔ)存。

1.2.6 3種抗菌藥的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bacteridal concentration，MBC)的測(cè)定 采用濃度稀釋法測(cè)定MIC、MBC[8]。試驗(yàn)設(shè)置3組平行，并設(shè)有2個(gè)對(duì)照組(即陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照)。每個(gè)濃度放入同一液體培養(yǎng)基5 mL，再加入相同濃度的細(xì)菌懸浮液各1 mL，后加入藥物儲(chǔ)備液，最后用蒸餾水將體積補(bǔ)至10 mL，振蕩均勻，作為試驗(yàn)組。對(duì)照組中，取2支滅菌試管加入液體培養(yǎng)基5 mL，加入上述試驗(yàn)組同一濃度菌液 1 mL，并加入4 mL蒸餾水，振蕩均勻，作陽(yáng)性對(duì)照。另取2支滅菌試管加入液體培養(yǎng)基5 mL，藥物儲(chǔ)備液1 mL，并加入 4 mL 蒸餾水，振蕩均勻，作陰性對(duì)照，見(jiàn)表1。

表14種抗菌藥的濃度梯度對(duì)照

藥物的最終濃度依次為6 400、5 760、5 120、4 480、3 840、3 200、2 560、1 920、1 280、640、256、128、64和51.2 mg/L，培養(yǎng)前先測(cè)好陽(yáng)性對(duì)照的D600 nm值，將所有試管置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h，觀察記錄抑菌結(jié)果，測(cè)定D600 nm，記錄無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)試管中的最低藥物濃度，即為最小抑菌濃度(MIC)[9]。以陽(yáng)性和陰性對(duì)照管為參照，記錄第1～15組細(xì)菌生長(zhǎng)情況。觀察各試管中細(xì)菌生長(zhǎng)情況，未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)的藥物濃度即為該藥對(duì)檢測(cè)菌的MIC。以上述相同方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)菌的 MIC，同時(shí)分別做培養(yǎng)基(MH肉湯)，檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)情況并作為對(duì)照。每次試驗(yàn)每種藥均為3組平行，求其均值。測(cè)其MIC后，將未見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的各管旋渦混勻后，分別吸取 0.1 mL 傾倒于2個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃再培養(yǎng)18 h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，平均菌落數(shù)<5個(gè)的最小稀釋度的藥物濃度即為MBC[10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用Excel 2003進(jìn)行分析處理。利用Excel軟件制作各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出各樣品中對(duì)應(yīng)指標(biāo)的活性含量。采用單因素ANOVA試驗(yàn)法方差分析、配對(duì)樣本t檢驗(yàn)法和LSD法比較差異顯著性。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種四環(huán)素類藥物對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果

2.1.1 鹽酸土霉素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果 由表2可知，鹽酸土霉素濃度>2 560 μg/mL，抗菌效果明顯，菌落無(wú)生長(zhǎng)。<2 560 μg/mL細(xì)菌生長(zhǎng)逐漸增多，說(shuō)明藥物對(duì)細(xì)菌的抑制效果逐漸減弱。在藥物濃度范圍為3 200～6 400、1 280～1 920 μg/mL 時(shí)，差異不顯著(P>0.05)，而3 200～6 400 μg/mL 與<2 560 μg/mL比較時(shí)，差異顯著(P<0.05)，并且隨著藥物濃度減小，細(xì)菌濃度逐漸增加。

表2鹽酸土霉素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果

注：“-”表示無(wú)菌落生長(zhǎng)，“+”表示生長(zhǎng)菌落較多，“++”表示生長(zhǎng)大量的菌落，“+++”表示生長(zhǎng)的菌落最多；同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表3、表4同。

2.1.2 金霉素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果 金霉素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果由表3可見(jiàn)。>1 280 μg/mL時(shí)，試管澄清；<1 920 μg/mL 時(shí)，出現(xiàn)渾濁，抗菌效果不明顯。隨著藥物濃度的減小，渾濁度增加，藥物此時(shí)只能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，不能夠完全殺死細(xì)菌。藥物濃度6 400 μg/mL與其他濃度相比，差異顯著(P<0.05)。64～1 280 μg/mL濃度下雖然菌落已經(jīng)開(kāi)始生長(zhǎng)，但是彼此之間差異不顯著(P>0.05)。

2.1.3 四環(huán)素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果 由表4可知，藥物濃度>1 920 μg/mL時(shí)，試管澄清，沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)，抗菌效果明顯，當(dāng)藥物濃度<1 920 μg/mL時(shí)，出現(xiàn)渾濁，細(xì)菌逐漸增長(zhǎng)，藥物呈現(xiàn)出抑菌效果。藥物濃度在2 560～6 400 μg/mL，細(xì)菌無(wú)生長(zhǎng)范圍時(shí)，抗菌效果明顯，與濃度51.2～1 920 μg/mL相比，差異顯著(P<0.05)。

2.2 3種四環(huán)素類抗生素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的MIC、MBC比較

綜合表2、表3、表4可得到表5。

依據(jù)MIC和MBC的測(cè)定結(jié)果，鹽酸土霉素、金霉素、四環(huán)素3種藥物對(duì)海水創(chuàng)傷弧菌均有殺菌作用。但3種藥物對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果不同(圖2)，金霉素對(duì)于創(chuàng)傷弧菌最敏感，效果最明顯，相同細(xì)菌濃度時(shí)金霉素的藥物濃度最小，即金霉素的最小殺菌濃度MBC和最小抑菌濃度MIC最小。

3 討論

3.1 創(chuàng)傷弧菌抗菌研究

從20世紀(jì)70年代起，美國(guó)、荷蘭、丹麥等國(guó)家相繼有創(chuàng)傷弧菌感染臨床和流行病學(xué)方面的研究報(bào)道，早期研究抗生素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的報(bào)道，多數(shù)是關(guān)于陸地動(dòng)物的，關(guān)于水生生物的極少。相關(guān)學(xué)者用紅霉素、慶大霉素、四環(huán)素等多種抗生素在小鼠感染創(chuàng)傷弧菌后1.5 h進(jìn)行治療，結(jié)果認(rèn)為四環(huán)素在創(chuàng)傷弧菌感染小鼠模型體內(nèi)治療中有較好的療效[11]。盡管如此，在抗生素應(yīng)用治療等方面仍然值得更深入研究。傳統(tǒng)上抗菌藥物給藥方案的確定主要依賴于藥物 MIC、MBC 及藥物在機(jī)體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，故傳統(tǒng)給藥方案要求機(jī)體內(nèi)藥物濃度維持在 MIC 以上才有治療意義，當(dāng)藥物濃度低于MIC 時(shí)，應(yīng)再次給藥。

表3金霉素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果

表4四環(huán)素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果

表53種四環(huán)素類抗生素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的MIC、MBC比較

3.2 抗生素對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要致病菌的抗菌效果

本試驗(yàn)測(cè)定3種抗菌藥物的MIC和MBC，通過(guò)測(cè)定MIC和MBC了解這3種四環(huán)素類藥物的抗菌效果。MIC是抑制細(xì)菌生長(zhǎng)所需藥物的最低濃度，試驗(yàn)細(xì)菌未見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度就為MIC，通常來(lái)表示試驗(yàn)中某種抗菌藥物抑制50%和90%受試菌株生長(zhǎng)所需的MIC。同一細(xì)菌對(duì)不同藥物的敏感性用MIC衡量，其值越小，說(shuō)明越敏感，其抗菌效果越強(qiáng)。最低殺菌濃度最初是為了驗(yàn)證四環(huán)素類藥物對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌作用，菌數(shù)減少99.9%或以上所需要的最低抗菌藥物的濃度，通常表示試驗(yàn)中某種受試菌株50%或90%能被抗菌藥物殺滅。本試驗(yàn)就是通過(guò)檢測(cè)出鹽酸土霉素、四環(huán)素和金霉素的MIC和MBC來(lái)驗(yàn)證其對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果，以了解這3種藥物的藥理藥效。

四環(huán)素類抗生素療效顯著，應(yīng)用廣泛，本試驗(yàn)中筆者就選用了四環(huán)素類抗生素藥物鹽酸土霉素、金霉素和四環(huán)素，它們具有比較廣的抗菌譜，對(duì)魚(yú)類的多種致病菌也顯示出具有比較強(qiáng)的抗菌作用。與相關(guān)學(xué)者做的用抗生素測(cè)定創(chuàng)傷弧菌感染小鼠的試驗(yàn)[11]不同的是，本試驗(yàn)直接選取了分離提純后的創(chuàng)傷弧菌在培養(yǎng)基擴(kuò)增后的細(xì)菌來(lái)作為試驗(yàn)的對(duì)象。除了陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照外，又將不同濃度的四環(huán)素類抗生素加入了相同體積細(xì)菌的培養(yǎng)基試管中，12 h之后進(jìn)行比較觀察。根據(jù)靳恒等發(fā)表的5種中草藥和9種抗生素對(duì)養(yǎng)殖鰻鱺主要致病菌的抑制作用四環(huán)素類的抗生素對(duì)鰻鱺致病菌的抗菌效果，MIC和MBC均大于1 000 μg/mL[12]。而本試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，鹽酸土霉素MBC為3 200 μg/mL，MIC為51.2～2 560 μg/mL；金霉素MBC為1 920 μg/mL，MIC為51.2～1 280 μg/mL；四環(huán)素MBC為2 560 μg/mL，MIC為51.2～1 920 μg/mL，與靳恒等的試驗(yàn)結(jié)果[12]相一致，但是也存在些許的不同，由于本試驗(yàn)運(yùn)用的試驗(yàn)菌株為創(chuàng)傷弧菌，而其運(yùn)用的鰻鱺的致病菌可能會(huì)給試驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)不同，源于試驗(yàn)檢測(cè)觀察的時(shí)間不同，時(shí)間越長(zhǎng)可能會(huì)造成部分菌株的衰敗，不能保證其活性，所以相對(duì)用藥濃度可能會(huì)減少，本試驗(yàn)用于藥物和細(xì)菌培養(yǎng)的時(shí)間是12 h，能夠充分保證細(xì)菌活性。用藥也會(huì)相對(duì)增多，試驗(yàn)器材和人員的操作同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一些誤差。四環(huán)素類抗生素的作用效果顯著，但鹽酸土霉素、金霉素、四環(huán)素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌效果存在些差異，本試驗(yàn)探究3種四環(huán)素類藥物對(duì)創(chuàng)傷弧菌的效果可知，金霉素>四環(huán)素>鹽酸土霉素。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中的3種抗菌藥中，創(chuàng)傷弧菌對(duì)金霉素最敏感，最小抑菌濃度為51.2～1 280 mg/L，最小殺菌濃度為 1 920 mg/L；其次是四環(huán)素，其最小抑菌濃度為51.2～1 920 mg/L，最小殺菌濃度為2 560 mg/L，最后是鹽酸土霉素，其最小抑菌濃度為51.2～2 560 mg/L，最小殺菌濃度 3 200 mg/L。金霉素對(duì)于創(chuàng)傷弧菌最敏感，效果最顯著，四環(huán)素為中等，鹽酸土霉素對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌抑菌效果是三者中最弱的。適量的藥物使用是水產(chǎn)養(yǎng)殖中不容忽視的關(guān)鍵因子之一。不合理的藥物使用往往會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物過(guò)早地產(chǎn)生抗藥性。因此，在治療海水創(chuàng)傷弧菌感染時(shí)，藥物的選擇必須慎重，切勿濫用抗菌藥物。掌握好藥物的劑量、合理地使用抗菌藥，不僅可以有效地利用藥物，還可以降低細(xì)菌對(duì)藥物的抗藥性。所以在藥物使用過(guò)程中，針對(duì)不同藥物要控制好劑量，這樣才能對(duì)疾病的防治有更好的效果。

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