余文杰， 陳觀水

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建漳州 363000； 2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350001)

紅龍魚是我國主要的觀賞魚品種之一，許多養(yǎng)殖場和魚類愛好者均有飼養(yǎng)。目前福建省已形成相當(dāng)規(guī)模的紅龍魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。由于紅龍魚的高蛋白餌料投喂造成其生長水體惡化，而大部分養(yǎng)殖場忽視了防病措施，魚體傳染性病日趨嚴(yán)重，發(fā)病率高達75%以上，造成極大的經(jīng)濟損失。2016年5月份福建省一些養(yǎng)殖場暴發(fā)紅龍魚疾病，其體表出現(xiàn)潰瘍，嚴(yán)重者口鼻充血、流血，解剖后內(nèi)臟肝、脾、腎腫大。經(jīng)過細菌分離鑒定發(fā)現(xiàn)，主要原因是嗜水氣單胞菌的大量感染。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌中存在2種β-溶血性毒素，分別是毒力因子溶血素和氣溶素[1]。嗜水氣單胞菌中溶血性毒素會導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏，最終引發(fā)細胞死亡。前人研究表明，aerA基因和ahh1基因分別負責(zé)翻譯生產(chǎn)溶血素和氣溶素。血液中鐵元素在水產(chǎn)動物機體內(nèi)是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的重要因子，可影響魚體巨噬細胞的殺菌功能和免疫細胞的增殖與活性。同時，鐵元素也是病原微生物和宿主相互競爭的對象，機體可以通過調(diào)節(jié)鐵相關(guān)基因，從而抑制病原微生物的侵害。Hepcidin基因(hepc)是一種主要由肝細胞產(chǎn)生的防御性抗菌肽，具有抑菌活性，同時也是機體鐵代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，對維持鐵平衡具有重要作用，也稱為鐵調(diào)素[2]。白細胞介素6(簡稱il-6)炎性因子能強烈地刺激鐵調(diào)素的表達。而il-6炎性因子是通過刺激蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(簡稱JAK/STAT)信號通路調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達[3]。本試驗擬通過紅龍魚源β-溶血性嗜水氣單胞菌AH的分離鑒定，然后檢測受嗜水氣單胞菌AH侵染后紅龍魚鐵代謝水平和肝臟中hepc、il-6、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶3基因(jak3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3基因(stat3)表達量的變化，進而研究β-溶血性嗜水氣單胞菌AH侵染和魚體鐵代謝之間的相互作用，為進一步分析鐵相關(guān)基因在受感染寄主應(yīng)對細菌侵染中的作用提供科學(xué)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 染病紅龍魚采集與病原菌的分離

染病紅龍魚典型患病特征為敗血癥，其主要癥狀為反應(yīng)遲鈍、攝食較少，嚴(yán)重者口鼻充血。解剖后可見魚體肝臟腫大，有點狀出血，腎臟、腸道充血。在無菌條件下從染病紅龍魚的肝、腎、皮膚和血液取樣，用營養(yǎng)瓊脂平板劃線分離，30 ℃ 培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進行純化培養(yǎng)，菌株低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細菌鑒定

通過細菌形狀、革蘭氏染色和氧化酶檢測，采用法國梅里埃生物公司革蘭氏陰性或陽性鑒定試劑條，用VITEK-32全自動細菌鑒定儀鑒定。

1.3 化學(xué)試劑和生物試劑盒

化學(xué)試劑購自上海一基實業(yè)有限公司，生物試劑盒購自深圳市長征生物科技有限公司。引物和反應(yīng)條件參照前人描述的方法[4]。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1引物序列和目標(biāo)基因

1.4 試驗菌株DNA提取

細菌DNA制備依據(jù)相應(yīng)的DNA提取試劑盒產(chǎn)品說明書(北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司)。

1.5 PCR條件

PCR反應(yīng)條件包括3對引物的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)溶液(25 μL)包含12.5 μLTaq酶，1.0 μLahh1引物，1.0 μLaerA引物，0.2 μL 16S rRNA引物和1 μL DNA樣品，其余為雙蒸水。PCR(儀器型號為ABI-2720，美國貝登儀器公司)擴增采用下列條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增的DNA片段的電泳檢測條件：2%瓊脂糖凝膠水平電泳，1×TAE緩沖區(qū)(0.04 mol/L Tris，0.02 mol/L醋酸，0.002 mol/L Na2EDTA)，100 V，45 min，使用8 μL PCR產(chǎn)物。凝膠使用1 μL/mL溴化乙錠染色 30 min，在紫外線光照下觀察?；虼笮?biāo)準(zhǔn)品采用100個堿基對的DNA梯度標(biāo)記物(上海啟發(fā)試驗試劑有限公司)。

1.6 試驗用魚

試驗用健康紅龍魚購自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，選擇外觀健康和大小相似的紅龍魚幼魚，魚體質(zhì)量為(100±5)g，體長為(20±1)cm。將試驗紅龍魚隨機分為2個處理組：試驗組和對照組，每個處理組設(shè)3個平行，每個平行50尾，共300尾。

1.7 嗜水氣單胞菌AH侵染和樣品采集

根據(jù)前期試驗結(jié)果，采用嗜水氣單胞菌AH侵染的最適菌懸液濃度為1.0×106CFU/mL。將培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌AH用0.65%無菌生理鹽水洗脫，稀釋成1.0×106CFU/mL的菌懸液，通過紅龍魚腹腔注射，注射前魚體用200 mg/L丁香酚輕度麻痹，試驗組每尾注射0.1 mL菌懸液，對照組注射等量無菌生理鹽水。注射后6、12、24、48、72、84、96 h獨立采集試驗組、對照組魚各3尾，將一次性注射器用肝素鈉(1 000 IU/mL)潤洗后從魚體尾靜脈取血0.5～0.8 mL。采血后魚體立即解剖，取出肝臟組織置于液氮中，于-80 ℃保存，用于肝臟鐵含量和基因表達測定。

1.8 血清鐵濃度、總鐵結(jié)合力的測定

血清樣品制備：血液于40 ℃靜置2 h左右，于 4 000 r/min 離心10 min后收集上層血清，-20 ℃冰箱過夜，次日血清解凍后再次低速(4 000 r/min)離心10 min，吸取上層液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血清鐵濃度及總鐵結(jié)合力(mg/L)的測定使用血清鐵、總鐵結(jié)合力試劑盒(福州先亞生物工程有限公司)。血清鐵濃度的檢測原理：在酸性溶液和還原劑的作用下，使轉(zhuǎn)鐵蛋白中鐵與蛋白分離，使血清中高鐵還原成亞鐵，后者與雙吡啶結(jié)合成粉紅色的絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)，鐵離子的含量與色澤成正比?？傝F結(jié)合力的檢測原理[5]：在血清內(nèi)加入過量的鐵，使血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白全部與鐵結(jié)合，再加入鐵吸附劑，將多余的鐵吸附，然后依據(jù)血清鐵檢測方法測定鐵含量，即為總鐵結(jié)合力。測定步驟具體參照試劑盒說明書，利用紫外分光光度計(TU-1900，北京普析通用儀器有限公司)測定，每個樣品重復(fù)檢測3次。

1.9 肝臟鐵濃度的測定

采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法(簡稱ICP-AES)檢測肝臟鐵含量[5]：將肝臟樣品解凍后，用低溫0.9%生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干水分，粉碎均勻后置于坩堝中，置于馬弗爐內(nèi)，于600 ℃灼燒5 h，直至試樣呈白色或者灰白色、無炭粒為止。冷卻后取出，用5 mL體積比為1 ∶1的硝酸、水溶液溶解，電爐上加熱直至沸騰，過濾至50 mL容量瓶內(nèi)，并用雙蒸水反復(fù)洗滌坩堝和濾紙，將洗滌液并入容量瓶中，然后用雙蒸水定容、混勻，作為試樣溶液。同時配制試劑空白液。采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(inductively coupled plasma-atomic emission specrometry，簡稱ICP-AES)儀(ICP-8000，北京達豐瑞儀器有限公司)測定，每個樣品重復(fù)檢測3次。

1.10 肝臟鐵代謝相關(guān)基因表達特征分析

根據(jù)紅龍魚hepc基因cDNA序列(基因登錄號：JQ308543)、il-6基因cDNA序列(基因登錄號：KJ757688)、jak3基因cDNA序列(基因登錄號：AF148993)與草魚stat3基因cDNA序列(基因登錄號：JX976548)設(shè)計引物，詳見表2[6-8]。采用RNAiso[寶生物工程(大連)有限公司]提取肝臟總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，在實時定量PCR儀(T-100，美國伯樂儀器有限公司)上進行實時熒光定量PCR。目的基因在肝臟中的相對表達量采用2分對照法確定，選擇紅龍魚18S rRNA基因作為內(nèi)參(基因登錄號：AB860236)[9]。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：0.4 μL上下游引物，2 μL cDNA模板，7.2 μL ddH2O，總體積20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)。溶解曲線溫度為52～99 ℃。每個樣品重復(fù)檢測3次。

表2紅龍魚鐵代謝相關(guān)基因熒光定量PCR引物序列

1.11 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗法進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著[10]。所有數(shù)值均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落特征

從染病紅龍魚肝臟中分離出1株菌株AH，經(jīng)24 h營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)后呈黃色，濕潤圓形略隆起，邊緣整齊，直徑為2 mm左右，見圖1。

2.2 生化反應(yīng)及鑒定結(jié)果

菌株AH經(jīng)過分離純化后，用VITEK-32全自動微生物分析儀鑒定為嗜水氣單胞菌，其生理、生化特性見表3。

2.3 嗜水氣單胞菌AH β-溶血性毒素因子ahh1和aerA的基因分析

經(jīng)過多重PCR證實，從染病紅龍魚中分離得到的嗜水氣單胞菌AH攜帶ahh1和aerA基因。該細菌16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物(356個堿基對)、ahh1基因擴增產(chǎn)物(130個堿基對)、aerA基因擴增產(chǎn)物(309 bp)見圖2。

表3菌株AH生理、生化特性

注：“+”“-”分別表示陽性、陰性。

2.4 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后其血清鐵濃度的變化

嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后不同時間點血清中鐵濃度的變化趨勢如圖3所示。由圖3可以看出，侵染后不同時間點試驗組和對照組比較，紅龍魚血清鐵濃度均有不同程度的降低，侵染24、48 h后達到顯著水平(P<0.05)。

2.5 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后其血清總鐵結(jié)合力的變化

嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后不同時間點其血清中總鐵結(jié)合力的變化趨勢如圖4所示。由圖4可以看出，侵染后試驗組紅龍魚血液中血清的總鐵結(jié)合力和對照組比較略有不同程度的增加，但均未達到顯著水平。

2.6 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后其肝臟鐵含量的變化

由圖5可以看出，嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后不同時間點試驗組肝臟鐵含量均高于對照組，但并無顯著差異。

2.7 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后對其不同時間點hepc、il-6、jak3、stat3基因表達變化

在注射嗜水氣單胞菌AH后，hepc基因在不同時間點表達量相對于0 h明顯上調(diào)，在6、12、24 h與0 h差異顯著(P<0.05)，在侵染后6 h達到最高值，隨后逐漸下降?；騣l-6在侵染后表達量明顯上調(diào)，在24 h時表達量最高，隨后有所下降，在12、24、48 h均與0 h差異顯著(P<0.05)；基因jak3、stat3的表達量亦均有所上調(diào)，jak3基因在12 h時表達量達到最高值(P<0.05)，stat3基因在6 h時的表達量達到最高值，隨后逐步下降，但仍明顯高于侵染前的表達水平，詳見圖6。

3 結(jié)論與討論

對染病紅龍魚肝臟取樣后進行細菌的劃線分離純化，在營養(yǎng)瓊脂平板上獲得形態(tài)一致的菌落，將該菌株編號為AH，由全自動細菌分析儀鑒定其為嗜水氣單胞菌。菌株AH人工感染紅龍魚試驗表明，出現(xiàn)的癥狀與自然病例基本相同，鑒定的菌株與接種菌株完全一致，所觀察到的菌落形態(tài)也基本相符。PCR是一種檢測病原體首選的方法，它具有顯著的優(yōu)點，如速度快、高敏感性和特異性等[5]。本研究使用特定的毒力因子引物來證實嗜水氣單胞菌AH攜帶氣溶素和溶血素基因。菌株AH具有β-溶血性嗜水氣單胞菌特征，能分泌具有溶血性、腸毒性和細胞毒性的外毒素，并能廣泛地侵襲健康紅龍魚腎、脾、肺、肝、肌肉和血液等器官組織，且能大量增殖，造成廣泛性出血、全身性組織損害，并使各器官組織出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、玻璃樣變、壞死崩解以及紅細胞碎裂。解剖后觀察均可見體表出現(xiàn)潰瘍、疤痕，嚴(yán)重的產(chǎn)生口鼻充血、流血，內(nèi)臟肝、脾、腎腫大，腸道充血，嚴(yán)重者有腹水。

紅龍魚血液中鐵元素是機體內(nèi)多種酶類合成的必要元素，參與細胞增殖、分化和電子轉(zhuǎn)移等多種生命活動。鐵也是需鐵細菌增殖分化的必要元素，與致病菌毒力的強弱有關(guān)。細菌入侵宿主機體吸收鐵以滿足其增殖和致病力的表達。宿主通過降低機體鐵代謝水平，從而抑制細菌的增殖和降低其致病力。本試驗發(fā)現(xiàn)，侵染嗜水氣單胞菌AH后紅龍魚血清鐵含量有所下降，24、48 h與對照差異達到顯著水平。肝臟鐵含量在侵染嗜水氣單胞菌AH后有所上升，但與對照的差異沒有達到顯著水平。這表明魚體在侵染后通過一系列調(diào)節(jié)作用，降低機體的鐵循環(huán)從而抑制細菌的侵害。侵染后紅龍魚血清總鐵結(jié)合力相對于對照組有所上升，沒有達到顯著水平。結(jié)合細菌侵染后魚體血清鐵含量的變化和轉(zhuǎn)鐵蛋白含量的變化，認為血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白的比例顯著下降可以提高鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合效率，從而抑制嗜水氣單胞菌AH從機體攝取鐵的能力。

本試驗檢測發(fā)現(xiàn)，紅龍魚肝臟hepc、il-6、jak3和stat3基因在嗜水氣單胞菌AH侵染后都有不同程度的上調(diào)，表明這些基因都參與了魚體的非特異性免疫反應(yīng)。hepc基因主要在肝臟中合成和分泌，可以抑制腸道鐵的吸收和肝臟鐵的釋放以降低機體的鐵相關(guān)基因水平。前人研究證實，大菱鲆在侵染細菌嗜水氣單胞菌AH后，肝、脾、鰓等組織中hepc基因的表達量均顯著增高。侵染鏈球菌后，鱸魚肝細胞hepc的mRNA水平在數(shù)小時內(nèi)明顯上調(diào)。香魚肝臟中hepc基因表達量在侵染鰻利斯頓氏菌后顯著上升[11-12]。本試驗中，hepc基因在侵染后不同時間點的表達量均有所上升，并在12、24 h與0 h相比達到了顯著差異。機體受細菌侵害時，巨噬細胞等免疫細胞會合成和分泌大量的炎性因子，其中主要為白細胞介素6(il-6)。炎癥反應(yīng)可通過一系列生化過程調(diào)節(jié)hepc基因的表達，進而影響機體鐵相關(guān)基因水平。il-6和受體結(jié)合后可激活jak3基因，進而磷酸化stat3，進入細胞核，調(diào)節(jié)hepc基因的轉(zhuǎn)錄，促進hepc基因的表達。在本試驗中，在侵染嗜水氣單胞菌AH后紅龍魚肝臟中il-6的表達量均有所上升，在24 h時達到最高值?；騤ak3、stat3的表達量也均有所上調(diào)，分別在6、12 h時達到最高值。因此，當(dāng)細菌入侵時，引起魚體發(fā)生炎癥反應(yīng)，在il-6基因和JAK/STAT通路相關(guān)基因的共同作用下，hepc基因的表達量上升，從而下調(diào)魚體的循環(huán)鐵濃度，以應(yīng)對細菌的侵害。

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