余文杰， 陳觀水

(1.漳州職業(yè)技術學院食品與生物工程系，福建漳州 363000； 2.福建農林大學生命科學學院，福建福州 350001)

紅龍魚是我國主要的觀賞魚品種之一，許多養(yǎng)殖場和魚類愛好者均有飼養(yǎng)。目前福建省已形成相當規(guī)模的紅龍魚養(yǎng)殖產業(yè)。由于紅龍魚的高蛋白餌料投喂造成其生長水體惡化，而大部分養(yǎng)殖場忽視了防病措施，魚體傳染性病日趨嚴重，發(fā)病率高達75%以上，造成極大的經濟損失。2016年5月份福建省一些養(yǎng)殖場暴發(fā)紅龍魚疾病，其體表出現(xiàn)潰瘍，嚴重者口鼻充血、流血，解剖后內臟肝、脾、腎腫大。經過細菌分離鑒定發(fā)現(xiàn)，主要原因是嗜水氣單胞菌的大量感染。目前已經發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌中存在2種β-溶血性毒素，分別是毒力因子溶血素和氣溶素[1]。嗜水氣單胞菌中溶血性毒素會導致胞質內容物泄漏，最終引發(fā)細胞死亡。前人研究表明，aerA基因和ahh1基因分別負責翻譯生產溶血素和氣溶素。血液中鐵元素在水產動物機體內是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的重要因子，可影響魚體巨噬細胞的殺菌功能和免疫細胞的增殖與活性。同時，鐵元素也是病原微生物和宿主相互競爭的對象，機體可以通過調節(jié)鐵相關基因，從而抑制病原微生物的侵害。Hepcidin基因(hepc)是一種主要由肝細胞產生的防御性抗菌肽，具有抑菌活性，同時也是機體鐵代謝的關鍵調節(jié)因子，對維持鐵平衡具有重要作用，也稱為鐵調素[2]。白細胞介素6(簡稱il-6)炎性因子能強烈地刺激鐵調素的表達。而il-6炎性因子是通過刺激蛋白酪氨酸激酶/信號轉導子和轉錄激活子(簡稱JAK/STAT)信號通路調節(jié)鐵調素表達[3]。本試驗擬通過紅龍魚源β-溶血性嗜水氣單胞菌AH的分離鑒定，然后檢測受嗜水氣單胞菌AH侵染后紅龍魚鐵代謝水平和肝臟中hepc、il-6、蛋白質酪氨酸激酶3基因(jak3)、信號轉導子和轉錄激活因子3基因(stat3)表達量的變化，進而研究β-溶血性嗜水氣單胞菌AH侵染和魚體鐵代謝之間的相互作用，為進一步分析鐵相關基因在受感染寄主應對細菌侵染中的作用提供科學研究依據。

1 材料與方法

1.1 染病紅龍魚采集與病原菌的分離

染病紅龍魚典型患病特征為敗血癥，其主要癥狀為反應遲鈍、攝食較少，嚴重者口鼻充血。解剖后可見魚體肝臟腫大，有點狀出血，腎臟、腸道充血。在無菌條件下從染病紅龍魚的肝、腎、皮膚和血液取樣，用營養(yǎng)瓊脂平板劃線分離，30 ℃ 培養(yǎng)24 h，挑取單菌落進行純化培養(yǎng)，菌株低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細菌鑒定

通過細菌形狀、革蘭氏染色和氧化酶檢測，采用法國梅里埃生物公司革蘭氏陰性或陽性鑒定試劑條，用VITEK-32全自動細菌鑒定儀鑒定。

1.3 化學試劑和生物試劑盒

化學試劑購自上海一基實業(yè)有限公司，生物試劑盒購自深圳市長征生物科技有限公司。引物和反應條件參照前人描述的方法[4]。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1引物序列和目標基因

1.4 試驗菌株DNA提取

細菌DNA制備依據相應的DNA提取試劑盒產品說明書(北京普洛麥格生物技術有限公司)。

1.5 PCR條件

PCR反應條件包括3對引物的PCR反應。PCR反應溶液(25 μL)包含12.5 μLTaq酶，1.0 μLahh1引物，1.0 μLaerA引物，0.2 μL 16S rRNA引物和1 μL DNA樣品，其余為雙蒸水。PCR(儀器型號為ABI-2720，美國貝登儀器公司)擴增采用下列條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增的DNA片段的電泳檢測條件：2%瓊脂糖凝膠水平電泳，1×TAE緩沖區(qū)(0.04 mol/L Tris，0.02 mol/L醋酸，0.002 mol/L Na2EDTA)，100 V，45 min，使用8 μL PCR產物。凝膠使用1 μL/mL溴化乙錠染色 30 min，在紫外線光照下觀察?；虼笮藴势凡捎?00個堿基對的DNA梯度標記物(上海啟發(fā)試驗試劑有限公司)。

1.6 試驗用魚

試驗用健康紅龍魚購自福建省農業(yè)科學院水產養(yǎng)殖基地，選擇外觀健康和大小相似的紅龍魚幼魚，魚體質量為(100±5)g，體長為(20±1)cm。將試驗紅龍魚隨機分為2個處理組：試驗組和對照組，每個處理組設3個平行，每個平行50尾，共300尾。

1.7 嗜水氣單胞菌AH侵染和樣品采集

根據前期試驗結果，采用嗜水氣單胞菌AH侵染的最適菌懸液濃度為1.0×106CFU/mL。將培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌AH用0.65%無菌生理鹽水洗脫，稀釋成1.0×106CFU/mL的菌懸液，通過紅龍魚腹腔注射，注射前魚體用200 mg/L丁香酚輕度麻痹，試驗組每尾注射0.1 mL菌懸液，對照組注射等量無菌生理鹽水。注射后6、12、24、48、72、84、96 h獨立采集試驗組、對照組魚各3尾，將一次性注射器用肝素鈉(1 000 IU/mL)潤洗后從魚體尾靜脈取血0.5～0.8 mL。采血后魚體立即解剖，取出肝臟組織置于液氮中，于-80 ℃保存，用于肝臟鐵含量和基因表達測定。

1.8 血清鐵濃度、總鐵結合力的測定

血清樣品制備：血液于40 ℃靜置2 h左右，于 4 000 r/min 離心10 min后收集上層血清，-20 ℃冰箱過夜，次日血清解凍后再次低速(4 000 r/min)離心10 min，吸取上層液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血清鐵濃度及總鐵結合力(mg/L)的測定使用血清鐵、總鐵結合力試劑盒(福州先亞生物工程有限公司)。血清鐵濃度的檢測原理：在酸性溶液和還原劑的作用下，使轉鐵蛋白中鐵與蛋白分離，使血清中高鐵還原成亞鐵，后者與雙吡啶結合成粉紅色的絡合物，在一定范圍內，鐵離子的含量與色澤成正比?？傝F結合力的檢測原理[5]：在血清內加入過量的鐵，使血清中轉鐵蛋白全部與鐵結合，再加入鐵吸附劑，將多余的鐵吸附，然后依據血清鐵檢測方法測定鐵含量，即為總鐵結合力。測定步驟具體參照試劑盒說明書，利用紫外分光光度計(TU-1900，北京普析通用儀器有限公司)測定，每個樣品重復檢測3次。

1.9 肝臟鐵濃度的測定

采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法(簡稱ICP-AES)檢測肝臟鐵含量[5]：將肝臟樣品解凍后，用低溫0.9%生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干水分，粉碎均勻后置于坩堝中，置于馬弗爐內，于600 ℃灼燒5 h，直至試樣呈白色或者灰白色、無炭粒為止。冷卻后取出，用5 mL體積比為1 ∶1的硝酸、水溶液溶解，電爐上加熱直至沸騰，過濾至50 mL容量瓶內，并用雙蒸水反復洗滌坩堝和濾紙，將洗滌液并入容量瓶中，然后用雙蒸水定容、混勻，作為試樣溶液。同時配制試劑空白液。采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(inductively coupled plasma-atomic emission specrometry，簡稱ICP-AES)儀(ICP-8000，北京達豐瑞儀器有限公司)測定，每個樣品重復檢測3次。

1.10 肝臟鐵代謝相關基因表達特征分析

根據紅龍魚hepc基因cDNA序列(基因登錄號：JQ308543)、il-6基因cDNA序列(基因登錄號：KJ757688)、jak3基因cDNA序列(基因登錄號：AF148993)與草魚stat3基因cDNA序列(基因登錄號：JX976548)設計引物，詳見表2[6-8]。采用RNAiso[寶生物工程(大連)有限公司]提取肝臟總RNA，反轉錄成cDNA，在實時定量PCR儀(T-100，美國伯樂儀器有限公司)上進行實時熒光定量PCR。目的基因在肝臟中的相對表達量采用2分對照法確定，選擇紅龍魚18S rRNA基因作為內參(基因登錄號：AB860236)[9]。實時熒光定量PCR反應體系：0.4 μL上下游引物，2 μL cDNA模板，7.2 μL ddH2O，總體積20 μL。反應條件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)。溶解曲線溫度為52～99 ℃。每個樣品重復檢測3次。

表2紅龍魚鐵代謝相關基因熒光定量PCR引物序列

1.11 數(shù)據分析

所有數(shù)據均用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗法進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著[10]。所有數(shù)值均表示為“平均值±標準差”。

2 結果與分析

2.1 菌落特征

從染病紅龍魚肝臟中分離出1株菌株AH，經24 h營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)后呈黃色，濕潤圓形略隆起，邊緣整齊，直徑為2 mm左右，見圖1。

2.2 生化反應及鑒定結果

菌株AH經過分離純化后，用VITEK-32全自動微生物分析儀鑒定為嗜水氣單胞菌，其生理、生化特性見表3。

2.3 嗜水氣單胞菌AH β-溶血性毒素因子ahh1和aerA的基因分析

經過多重PCR證實，從染病紅龍魚中分離得到的嗜水氣單胞菌AH攜帶ahh1和aerA基因。該細菌16S rRNA基因PCR擴增產物(356個堿基對)、ahh1基因擴增產物(130個堿基對)、aerA基因擴增產物(309 bp)見圖2。

表3菌株AH生理、生化特性

注：“+”“-”分別表示陽性、陰性。

2.4 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后其血清鐵濃度的變化

嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后不同時間點血清中鐵濃度的變化趨勢如圖3所示。由圖3可以看出，侵染后不同時間點試驗組和對照組比較，紅龍魚血清鐵濃度均有不同程度的降低，侵染24、48 h后達到顯著水平(P<0.05)。

2.5 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后其血清總鐵結合力的變化

嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后不同時間點其血清中總鐵結合力的變化趨勢如圖4所示。由圖4可以看出，侵染后試驗組紅龍魚血液中血清的總鐵結合力和對照組比較略有不同程度的增加，但均未達到顯著水平。

2.6 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后其肝臟鐵含量的變化

由圖5可以看出，嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后不同時間點試驗組肝臟鐵含量均高于對照組，但并無顯著差異。

2.7 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后對其不同時間點hepc、il-6、jak3、stat3基因表達變化

在注射嗜水氣單胞菌AH后，hepc基因在不同時間點表達量相對于0 h明顯上調，在6、12、24 h與0 h差異顯著(P<0.05)，在侵染后6 h達到最高值，隨后逐漸下降?；騣l-6在侵染后表達量明顯上調，在24 h時表達量最高，隨后有所下降，在12、24、48 h均與0 h差異顯著(P<0.05)；基因jak3、stat3的表達量亦均有所上調，jak3基因在12 h時表達量達到最高值(P<0.05)，stat3基因在6 h時的表達量達到最高值，隨后逐步下降，但仍明顯高于侵染前的表達水平，詳見圖6。

3 結論與討論

對染病紅龍魚肝臟取樣后進行細菌的劃線分離純化，在營養(yǎng)瓊脂平板上獲得形態(tài)一致的菌落，將該菌株編號為AH，由全自動細菌分析儀鑒定其為嗜水氣單胞菌。菌株AH人工感染紅龍魚試驗表明，出現(xiàn)的癥狀與自然病例基本相同，鑒定的菌株與接種菌株完全一致，所觀察到的菌落形態(tài)也基本相符。PCR是一種檢測病原體首選的方法，它具有顯著的優(yōu)點，如速度快、高敏感性和特異性等[5]。本研究使用特定的毒力因子引物來證實嗜水氣單胞菌AH攜帶氣溶素和溶血素基因。菌株AH具有β-溶血性嗜水氣單胞菌特征，能分泌具有溶血性、腸毒性和細胞毒性的外毒素，并能廣泛地侵襲健康紅龍魚腎、脾、肺、肝、肌肉和血液等器官組織，且能大量增殖，造成廣泛性出血、全身性組織損害，并使各器官組織出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、玻璃樣變、壞死崩解以及紅細胞碎裂。解剖后觀察均可見體表出現(xiàn)潰瘍、疤痕，嚴重的產生口鼻充血、流血，內臟肝、脾、腎腫大，腸道充血，嚴重者有腹水。

紅龍魚血液中鐵元素是機體內多種酶類合成的必要元素，參與細胞增殖、分化和電子轉移等多種生命活動。鐵也是需鐵細菌增殖分化的必要元素，與致病菌毒力的強弱有關。細菌入侵宿主機體吸收鐵以滿足其增殖和致病力的表達。宿主通過降低機體鐵代謝水平，從而抑制細菌的增殖和降低其致病力。本試驗發(fā)現(xiàn)，侵染嗜水氣單胞菌AH后紅龍魚血清鐵含量有所下降，24、48 h與對照差異達到顯著水平。肝臟鐵含量在侵染嗜水氣單胞菌AH后有所上升，但與對照的差異沒有達到顯著水平。這表明魚體在侵染后通過一系列調節(jié)作用，降低機體的鐵循環(huán)從而抑制細菌的侵害。侵染后紅龍魚血清總鐵結合力相對于對照組有所上升，沒有達到顯著水平。結合細菌侵染后魚體血清鐵含量的變化和轉鐵蛋白含量的變化，認為血清鐵和轉鐵蛋白的比例顯著下降可以提高鐵與轉鐵蛋白的結合效率，從而抑制嗜水氣單胞菌AH從機體攝取鐵的能力。

本試驗檢測發(fā)現(xiàn)，紅龍魚肝臟hepc、il-6、jak3和stat3基因在嗜水氣單胞菌AH侵染后都有不同程度的上調，表明這些基因都參與了魚體的非特異性免疫反應。hepc基因主要在肝臟中合成和分泌，可以抑制腸道鐵的吸收和肝臟鐵的釋放以降低機體的鐵相關基因水平。前人研究證實，大菱鲆在侵染細菌嗜水氣單胞菌AH后，肝、脾、鰓等組織中hepc基因的表達量均顯著增高。侵染鏈球菌后，鱸魚肝細胞hepc的mRNA水平在數(shù)小時內明顯上調。香魚肝臟中hepc基因表達量在侵染鰻利斯頓氏菌后顯著上升[11-12]。本試驗中，hepc基因在侵染后不同時間點的表達量均有所上升，并在12、24 h與0 h相比達到了顯著差異。機體受細菌侵害時，巨噬細胞等免疫細胞會合成和分泌大量的炎性因子，其中主要為白細胞介素6(il-6)。炎癥反應可通過一系列生化過程調節(jié)hepc基因的表達，進而影響機體鐵相關基因水平。il-6和受體結合后可激活jak3基因，進而磷酸化stat3，進入細胞核，調節(jié)hepc基因的轉錄，促進hepc基因的表達。在本試驗中，在侵染嗜水氣單胞菌AH后紅龍魚肝臟中il-6的表達量均有所上升，在24 h時達到最高值。基因jak3、stat3的表達量也均有所上調，分別在6、12 h時達到最高值。因此，當細菌入侵時，引起魚體發(fā)生炎癥反應，在il-6基因和JAK/STAT通路相關基因的共同作用下，hepc基因的表達量上升，從而下調魚體的循環(huán)鐵濃度，以應對細菌的侵害。

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