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        紅龍魚源β-溶血性嗜水氣單胞菌AH的分離及其對機體鐵代謝的影響

        2018-05-10 09:21:48余文杰陳觀水
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年7期
        關(guān)鍵詞:紅龍水氣魚體

        余文杰, 陳觀水

        (1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系,福建漳州 363000; 2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建福州 350001)

        紅龍魚是我國主要的觀賞魚品種之一,許多養(yǎng)殖場和魚類愛好者均有飼養(yǎng)。目前福建省已形成相當(dāng)規(guī)模的紅龍魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。由于紅龍魚的高蛋白餌料投喂造成其生長水體惡化,而大部分養(yǎng)殖場忽視了防病措施,魚體傳染性病日趨嚴(yán)重,發(fā)病率高達75%以上,造成極大的經(jīng)濟損失。2016年5月份福建省一些養(yǎng)殖場暴發(fā)紅龍魚疾病,其體表出現(xiàn)潰瘍,嚴(yán)重者口鼻充血、流血,解剖后內(nèi)臟肝、脾、腎腫大。經(jīng)過細菌分離鑒定發(fā)現(xiàn),主要原因是嗜水氣單胞菌的大量感染。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌中存在2種β-溶血性毒素,分別是毒力因子溶血素和氣溶素[1]。嗜水氣單胞菌中溶血性毒素會導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)容物泄漏,最終引發(fā)細胞死亡。前人研究表明,aerA基因和ahh1基因分別負責(zé)翻譯生產(chǎn)溶血素和氣溶素。血液中鐵元素在水產(chǎn)動物機體內(nèi)是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的重要因子,可影響魚體巨噬細胞的殺菌功能和免疫細胞的增殖與活性。同時,鐵元素也是病原微生物和宿主相互競爭的對象,機體可以通過調(diào)節(jié)鐵相關(guān)基因,從而抑制病原微生物的侵害。Hepcidin基因(hepc)是一種主要由肝細胞產(chǎn)生的防御性抗菌肽,具有抑菌活性,同時也是機體鐵代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,對維持鐵平衡具有重要作用,也稱為鐵調(diào)素[2]。白細胞介素6(簡稱il-6)炎性因子能強烈地刺激鐵調(diào)素的表達。而il-6炎性因子是通過刺激蛋白酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(簡稱JAK/STAT)信號通路調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達[3]。本試驗擬通過紅龍魚源β-溶血性嗜水氣單胞菌AH的分離鑒定,然后檢測受嗜水氣單胞菌AH侵染后紅龍魚鐵代謝水平和肝臟中hepc、il-6、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶3基因(jak3)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3基因(stat3)表達量的變化,進而研究β-溶血性嗜水氣單胞菌AH侵染和魚體鐵代謝之間的相互作用,為進一步分析鐵相關(guān)基因在受感染寄主應(yīng)對細菌侵染中的作用提供科學(xué)研究依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 染病紅龍魚采集與病原菌的分離

        染病紅龍魚典型患病特征為敗血癥,其主要癥狀為反應(yīng)遲鈍、攝食較少,嚴(yán)重者口鼻充血。解剖后可見魚體肝臟腫大,有點狀出血,腎臟、腸道充血。在無菌條件下從染病紅龍魚的肝、腎、皮膚和血液取樣,用營養(yǎng)瓊脂平板劃線分離,30 ℃ 培養(yǎng)24 h,挑取單菌落進行純化培養(yǎng),菌株低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 細菌鑒定

        通過細菌形狀、革蘭氏染色和氧化酶檢測,采用法國梅里埃生物公司革蘭氏陰性或陽性鑒定試劑條,用VITEK-32全自動細菌鑒定儀鑒定。

        1.3 化學(xué)試劑和生物試劑盒

        化學(xué)試劑購自上海一基實業(yè)有限公司,生物試劑盒購自深圳市長征生物科技有限公司。引物和反應(yīng)條件參照前人描述的方法[4]。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

        表1引物序列和目標(biāo)基因

        1.4 試驗菌株DNA提取

        細菌DNA制備依據(jù)相應(yīng)的DNA提取試劑盒產(chǎn)品說明書(北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司)。

        1.5 PCR條件

        PCR反應(yīng)條件包括3對引物的PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)溶液(25 μL)包含12.5 μLTaq酶,1.0 μLahh1引物,1.0 μLaerA引物,0.2 μL 16S rRNA引物和1 μL DNA樣品,其余為雙蒸水。PCR(儀器型號為ABI-2720,美國貝登儀器公司)擴增采用下列條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。擴增的DNA片段的電泳檢測條件:2%瓊脂糖凝膠水平電泳,1×TAE緩沖區(qū)(0.04 mol/L Tris,0.02 mol/L醋酸,0.002 mol/L Na2EDTA),100 V,45 min,使用8 μL PCR產(chǎn)物。凝膠使用1 μL/mL溴化乙錠染色 30 min,在紫外線光照下觀察?;虼笮?biāo)準(zhǔn)品采用100個堿基對的DNA梯度標(biāo)記物(上海啟發(fā)試驗試劑有限公司)。

        1.6 試驗用魚

        試驗用健康紅龍魚購自福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖基地,選擇外觀健康和大小相似的紅龍魚幼魚,魚體質(zhì)量為(100±5)g,體長為(20±1)cm。將試驗紅龍魚隨機分為2個處理組:試驗組和對照組,每個處理組設(shè)3個平行,每個平行50尾,共300尾。

        1.7 嗜水氣單胞菌AH侵染和樣品采集

        根據(jù)前期試驗結(jié)果,采用嗜水氣單胞菌AH侵染的最適菌懸液濃度為1.0×106CFU/mL。將培養(yǎng)的嗜水氣單胞菌AH用0.65%無菌生理鹽水洗脫,稀釋成1.0×106CFU/mL的菌懸液,通過紅龍魚腹腔注射,注射前魚體用200 mg/L丁香酚輕度麻痹,試驗組每尾注射0.1 mL菌懸液,對照組注射等量無菌生理鹽水。注射后6、12、24、48、72、84、96 h獨立采集試驗組、對照組魚各3尾,將一次性注射器用肝素鈉(1 000 IU/mL)潤洗后從魚體尾靜脈取血0.5~0.8 mL。采血后魚體立即解剖,取出肝臟組織置于液氮中,于-80 ℃保存,用于肝臟鐵含量和基因表達測定。

        1.8 血清鐵濃度、總鐵結(jié)合力的測定

        血清樣品制備:血液于40 ℃靜置2 h左右,于 4 000 r/min 離心10 min后收集上層血清,-20 ℃冰箱過夜,次日血清解凍后再次低速(4 000 r/min)離心10 min,吸取上層液于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        血清鐵濃度及總鐵結(jié)合力(mg/L)的測定使用血清鐵、總鐵結(jié)合力試劑盒(福州先亞生物工程有限公司)。血清鐵濃度的檢測原理:在酸性溶液和還原劑的作用下,使轉(zhuǎn)鐵蛋白中鐵與蛋白分離,使血清中高鐵還原成亞鐵,后者與雙吡啶結(jié)合成粉紅色的絡(luò)合物,在一定范圍內(nèi),鐵離子的含量與色澤成正比??傝F結(jié)合力的檢測原理[5]:在血清內(nèi)加入過量的鐵,使血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白全部與鐵結(jié)合,再加入鐵吸附劑,將多余的鐵吸附,然后依據(jù)血清鐵檢測方法測定鐵含量,即為總鐵結(jié)合力。測定步驟具體參照試劑盒說明書,利用紫外分光光度計(TU-1900,北京普析通用儀器有限公司)測定,每個樣品重復(fù)檢測3次。

        1.9 肝臟鐵濃度的測定

        采用電感耦合等離子發(fā)射光譜法(簡稱ICP-AES)檢測肝臟鐵含量[5]:將肝臟樣品解凍后,用低溫0.9%生理鹽水沖洗干凈并用濾紙吸干水分,粉碎均勻后置于坩堝中,置于馬弗爐內(nèi),于600 ℃灼燒5 h,直至試樣呈白色或者灰白色、無炭粒為止。冷卻后取出,用5 mL體積比為1 ∶1的硝酸、水溶液溶解,電爐上加熱直至沸騰,過濾至50 mL容量瓶內(nèi),并用雙蒸水反復(fù)洗滌坩堝和濾紙,將洗滌液并入容量瓶中,然后用雙蒸水定容、混勻,作為試樣溶液。同時配制試劑空白液。采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(inductively coupled plasma-atomic emission specrometry,簡稱ICP-AES)儀(ICP-8000,北京達豐瑞儀器有限公司)測定,每個樣品重復(fù)檢測3次。

        1.10 肝臟鐵代謝相關(guān)基因表達特征分析

        根據(jù)紅龍魚hepc基因cDNA序列(基因登錄號:JQ308543)、il-6基因cDNA序列(基因登錄號:KJ757688)、jak3基因cDNA序列(基因登錄號:AF148993)與草魚stat3基因cDNA序列(基因登錄號:JX976548)設(shè)計引物,詳見表2[6-8]。采用RNAiso[寶生物工程(大連)有限公司]提取肝臟總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,在實時定量PCR儀(T-100,美國伯樂儀器有限公司)上進行實時熒光定量PCR。目的基因在肝臟中的相對表達量采用2分對照法確定,選擇紅龍魚18S rRNA基因作為內(nèi)參(基因登錄號:AB860236)[9]。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系:0.4 μL上下游引物,2 μL cDNA模板,7.2 μL ddH2O,總體積20 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 1 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,35個循環(huán)。溶解曲線溫度為52~99 ℃。每個樣品重復(fù)檢測3次。

        表2紅龍魚鐵代謝相關(guān)基因熒光定量PCR引物序列

        1.11 數(shù)據(jù)分析

        所有數(shù)據(jù)均用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用t檢驗法進行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著[10]。所有數(shù)值均表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌落特征

        從染病紅龍魚肝臟中分離出1株菌株AH,經(jīng)24 h營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)后呈黃色,濕潤圓形略隆起,邊緣整齊,直徑為2 mm左右,見圖1。

        2.2 生化反應(yīng)及鑒定結(jié)果

        菌株AH經(jīng)過分離純化后,用VITEK-32全自動微生物分析儀鑒定為嗜水氣單胞菌,其生理、生化特性見表3。

        2.3 嗜水氣單胞菌AH β-溶血性毒素因子ahh1和aerA的基因分析

        經(jīng)過多重PCR證實,從染病紅龍魚中分離得到的嗜水氣單胞菌AH攜帶ahh1和aerA基因。該細菌16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物(356個堿基對)、ahh1基因擴增產(chǎn)物(130個堿基對)、aerA基因擴增產(chǎn)物(309 bp)見圖2。

        表3菌株AH生理、生化特性

        注:“+”“-”分別表示陽性、陰性。

        2.4 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后其血清鐵濃度的變化

        嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后不同時間點血清中鐵濃度的變化趨勢如圖3所示。由圖3可以看出,侵染后不同時間點試驗組和對照組比較,紅龍魚血清鐵濃度均有不同程度的降低,侵染24、48 h后達到顯著水平(P<0.05)。

        2.5 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后其血清總鐵結(jié)合力的變化

        嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后不同時間點其血清中總鐵結(jié)合力的變化趨勢如圖4所示。由圖4可以看出,侵染后試驗組紅龍魚血液中血清的總鐵結(jié)合力和對照組比較略有不同程度的增加,但均未達到顯著水平。

        2.6 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后其肝臟鐵含量的變化

        由圖5可以看出,嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后不同時間點試驗組肝臟鐵含量均高于對照組,但并無顯著差異。

        2.7 嗜水氣單胞菌AH侵染紅龍魚后對其不同時間點hepc、il-6、jak3、stat3基因表達變化

        在注射嗜水氣單胞菌AH后,hepc基因在不同時間點表達量相對于0 h明顯上調(diào),在6、12、24 h與0 h差異顯著(P<0.05),在侵染后6 h達到最高值,隨后逐漸下降?;騣l-6在侵染后表達量明顯上調(diào),在24 h時表達量最高,隨后有所下降,在12、24、48 h均與0 h差異顯著(P<0.05);基因jak3、stat3的表達量亦均有所上調(diào),jak3基因在12 h時表達量達到最高值(P<0.05),stat3基因在6 h時的表達量達到最高值,隨后逐步下降,但仍明顯高于侵染前的表達水平,詳見圖6。

        3 結(jié)論與討論

        對染病紅龍魚肝臟取樣后進行細菌的劃線分離純化,在營養(yǎng)瓊脂平板上獲得形態(tài)一致的菌落,將該菌株編號為AH,由全自動細菌分析儀鑒定其為嗜水氣單胞菌。菌株AH人工感染紅龍魚試驗表明,出現(xiàn)的癥狀與自然病例基本相同,鑒定的菌株與接種菌株完全一致,所觀察到的菌落形態(tài)也基本相符。PCR是一種檢測病原體首選的方法,它具有顯著的優(yōu)點,如速度快、高敏感性和特異性等[5]。本研究使用特定的毒力因子引物來證實嗜水氣單胞菌AH攜帶氣溶素和溶血素基因。菌株AH具有β-溶血性嗜水氣單胞菌特征,能分泌具有溶血性、腸毒性和細胞毒性的外毒素,并能廣泛地侵襲健康紅龍魚腎、脾、肺、肝、肌肉和血液等器官組織,且能大量增殖,造成廣泛性出血、全身性組織損害,并使各器官組織出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、玻璃樣變、壞死崩解以及紅細胞碎裂。解剖后觀察均可見體表出現(xiàn)潰瘍、疤痕,嚴(yán)重的產(chǎn)生口鼻充血、流血,內(nèi)臟肝、脾、腎腫大,腸道充血,嚴(yán)重者有腹水。

        紅龍魚血液中鐵元素是機體內(nèi)多種酶類合成的必要元素,參與細胞增殖、分化和電子轉(zhuǎn)移等多種生命活動。鐵也是需鐵細菌增殖分化的必要元素,與致病菌毒力的強弱有關(guān)。細菌入侵宿主機體吸收鐵以滿足其增殖和致病力的表達。宿主通過降低機體鐵代謝水平,從而抑制細菌的增殖和降低其致病力。本試驗發(fā)現(xiàn),侵染嗜水氣單胞菌AH后紅龍魚血清鐵含量有所下降,24、48 h與對照差異達到顯著水平。肝臟鐵含量在侵染嗜水氣單胞菌AH后有所上升,但與對照的差異沒有達到顯著水平。這表明魚體在侵染后通過一系列調(diào)節(jié)作用,降低機體的鐵循環(huán)從而抑制細菌的侵害。侵染后紅龍魚血清總鐵結(jié)合力相對于對照組有所上升,沒有達到顯著水平。結(jié)合細菌侵染后魚體血清鐵含量的變化和轉(zhuǎn)鐵蛋白含量的變化,認為血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白的比例顯著下降可以提高鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合效率,從而抑制嗜水氣單胞菌AH從機體攝取鐵的能力。

        本試驗檢測發(fā)現(xiàn),紅龍魚肝臟hepc、il-6、jak3和stat3基因在嗜水氣單胞菌AH侵染后都有不同程度的上調(diào),表明這些基因都參與了魚體的非特異性免疫反應(yīng)。hepc基因主要在肝臟中合成和分泌,可以抑制腸道鐵的吸收和肝臟鐵的釋放以降低機體的鐵相關(guān)基因水平。前人研究證實,大菱鲆在侵染細菌嗜水氣單胞菌AH后,肝、脾、鰓等組織中hepc基因的表達量均顯著增高。侵染鏈球菌后,鱸魚肝細胞hepc的mRNA水平在數(shù)小時內(nèi)明顯上調(diào)。香魚肝臟中hepc基因表達量在侵染鰻利斯頓氏菌后顯著上升[11-12]。本試驗中,hepc基因在侵染后不同時間點的表達量均有所上升,并在12、24 h與0 h相比達到了顯著差異。機體受細菌侵害時,巨噬細胞等免疫細胞會合成和分泌大量的炎性因子,其中主要為白細胞介素6(il-6)。炎癥反應(yīng)可通過一系列生化過程調(diào)節(jié)hepc基因的表達,進而影響機體鐵相關(guān)基因水平。il-6和受體結(jié)合后可激活jak3基因,進而磷酸化stat3,進入細胞核,調(diào)節(jié)hepc基因的轉(zhuǎn)錄,促進hepc基因的表達。在本試驗中,在侵染嗜水氣單胞菌AH后紅龍魚肝臟中il-6的表達量均有所上升,在24 h時達到最高值?;騤ak3、stat3的表達量也均有所上調(diào),分別在6、12 h時達到最高值。因此,當(dāng)細菌入侵時,引起魚體發(fā)生炎癥反應(yīng),在il-6基因和JAK/STAT通路相關(guān)基因的共同作用下,hepc基因的表達量上升,從而下調(diào)魚體的循環(huán)鐵濃度,以應(yīng)對細菌的侵害。

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