劉夢(mèng)雪， 榮成博， 牛玉蓉， 宋 爽， 劉 宇， 陳青君

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所/北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京 100097)

亞側(cè)耳(Hohenbueheliaserotina)，別稱(chēng)元蘑、凍蘑、黃蘑等，隸屬于真菌門(mén)擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱傘菌目白蘑科側(cè)耳屬。亞側(cè)耳富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多種不飽和脂肪酸和微量元素，是一種高蛋白、低脂肪的健康食品。亞側(cè)耳分布于河北、黑龍江、吉林、廣西、陜北、四川等地，在吉林長(zhǎng)白山區(qū)自然分布較多，是東北地區(qū)著名的土特產(chǎn)[1]。由于長(zhǎng)期大量采摘，亞側(cè)耳野生存留量已逐年減少[2]。

食用菌種質(zhì)資源是優(yōu)良品種育種的基礎(chǔ)材料，育種成效除了取決于所掌握種質(zhì)資源的數(shù)量，還在很大程度上取決于對(duì)這些種質(zhì)資源多樣性的遺傳特性的掌握。分子標(biāo)記作為食用菌遺傳多樣性研究中的一個(gè)重要手段，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛[3]。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱(chēng)ISSR)是由Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種DNA標(biāo)記技術(shù)[4]，結(jié)合了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplification polymorphic DNA，簡(jiǎn)稱(chēng)RAPD)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，簡(jiǎn)稱(chēng)SSR)方法的優(yōu)點(diǎn)，是一種具有穩(wěn)定性和高重復(fù)性的分子標(biāo)記方法，被廣泛應(yīng)用于食用菌方向。馮偉林等利用11個(gè)ISSR引物對(duì)12個(gè)杏鮑菇生產(chǎn)性菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠?qū)⑿吁U菇菌株區(qū)分開(kāi)，并將12個(gè)杏鮑菇菌株聚為3個(gè)群，清晰地揭示了杏鮑菇菌株間的遺傳關(guān)系[5]。

序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，簡(jiǎn)稱(chēng)SRAP)是一種由美國(guó)加州大學(xué)Li等應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)[6]，該技術(shù)利用上游引物針對(duì)外顯子區(qū)域，下游引物針對(duì)內(nèi)含子區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，上游引物和下游引物自由結(jié)合，配對(duì)出不同的組合進(jìn)行反應(yīng)。許峰等利用9對(duì)SRAP引物對(duì)22個(gè)白色金針菇進(jìn)行聚類(lèi)分析，在相似系數(shù)為0.820水平時(shí)，將供試菌株分為五大類(lèi)，此技術(shù)揭示了北京地區(qū)金針菇菌株的遺傳多樣性[7]。

由于每個(gè)方法的開(kāi)發(fā)原理不同，聚類(lèi)分析結(jié)果通常會(huì)存在較大的差異，將多個(gè)分子標(biāo)記綜合運(yùn)用能最大地優(yōu)化聚類(lèi)分析結(jié)果[8]。劉婧宇等運(yùn)用ISSR、RAPD和SRAP對(duì)26株香菇進(jìn)行聚類(lèi)分析，綜合分析結(jié)果表明，供試菌株間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.49～0.97，在相似系數(shù)為0.61時(shí)，將26株香菇分為3個(gè)類(lèi)群[8]。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)收集到的亞側(cè)耳菌株進(jìn)行收集、保存，通過(guò)ISSR和SRAP分子標(biāo)記綜合分析，對(duì)19個(gè)亞側(cè)耳菌株進(jìn)行遺傳多樣性研究，以期為雜交育種中親本的選擇和種質(zhì)資源保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料 本研究所用菌株的名稱(chēng)及來(lái)源見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉(BD Difco)、蛋白胨(OXIOD)、維生素B1、分析純磷酸二氫鉀、硫酸鎂等化學(xué)試劑，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)北京化學(xué)試劑有限公司；2×TaqPCR MasterMix，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自西班牙Biowest公司；所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon)合成。

PDA綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3 g、蛋白胨5 g、維生素B110 mg，加水至1 000 mL。

表1供試菌株及其來(lái)源

1.1.3 儀器 主要儀器包括PCR儀(Eppendorf Mastercycler Gradient)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Labtech UV9100)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司，DYY-Ⅲ-12B)、電子分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5415R)、移液器(Eppendorf)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ISSR和SRAP分析 取在PDA平板上活化7～10 d的亞側(cè)耳菌種，刮取少量菌絲作為試驗(yàn)材料，DNA的提取參照許峰等的方法[9]，ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照馮偉林等的方法[10]；SRAP擴(kuò)增反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照邊銀丙等的方法[11]，所用引物見(jiàn)表2、表3。取7 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，按2%的量加入SYBR Safe DNA Gel Stain(Invitrogen)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照記錄。

表2ISSR分析用引物

1.2.2 數(shù)據(jù)處理及分析 在同一水平上將擴(kuò)增出的強(qiáng)帶或可分辨性好的弱帶均視為擴(kuò)增陽(yáng)性，并賦值“1”，將未擴(kuò)增出的條帶視為擴(kuò)增陰性，賦值“0”，用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。

表3SRAP分析用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株ISSR分析結(jié)果

以菌株JZB2121009、JZB2121011、JZB2121017為模板，篩選出13條擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、清晰、重復(fù)性好的ISSR引物(表2)。以提取的19個(gè)供試亞側(cè)耳菌株的基因組DNA為模板，使用經(jīng)過(guò)對(duì)不同引物的PCR擴(kuò)增篩選獲得的13條引物(表2)，在供試菌株上PCR產(chǎn)物的電泳效果較好，每個(gè)菌株都可以通過(guò)PCR擴(kuò)增出DNA條帶，且條帶穩(wěn)定、清晰、重復(fù)性好、分布合理。13條引物共擴(kuò)增出154條DNA片段，其中多態(tài)性條帶數(shù)為145個(gè)，平均多態(tài)性為94.2%(表4)。由圖1可以看出，不同引物擴(kuò)增出的DNA條帶數(shù)不等，其序列長(zhǎng)度多為200～5 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態(tài)信息。

2.2 供試菌株的SRAP分析結(jié)果

以提取的19個(gè)供試亞側(cè)耳菌株的基因組DNA為模板，使用經(jīng)過(guò)不同引物的PCR擴(kuò)增篩選獲得的13對(duì)引物(表3)，在供試菌株上PCR產(chǎn)物的電泳效果較好，每個(gè)菌株都可以通過(guò)PCR擴(kuò)增出DNA條帶，且條帶穩(wěn)定、清晰、重復(fù)性好、分布合理。13對(duì)引物共擴(kuò)增出147條DNA片段，其中多態(tài)性條帶數(shù)為140條，平均多態(tài)性為94.5%(表5)。

表4ISSR多態(tài)性

表5SRAP多態(tài)性

由圖2可見(jiàn)，不同引物擴(kuò)增出的DNA條帶數(shù)不等，其序列長(zhǎng)度大多為200～5 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態(tài)信息。

2.3 供試菌株聚類(lèi)分析結(jié)果

綜合26條(對(duì))引物擴(kuò)增出的301條DNA片段，其中多態(tài)性條帶285條，多態(tài)性達(dá)94.7%。用NTSYSpc 2.10軟件對(duì)19個(gè)亞側(cè)耳供試菌株進(jìn)行聚類(lèi)分析，獲得各菌株間的聚類(lèi)結(jié)果(圖3)。

3 結(jié)論與討論

筆者收集了不同地區(qū)的19個(gè)亞側(cè)耳菌株，并對(duì)其基因組DNA進(jìn)行ISSR、 SRAP擴(kuò)增和遺傳多樣性分析。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，19株亞側(cè)耳菌株間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.67～0.85。在相似系數(shù)為0.70時(shí)，可將19個(gè)供試菌株分為五大類(lèi)。

聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，4號(hào)、5號(hào)、12號(hào)和15號(hào)菌株均來(lái)自白河自然保護(hù)站的同一海拔、同一區(qū)域，在聚類(lèi)分析結(jié)果中也聚為一簇，說(shuō)明品種存在一定的地域性；野生馴化種18號(hào)、19號(hào)菌株與野生采集種14號(hào)菌株親緣關(guān)系較近，說(shuō)明18和19號(hào)菌株可能都是由同一個(gè)品種選育獲得的，且原始菌株與14號(hào)菌株為相近或相同品種；2號(hào)、17號(hào)菌株是來(lái)自相同地區(qū)的相同菌株，二者親緣關(guān)系很近，甚至可能同物異名，目前的聚類(lèi)分析手段暫不能區(qū)分，有待用更多的引物進(jìn)一步進(jìn)行篩選或利用其他分子標(biāo)記方法辨別；同樣來(lái)自白河自然保護(hù)站的14個(gè)菌株中，1號(hào)、2號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、12號(hào)和17號(hào)菌株均采集于椴樹(shù)倒木上，3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、14號(hào)和15號(hào)菌株均采集于蒙古櫟倒木上。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，品種間親緣關(guān)系與其生長(zhǎng)的環(huán)境并沒(méi)有直接聯(lián)系。

目前國(guó)內(nèi)利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)雙孢菇[12]、金針菇[13]、杏鮑菇[14]和黑木耳[15]等進(jìn)行遺傳多樣性分析的報(bào)道較多，但卻暫無(wú)對(duì)亞側(cè)耳品種進(jìn)行遺傳多樣性分析的報(bào)道。本研究對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)收集的19個(gè)亞側(cè)耳菌株進(jìn)行了遺傳多樣性的系統(tǒng)分析，對(duì)現(xiàn)有種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為下一步選取遺傳差異較大的亞側(cè)耳菌株進(jìn)行雜交育種工作打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]袁文斌，鄒 莉，趙寶山，等. 元蘑不同栽培種培養(yǎng)基的比較試驗(yàn)[J]. 中國(guó)食用菌，2009，28(4)：15-17.

[2]辛樹(shù)權(quán)，趙驥民，沈 永. 不同培養(yǎng)條件對(duì)元蘑菌絲生長(zhǎng)的影響[J]. 北方園藝，2013(10)：140-142.

[3]吳學(xué)謙，李海波，魏海龍，等. SCAR分子標(biāo)記技術(shù)在香菇菌株鑒定上的應(yīng)用研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2005，24(2)：259-266.

[4]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) -anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomics，1994，20(2)：176-183.

[5]馮偉林，蔡為明，金群力，等. ISSR分子標(biāo)記分析杏鮑菇菌株遺傳差異研究[J]. 中國(guó)食用菌，2009，28(1)：47-49.

[6]Li G，Quiros C F. Sequence -related amplified polymorphism (SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging inBrassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103(2/3)：455-461.

[7]許 峰，劉 宇，王守現(xiàn)，等. 北京地區(qū)白色金針菇菌株的SRAP分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(10)：55-59.

[8]劉靖宇，宋秀高，葉 夏，等. 香菇菌株遺傳多樣性ISSR、RAPD和SRAP綜合分析[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2011，18(3)：1-8.

[9]許 峰，劉 宇，王守現(xiàn)，等. 一種適于PCR反應(yīng)的快速提取食用菌基因組DNA的方法[J]. 生物技術(shù)，2011，21(1)：43-44.

[10]馮偉林，蔡為明，金群力，等. ISSR分子標(biāo)記分析杏鮑菇菌株遺傳差異研究[J]. 中國(guó)食用菌，2009，28(1)：47-49.

[11]邊銀丙，宋小亞. 幾種新型DNA分子標(biāo)記及其在食用菌研究中的應(yīng)用[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，2006，13(1)：78-81.

[12]顧 敏，沈穎越，金群力，等 .雙孢蘑菇SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其在遺傳多樣性分析中的應(yīng)用[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25(5)：987-993.

[13]宿紅艷，王 磊，明永飛，等. ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在金針菇菌株鑒別中的應(yīng)用[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2008，27(10)：1725-1728.

[14]譚秀梅，李 永，樸春根，等. 杏鮑菇遺傳多樣性的SRAP和ITS分析[J]. 農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32(12)：110-115.

[15]馬慶芳，張介馳，張丕奇，等. 用ISSR分子標(biāo)記鑒別黑木耳生產(chǎn)菌株的研究[C]. 武漢：全國(guó)食用菌中青年專(zhuān)家學(xué)術(shù)交流會(huì)，2006.