張傳麗， 高明俠， 董玉瑋， 王 陶， 李同祥， 高兆建

(1.徐州工程學(xué)院江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221008；2.徐州工程學(xué)院江蘇省食品安全生物芯片檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221008)

3-羥基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3-HP)是一種具有3個(gè)碳原子的非手性液態(tài)有機(jī)酸，是一種重要的化學(xué)中間體，是很多光學(xué)活性物質(zhì)的合成前體，具有重大的開(kāi)發(fā)價(jià)值[1-2]。傳統(tǒng)的化學(xué)合成法生產(chǎn)3-HP常具有能耗高、污染大、副產(chǎn)物多、分離困難等缺點(diǎn)，而生物方法生產(chǎn)3-HP則可以有效地避免這些不利因素，因此采用生物方法制備3-HP成為現(xiàn)在國(guó)際上最注目的研究熱點(diǎn)之一[3]。

乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)是一種廣泛存在于原核生物和真核生物中的氧化還原酶，可將多種脂肪族醛和芳香族醛氧化生成相應(yīng)的脂肪族酸和芳香族酸[4-5]。ALDH是微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-HP過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，具有重要的研究意義。

本研究以釀酒酵母中的ALDH為對(duì)象，將從釀酒酵母中克隆到的ALDH基因連接到pET30a(+)表達(dá)載體中，構(gòu)建ALDH基因的原核表達(dá)載體，得到含有pET30a-ALDH重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因菌株，并分析不同培養(yǎng)條件下ALDH催化反應(yīng)的活性差異。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliDH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)買自上海邁其生物科技有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) W303-1A來(lái)源于山東大學(xué)鮑曉明教授實(shí)驗(yàn)室；pMD18-T克隆載體購(gòu)買自寶生物工程(大連)有限公司；pET30a(+)表達(dá)載體來(lái)源于江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。

1.2 酶和試劑

BamHⅠ、SacⅠ、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker等購(gòu)買自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒購(gòu)買自北京艾德萊生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：酵母膏1%(質(zhì)量濃度)，蛋白胨2%(質(zhì)量濃度)，葡萄糖2%(質(zhì)量濃度)；LB培養(yǎng)基：酵母膏0.5%(質(zhì)量濃度)，蛋白胨1%(質(zhì)量濃度)，NaCl 1%(質(zhì)量濃度)。

1.4 重組質(zhì)粒pET30a-ALDH構(gòu)建

以釀酒酵母基因組DNA為模板、以Primer-F和Primer-R為引物進(jìn)行釀酒酵母ALDH基因克隆。其PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1釀酒酵母ALDH基因PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化成功的pMD18-T-ALDH重組質(zhì)粒。其菌落PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表2pMD18-T-ALDH重組質(zhì)粒菌落PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 s。

pMD18-T-ALDH重組質(zhì)?；厥蘸螅M(jìn)行BamHⅠ 和SacⅠ雙酶切；酶切產(chǎn)物回收、純化之后連接到同樣雙酶切、純化后的pET30a(+)載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α和BL21(DE3)，經(jīng)PCR檢測(cè)、酶切和測(cè)序驗(yàn)證ORF正確的克隆用于ALDH蛋白表達(dá)。

1.5 乙醛脫氫酶活力測(cè)定

ALDH酶催化反應(yīng)液成分見(jiàn)表3。

表3ALDH酶催化反應(yīng)液成分

將0.5 mL酶液與1 mL上述反應(yīng)液混合，反應(yīng)體系在 25 ℃ 下保溫5 min，在340 nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度[8-11]。

酶活單位定義：標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，1 min催化生成1 mmol NADH所需要的酶量被定義為1個(gè)活力單位(U)。

1.6 ALDH在Escherichia coli BL21(DE3)中的表達(dá)

將含重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株接種單菌落于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素30 μg/L)中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)10～12 h 至菌液D600 nm值達(dá)到0.6～0.9后，分別加入終濃度為 0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于150 r/min條件下進(jìn)行ALDH酶蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度分別為28 ℃和 37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間分別為0、2、4、6、8 h。離心收集菌體，稱量菌體濕質(zhì)量。

1.7 大腸桿菌細(xì)胞的破碎

取0.5 g濕菌體，懸浮于含2 mmol/L的二硫蘇糖醇的 10 mL 磷酸緩沖液中，冰上超聲波破碎菌體(功率400 W，工作2 s，間隔3 s，40次)，8 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液，即為ALDH粗酶液[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以釀酒酵母W303-1A基因組DNA為模板、以Primer-F和Primer-R為引物，進(jìn)行釀酒酵母ALDH基因的PCR克隆，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)中克隆得到的條帶大小與預(yù)期的基因片段大小一致，約1.6 kb，如圖1所示。

將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后，連接到pMD18-T克隆載體上，轉(zhuǎn)化，并將得到的pMD18-T-ALDH重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和SacⅠ雙酶切驗(yàn)證(圖2)。

將測(cè)序正確的pMD18-T-ALDH重組質(zhì)粒用BamHⅠ和SacⅠ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，將回收產(chǎn)物與經(jīng)BamHⅠ和SacⅠ 雙酶切的pET30a(+)表達(dá)載體相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR篩選(圖3)后，將篩選得到的陽(yáng)性單菌落送樣測(cè)序，得到含有與文獻(xiàn)報(bào)道的ALDH基因大小一致的E.coliBL21(pET30a-ALDH)重組菌株。

2.2 不同IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)濃度對(duì)乙醛脫氫酶活性的影響

挑取轉(zhuǎn)化成功的E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株的少量菌體于LB液體培養(yǎng)基(含30 μg/L卡那霉素)中 37 ℃、180 r/min培養(yǎng)10～12 h至菌液D600 nm值達(dá)到0.6～0.9 后，分別加入終濃度為0、0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，然后于28 ℃ 150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后，測(cè)定誘導(dǎo)產(chǎn)生的ALDH酶蛋白的催化活性，結(jié)果如圖4所示。以相同條件下培養(yǎng)的E.coliBL21(pET30a)為對(duì)照。

從圖4中可明顯看出，E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株在IPTG誘導(dǎo)濃度增加時(shí)，ALDH酶催化的相對(duì)活性也在逐步增大，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度為1.0 mmol/L時(shí)，ALDH酶催化的相對(duì)活性是最高的，可達(dá)30.2 U/mL。

本試驗(yàn)中的對(duì)照菌株E.coliBL21(pET30a)也檢測(cè)到了一定的乙醛脫氫酶催化反應(yīng)活性，說(shuō)明E.coliBL21(DE3)細(xì)胞中是攜帶有醛脫氫酶基因的，這與其他研究者的研究結(jié)果[8，10]是一致的。

2.3 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)乙醛脫氫酶活性的影響

E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.9后，加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG，然后于28 ℃、150 r/min條件下分別誘導(dǎo)培養(yǎng)0、2、4、6、8 h后，測(cè)定誘導(dǎo)產(chǎn)生的ALDH酶蛋白的催化活性，測(cè)定結(jié)果如圖5所示。以相同條件下培養(yǎng)的E.coliBL21(pET30a)為對(duì)照。

從圖5中可明顯看出，28 ℃、150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，ALDH酶催化的相對(duì)活性越高，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h時(shí)，ALDH的相對(duì)酶活性達(dá)到最高，高達(dá)30.2 U/mL，其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)2 h之內(nèi)，ALDH的相對(duì)酶活性增長(zhǎng)最快；6 h后，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，ALDH的相對(duì)酶活性反而有所下降，其原因可能是ALDH酶活性半衰期較短，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)的ALDH酶蛋白部分被降解或失活。

2.4 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)乙醛脫氫酶活性的影響

E.coliBL21(pET30a-ALDH)菌株于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.9后，加入終濃度1.0 mmol/L的IPTG，分別于28 ℃、150 r/min和37 ℃、150 r/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后測(cè)定誘導(dǎo)產(chǎn)生的ALDH的酶催化活性。分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28 ℃時(shí)，ALDH酶的相對(duì)活性明顯高于誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)的相對(duì)活性(圖6)，其原因可能是誘導(dǎo)溫度升高時(shí)，產(chǎn)生的包涵體增多，使得可溶性的ALDH濃度降低，或者ALDH酶對(duì)溫度很敏感，高溫使部分酶失活或鈍化了。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先通過(guò)PCR技術(shù)從釀酒酵母基因組DNA中克隆得到長(zhǎng)度約1.6 kb的乙醛脫氫酶基因的ORF序列，并將其連入pET30a(+)表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了釀酒酵母乙醛脫氫酶基因的原核表達(dá)載體；同時(shí)對(duì)構(gòu)建的釀酒酵母乙醛脫氫酶基因的原核表達(dá)載體在宿主細(xì)胞大腸桿菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)的乙醛脫氫酶催化活性受到誘導(dǎo)物IPTG濃度、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度的影響，當(dāng)IPTG濃度為1.0 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為6 h、誘導(dǎo)溫度為 28 ℃ 時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)出的乙醛脫氫酶相對(duì)酶活性最高，可達(dá)30.2 U/mL。目前本課題組正在對(duì)釀酒酵母ALDH基因進(jìn)行突變?cè)囼?yàn)，期望能得到活性更高、耐適性更好的ALDH酶，以提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)3-HP的效率。

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