龍凌云， 毛立彥， 黃壽輝， 檀小輝， 於艷萍， 郝小玲， 龐新華

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001)

花是果樹極為重要的生殖器官之一，而花芽分化是果樹由營養(yǎng)生長向生殖生長轉變的重要階段，對果樹的成花過程、花數(shù)量和坐果率起著關鍵作用?；ㄑ糠只脑缤砗唾|量對農林業(yè)果樹生產(chǎn)的產(chǎn)量、質量有重要影響[1]。溫度是誘導植物花芽分化的關鍵環(huán)境因子之一，落葉果樹通常要經(jīng)歷一個較低溫度的積累量(即需冷量)才能夠正常誘導花芽分化和開花，需冷量不足通常會導致果樹花芽分化不完整，花器官畸形或嚴重敗育[2-3]。落葉果樹花芽分化機制研究起步較晚，相關研究成果主要借鑒擬南芥等模式植物的研究。植物開花有4條不同途徑，分別是依賴光周期的開花途徑、自主開花途徑、依賴春化的開花途徑和赤霉素途徑[4]。FLC(FLOWERINGLOCUSC)基因屬于MADS-box基因家族成員，在植物開花過程中具有重要作用[5]。在擬南芥中，低溫通過對AtFLC基因的轉錄及蛋白表達水平進行負調控，從而調控擬南芥花芽分化和成花過程[6]。

藍莓(Vacciniumspp.)是一種具有獨特保健作用和高營養(yǎng)價值的落葉果樹，具有廣闊的國際市場和發(fā)展?jié)摿?，我國?0世紀80年代開始開展藍莓引種和商業(yè)化栽培，現(xiàn)已推廣至東北三省、山東、浙江、云南、貴州、廣東等多個省、區(qū)，栽培范圍呈現(xiàn)由溫帶向亞熱帶、熱帶地區(qū)發(fā)展的趨勢[7-8]。藍莓作為一種溫帶落葉果樹，通過低溫春化作用達到足量需冷量是保證其花芽正常分化并提高其農林業(yè)產(chǎn)量、質量的關鍵[9-11]。近年來，國內相關科研院所和高校已經(jīng)從引種栽培特性、形態(tài)結構、逆境脅迫響應等方面對溫度如何影響藍莓花芽分化的形態(tài)和生理生化機制開展了一系列研究[12-16]，但是關于低溫調控藍莓花芽分化的春化途徑的分子機制研究較少，尤其是FLC基因響應溫度變化調控花芽分化的春化途徑分子機制方面的研究尚未見報道。

目前，隨著多種模式植物全基因組測序的完成，眾多分子相關數(shù)據(jù)庫[如表達序列標簽(expressed sequence tag，簡稱EST)數(shù)據(jù)庫]的建立以及各類生物信息學軟件的開發(fā)和應用，使借助生物信息學手段對植物FLC基因進行電子克隆、結構和功能預測分析與分子進化分析等研究，以及在較短時間內和較低成本下獲取大量可靠的基因、 蛋白結構與功能信

息成為可能。電子克隆技術是以物種EST、核酸序列和蛋白質等數(shù)據(jù)庫為基礎，選擇相應的生物信息學軟件，不斷對EST序列進行相似性比對、聚類分析、組裝拼接和序列延伸，以期快速獲取功能基因的方法，具有成本低、速度快、技術要求低和針對性強等特點[17-18]，可為新基因的結構分析、功能鑒定等分子生物學研究帶來很大便利。目前，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)等模式植物中的電子克隆方法應用已有較多成功先例，但在藍莓中尚未見報道。本研究基于前人研究方法和藍莓EST數(shù)據(jù)庫，以已知的擬南芥FLC基因編碼蛋白序列(GenBank登錄號：AAN04056.1)作為探針，采用電子克隆方法獲取1個藍莓FLC基因，并對其進行相關生物信息學和系統(tǒng)進化分析，為進一步研究藍莓FLC基因及其編碼蛋白在低溫調控的春化途徑下如何參與藍莓花芽分化和成花的分子機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以在美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology information，簡稱NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊的擬南芥FLC基因編碼蛋白序列(GenBank登錄號：AAN04056.1)為探針，采用電子克隆方法獲得藍莓FLC基因。

1.2 方法

1.2.1 電子克隆獲得藍莓FLC基因和開放閱讀框預測 以擬南芥FLC基因編碼蛋白序列(GenBank登錄號：AAN04056.1)為探針序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中運用tBLASTn工具，搜索藍莓EST序列數(shù)據(jù)庫。選擇BLAST獲得的相似性較高的藍莓EST序列，利用DNAStar軟件進行序列拼接，將拼接后的序列作為探針反復搜索藍莓EST數(shù)據(jù)庫，并進行序列拼接，直至序列無法延伸，最后獲得的序列即為電子克隆得到的藍莓FLC基因。利用NCBI提供的ORF Finder軟件，根據(jù)標準遺傳代碼(the genetic codes)預測藍莓FLC基因的開放閱讀框(open reading frame，簡稱ORF)。

1.2.2 藍莓FLC基因編碼蛋白序列的生物信息學分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取擬南芥、葡萄(Vitisvinifera)、柑橘(Poncirustrifoliata)、可可樹(Theobromacacao)、白樺(Betulaplatyphylla)、梨樹(Pyruspyrifolia)等19種植物FLC基因，利用CLUSTAL X 2.0將它們的編碼蛋白與藍莓FLC基因編碼蛋白進行多重序列比對，在GeneDOC中查看它們的蛋白保守序列。使用ProtParam在線軟件分析藍莓FLC基因編碼蛋白的理化性質；使用Protscal在線軟件分析蛋白親/疏水性；使用SOPMA在線軟件預測分析蛋白二級結構；使用SWISS-MODEL在線軟件預測蛋白的三級結構，并用SPDBV軟件查看預測的蛋白三級結構，進行Ranachandran檢測。相關在線分析軟件的名稱和網(wǎng)址見表1。

表1在線分析軟件的名稱和網(wǎng)址

1.2.3 藍莓VaFLC蛋白相似性及系統(tǒng)進化分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取擬南芥、葡萄、柑橘、可可樹、白樺、梨樹等19種植物的FLC基因，用MEGA5.0軟件對它們的編碼蛋白序列和藍莓FLC基因編碼蛋白序列進行相似性比對，采用最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進行Bootstrap校正。

2 結果與分析

2.1 藍莓FLC基因的獲取和ORF預測

以擬南芥FLC基因的編碼蛋白序列作為探針，在NCBI中的藍莓EST數(shù)據(jù)庫中進行tBLASTn檢索，獲得26條相似性較高的EST片段，刪除冗余序列后剩下12條。利用DNAStar軟件對篩選出的EST序列進行拼接，獲得1個contig重疊群，將獲得的contig進行重復搜索、拼接，最終電子克隆出1條完整的藍莓FLC類基因序列，該基因cDNA全長為1 303 bp，包含1個753 bp的ORF框，起始密碼子位點為第 311 bp 處，終止密碼子位點為第1 063 bp處，編碼250個氨基酸(圖1)，編碼蛋白命名為VaFLC。

2.2 藍莓VaFLC蛋白理化性質分析

藍莓VaFLC蛋白一級結構分析結果顯示，該蛋白分子量為2.908 08 ku， 等電點為7.08， 分子式為C1267H2004N368O394S12，含量最豐富的前5種氨基酸分別為亮氨酸(簡稱Leu，12.0%)、谷氨酰胺(簡稱Gln，10.4%)、谷氨酸(簡稱Glu，9.6%)、絲氨酸(簡稱Ser，7.6%)和賴氨酸(簡稱Lys，6.8%)。

2.3 藍莓VaFLC蛋白保守序列、親/疏水性、二級結構和三級結構預測分析

植物FLC類基因屬于MADS-box基因家族中的重要成員[19-20]，目前已知的植物MASD-box基因產(chǎn)物絕大多數(shù)屬于植物Ⅱ型MADS-box基因，該類型基因編碼蛋白主要有4個部分組成，分別是MEF2-like MADS域、I域、K域和C域[21]。藍莓VaFLC蛋白保守序列分析(圖2)、親/疏水性預測和二級結構預測結果(圖3)表明，藍莓VaFLC蛋白在N端第1～56aa位置的氨基酸殘基組成1個最高保守序列區(qū)域，且該區(qū)域與其他物種FLC蛋白的相似性高于90%；VaFLC蛋白在第85～156aa位置的氨基酸殘基大多數(shù)為疏水性，與其他物種FLC蛋白類似位置的氨基酸具有一定的保守性，并且該段氨基酸殘基在二級結構上可形成3個連續(xù)的α-螺旋二級結構(圖4)；此外，第57～84aa位置的氨基酸和C端第157～250aa位置的氨基酸殘基與其他植物FLC蛋白相似位置的相似性較差，且C端多數(shù)由疏水性氨基酸殘基構成。上述研究結果表明，藍莓FLC基因編碼的VaFLC蛋白符合植物Ⅱ型MADS-box基因編碼蛋白的結構特征。此外，二級結構預測分析結果顯示，藍莓VaFLC蛋白中α-螺旋(alpha helix)占50.8%，無規(guī)則卷曲(random coil)、延伸鏈(extended strand)、β轉角(beta turn)分別占22.4%、15.6%、11.2%，其中α-螺旋二級結構最多，這可能與VaFLC蛋白含有K域這一特殊的保守結構域有關。以擬南芥(Arabidopsisthaliana)中SEPALLATA3蛋白的X晶體衍射結構[22][分子模型數(shù)據(jù)庫(MMDB)身份編號(ID)：124051)]作為模板，在SWISS-MODEL服務器上預測藍莓VaFLC蛋白部分片段的三級結構。經(jīng)序列比對，VaFLC蛋白與模版SEPALLATA3的相似性為61.63%，符合進行同源建模的要求[23]，說明檢索得到的SEPALLATA3晶體結構可作為預測的VaFLC蛋白同源建模模版。由圖5可知，同源建模構建的VaFLC蛋白在第89～174aa位置的氨基酸殘基形成的空間結構，主鏈二面角Φ、Ψ落于虛線內中心區(qū)域的氨基酸殘基在95%以上，落于黑線之外的主鏈二面角Φ、Ψ不足5%，絕大多數(shù)主鏈二面角Φ、Ψ均在正常范圍內，僅有少量氨基酸殘基的二面角Φ、Ψ落于不合理區(qū)域。理論分析表明，本試驗所構建的VaFLC蛋白部分片段的空間結構是合理可靠的?；诶蠄D檢測結果，由圖6可知，VaFLC蛋白的部分蛋白片段預測三維結構主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲結構構成，這符合二級結構預測中關于VaFLC蛋白保守結構K域的特征，進一步說明本研究的電子克隆的基因屬于植物FLC類基因。

2.4 藍莓VaFLC蛋白的相似性和進化地位分析

利用NCBI中BLASTp程序，將藍莓VaFLC蛋白序列與擬南芥等19種植物中已知的FLC蛋白序列進行同源比對。表2結果表明，VaFLC蛋白與其他植物的FLC蛋白具有廣泛的相似性，除與大豆的相似性為38%外，與其他15種植物的FLC蛋白都具有高于40%的相似性，其中與葡萄、柑橘具有47%的相似性，與擬南芥、可可樹、白樺具有46%的相似性，與梨樹具有45%的相似性；此外，VaFLC蛋白與這19種植物FLC蛋白在N端前56個氨基酸序列的相似性高于90%，推測它們在N端的序列具有較高同源性， 可能與它們含有相同的保守結構域有關。

表2VaFLC與19種植物FLC的相似性比較結果

為了分析藍莓VaFLC蛋白與其他植物中已知FLC蛋白之間的進化關系，筆者選取擬南芥、葡萄、柑橘、白樺、可可樹、梨樹等19種植物的FLC蛋白進行同源比對，構建系統(tǒng)進化樹。由圖6可知，參與比對的植物FLC蛋白在被子植物的進化過程中，最初形成2個分支，分別是草本植物分支、木本植物分支。其中，擬南芥、芥菜、白芥、鹽芥、山萮菜、蘿卜、甘藍和蘿卜的FLC蛋白在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚集于同一分支，均屬于十字花科植物，而大豆FLC蛋白在草本植物方向獨立分支與十字花科植物并列。在木本植物的進化方向上，山核桃、胡桃、茶樹和梨樹在同一分支，柑橘、娑羅雙和可可樹在同一分支，而葡萄、白樺、咖啡樹和藍莓的FLC蛋白分別形成獨立分支，推測藍莓FLC基因在進化過程中還保留了部分原始特征。

3 討論與結論

植物FLC基因屬于MADS-box基因家族中的重要成員，在低溫需求型植物(如落葉植物)花芽分化和成花過程中起著關鍵作用，低溫可對該類基因的轉錄及編碼蛋白表達水平進行負調控，從而促進植物開花[24-25]。本研究基于藍莓EST數(shù)據(jù)庫，運用電子克隆方法獲得1個cDNA全長 1 303 bp，包含1個753 bp開放閱讀框，編碼250個氨基酸的藍莓FLC基因。該基因編碼蛋白在N端含有1個由56個氨基酸殘基構成的高度保守結構域(MEF2-like MADS域)，是MADS-box基因家族中植物Ⅱ型(MIKC型)的特征序列之一，可作為序列特異的DNA結合單元[26]，亦可參與MADS-box蛋白二聚化從而增強調控蛋白結構的多樣性和增加靶標基因的多樣性與特異性[27-28]；生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白還含有1個半保守的K域，現(xiàn)有研究表明，MADS-box蛋白的K域結構具有調節(jié)蛋白間相互作用的功能[29]。親/疏水性預測結果顯示，該區(qū)域氨基酸殘基主要由疏水性殘基構成，二級結構預測結果顯示，該區(qū)域可形成3個連續(xù)的 α-螺旋區(qū)，分別為K1、K2和K3區(qū)，通過對藍莓VaFLC蛋白的三級結構進行預測分析，進一步表明VaFLC蛋白在K域中確實含有大量α-螺旋，符合植物Ⅱ型(MIKC型)MADS-box基因編碼蛋白的序列特征。此外，藍莓VaFLC蛋白的C端是最不保守的區(qū)域，主要由疏水性氨基酸殘基構成，僅含有少量保守序列。已有研究表明，MADS-box基因編碼蛋白的C端區(qū)域的變化是由進化造成的[30-31]，這些序列主要參與蛋白復合體形成和轉錄激活的過程，推測其多樣性變化決定了MADS-box基因編碼蛋白的功能多樣性。

MADS-box基因家族成員起源于同一祖先型基因[32]，在進化過程中大量的基因重復事件產(chǎn)生了MADS-box基因的2個譜系Ⅰ型(TypeⅠ)和Ⅱ型(TypeⅡ)，其中Ⅰ型又分為SRF型基因、植物Ⅰ型基因，Ⅱ型又分為MEF2型基因、植物Ⅱ型(MIKC型)[33]。因此，植物FLC基因及其編碼蛋白在核酸和氨基酸水平上存在高度保守性和相似性。本研究結果顯示，藍莓FLC基因編碼VaFLC蛋白與其他植物中FLC蛋白的相似性均高于40%，其中N端MEF2-like MADS保守結構域中的氨基酸序列相似性比對結果均高于90%，進一步表明植物FLC基因在早期存在一個共同的祖先型基因，而C端不保守結構域的多樣性變化，可能是由植物Ⅱ型(MIKC型)基因進化形成的。系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，植物FLC基因編碼蛋白分為木本植物、草本植物2個分支，藍莓FLC基因編碼VaFLC蛋白位于木本植物分支上，并與葡萄、白樺和咖啡樹的FLC蛋白分別形成獨立分支，推測植物FLC基因早期起源于同一個被子植物祖先，藍莓FLC基因至今仍處于較原始狀態(tài)。

本研究基于藍莓EST數(shù)據(jù)庫，運用電子克隆成功獲得藍莓FLC基因，并對其氨基酸序列從結構組成、理化性質、高級結構和系統(tǒng)進化等方面進行了預測和分析，研究結果為進一步試驗克隆藍莓FLC基因及探究其基因和編碼蛋白的結構與功能奠定了基礎。

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