柯長洪

摘 要：隨著納米技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，納米材料用于核酸藥物遞送具有廣泛的應(yīng)用前景。核酸分子（質(zhì)粒DNA、反義寡核苷酸和小分子干擾RNA）在細(xì)胞中以可控的方式進(jìn)行表達(dá)，其在未來疾病的治療和機(jī)制研究中起著非常重要的作用，包括基因治療，基因疫苗以及小分子干擾RNA對細(xì)胞功能及信號干擾的研究。然而， 由于核酸藥物自身負(fù)電荷性與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜產(chǎn)生排斥作用，游離核酸很難進(jìn)入到靶細(xì)胞中發(fā)揮作用?；诩{米材料攜帶核酸遞送主要瓶頸在于既能高效、特異性的將核酸藥物遞送到靶細(xì)胞中同時(shí)又不會對機(jī)體產(chǎn)生毒副作用和引起免疫原性。本綜述對近年來用于核酸藥物遞送所面臨的挑戰(zhàn)和陽離子脂質(zhì)體的設(shè)計(jì)原則及其應(yīng)用進(jìn)行闡述。同時(shí)對開發(fā)新的陽離子脂質(zhì)體用于臨床核酸藥物遞送提供一定的借鑒。

關(guān)鍵詞：核酸遞送；陽離子脂質(zhì)體；納米材料；非病毒載體

1、前 言

本文對核酸遞送過程中所面臨的障礙以及陽離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)特征包括親水性頭、疏水性尾以及兩者之間的鏈接鍵linker對細(xì)胞轉(zhuǎn)染影響和細(xì)胞毒性進(jìn)行綜述，為合成新的陽離子脂質(zhì)體在體內(nèi)外用于核酸遞送提供一定借鑒意義。

2. 核酸治療中主要障礙

2.1細(xì)胞外遞送（Extracellular delivery）

納米載體包裹核酸藥物遞送到病灶部位進(jìn)行靶向治療，能夠避免裸核酸（DNA/RNA）在血液循環(huán)過程中被酶水解，提高基因治療效果。外源性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后，很容易受到由單核巨噬細(xì)胞組成的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）排出體外。

2.2 細(xì)胞攝?。–ell Targeting and uptake ）

核酸藥物只有在細(xì)胞內(nèi)才能有效地發(fā)揮作用，包裹核酸藥物的納米粒子即使成功逃脫網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞捕獲而未能將藥物分子傳輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，同樣很難取得比較好的治療效果。細(xì)胞對納米粒子的吸收主要通過網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白介導(dǎo)的胞飲，巨胞飲和吞噬作用和網(wǎng)格/小窩非依賴性的內(nèi)吞。

2.3 內(nèi)涵體釋放（endosome release）

外源性物質(zhì)通過內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞膜表面相關(guān)的蛋白進(jìn)行融合依次形成初級內(nèi)涵體、早期內(nèi)涵體、晚期內(nèi)涵體、自噬體以及自噬溶酶體等。一旦攜帶有核酸的納米粒子通過內(nèi)吞進(jìn)入自噬溶酶體后，在溶酶體內(nèi)低pH值和各種蛋白水解酶作用下，核酸就會被降解排出體外從而使核酸藥物失效。

3. 納米工程化陽離子脂質(zhì)體用于核酸藥物遞送

基于納米材料包裹核酸藥物遞送所存在的以上障礙，能夠用于細(xì)胞內(nèi)核酸遞送的納米材料必須具備以下優(yōu)勢：第一，能夠保護(hù)核酸藥物免于核酸酶的降解；第二，有助于核酸跨過細(xì)胞膜后能夠順利從早期內(nèi)涵體中逃離出來進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中；第三，具有良好的生物相容性，對細(xì)胞和機(jī)體毒副作用低；第四，在血液中能夠長效循環(huán)而不被網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞捕獲從而提高藥物的利用度；第五，靶向性強(qiáng)，避免非特異性吸附以及為了達(dá)到治療效果而提高的藥物濃度所產(chǎn)生的細(xì)胞毒副作用。

3.1 親水性頭陽離子脂質(zhì)體對細(xì)胞轉(zhuǎn)染影響

相對病毒載體而言，非病毒載體最大的不足就是轉(zhuǎn)染效率低，為了盡可能提高陽離子作為基因載體的轉(zhuǎn)染效率，目前普遍采用的是季銨鹽陽離子親水性頭，因?yàn)槠湓谌魏稳芤簆H值環(huán)境下均帶正電荷能夠促進(jìn)細(xì)胞對陽離子脂質(zhì)體的內(nèi)吞。有研究表明，在親水性季銨鹽頭上用帶羥基的烷基取代原來的甲基之后，其轉(zhuǎn)染效率顯著增強(qiáng)達(dá)到甚至超過市售lipo2000的轉(zhuǎn)染效率。另外，有研究表明在季銨鹽頭上引入兩個(gè)甚至三個(gè)羥基烷基頭不僅有助于提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)由于引入更強(qiáng)親水性基團(tuán)導(dǎo)致的細(xì)胞毒性會降低。

3.2 疏水性尾對細(xì)胞轉(zhuǎn)染影響

作為陽離子脂質(zhì)體另一個(gè)重要組成部分疏水性鏈，其結(jié)構(gòu)影響著脂質(zhì)體相轉(zhuǎn)變溫度、與中性脂質(zhì)體DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺）形成納米脂質(zhì)體雙層膜流動(dòng)性及穩(wěn)定性、DNA免于酶的降解、內(nèi)涵體的逃逸、DNA的釋放和核膜的穿透，還有細(xì)胞毒性等，而所有這些因素都會直接決定合成的陽離子脂質(zhì)體能否用于核酸遞送，轉(zhuǎn)染效率有多高以及目的基因最終表達(dá)水平。因此，對疏水鏈的鏈長、疏水鏈的數(shù)目、鏈的種類（脂肪鏈和類固醇鏈），鏈的飽和度如何影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)行了討論。

脂肪鏈中含有的不飽和鍵對轉(zhuǎn)染效果有著顯著影響。Koynova合成了兩種陽離子脂質(zhì)體用于DNA遞送，這種脂質(zhì)體區(qū)別在于一個(gè)是使用帶有不飽和鍵的的油酸作為疏水鏈，而另一種則是含有飽和烴的硬脂酸作為疏水鏈，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有油酸的陽離子脂質(zhì)體遞送DNA能力顯著優(yōu)于硬脂酸陽離子脂質(zhì)體。不飽和脂肪鏈陽離子脂質(zhì)體不足之處就在于穩(wěn)定性比較差，含有的不飽和鍵容易被氧化而不能長期保存。

3.3 鏈接親水性頭和疏水性尾巴linker對細(xì)胞轉(zhuǎn)染影響

在所有陽離子脂質(zhì)體中連接親水性頭和疏水鏈尾的鏈接鍵幾乎都包含了醚鍵、酯鍵、酰胺鍵、氨基甲酸酯鍵以及二硫鍵。這些鏈接鍵主要是通過影響陽離子脂質(zhì)體對細(xì)胞和組織的生物毒性，從而降低陽離子脂質(zhì)體對靶細(xì)胞和組織的轉(zhuǎn)染效果。例如含有醚鍵的DOTMA（N-1-（2，3-二油酰氧基）丙基-N，N，N-三甲基氯化銨）雖然轉(zhuǎn)染效率比較高，但是由于脂質(zhì)體中含有的醚鍵難以降解對細(xì)胞的毒性比較大；而將其中的醚鍵換成酯鍵后的DOTAP（（2，3-二油?；?丙基）三甲基氯化銨），在不改變轉(zhuǎn)染效率的前提下降低了對細(xì)胞的毒性。Ilies合成了兩種帶吡啶頭的陽離子脂質(zhì)體，一種是以酰胺鍵作為linke，另一種是以酯鍵作為linker來比較這兩種脂質(zhì)體對細(xì)胞轉(zhuǎn)染的影響。結(jié)果表明，相對于酯鍵，酰胺鍵較高熔點(diǎn)和較低的相轉(zhuǎn)變溫度導(dǎo)致其化學(xué)穩(wěn)定性更強(qiáng)，因而轉(zhuǎn)染效率高；而由于酯鍵的相對不穩(wěn)定因而細(xì)胞毒性更低。為了兼顧酯鍵的低細(xì)胞毒性和酰胺鍵的高轉(zhuǎn)染效率，近年來，人們對基于氨基甲酸酯作為linker的陽離子脂質(zhì)體研究也越來越重視。由于氨基甲酸酯在中性環(huán)境下如正常生理環(huán)境（pH 7.4）能夠穩(wěn)定存在，而一旦溶液的pH值降低（如在內(nèi)涵體中pH 5～6）就會酸性催化水解從而將包裹的核酸藥物釋放出來，同時(shí)脂質(zhì)體自身被水解成沒有毒性的小分子排出體外。谷胱甘肽（GSH）——含有巰基的肽，其在細(xì)胞質(zhì)中的濃度是血漿的 500-1000 倍左右，這也為設(shè)計(jì)含有二硫鍵的陽離子脂質(zhì)體用于核酸遞送提供思路36。其它具有光敏感和pH敏感的linker陽離子脂質(zhì)體也被開發(fā)用于核酸遞送。

綜上所述，作為陽離子脂質(zhì)體三個(gè)重要組成部分的親水性頭、疏水性尾和中間的鏈接鍵linker，每個(gè)部分在核酸遞送中都起著至關(guān)重要的作用，但是這三者并不是獨(dú)立的，而是相輔相存。因此在設(shè)計(jì)開發(fā)新的陽離子脂質(zhì)體時(shí)，應(yīng)該從以下幾個(gè)方面進(jìn)行考慮：第一，DNA和RNA的壓縮程度；第二，盡可能通過增強(qiáng)陽離子脂質(zhì)體與細(xì)胞膜之間的相互作用促進(jìn)納米載體的內(nèi)吞；第三，膜的融合能力既能有利于納米脂質(zhì)體通過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)有利于從內(nèi)涵體中逃逸出來避免進(jìn)入溶酶體被降解；第四，設(shè)計(jì)合成的陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性更低，生物相容性更好。