李梅 陸玉建 邊文靜 張換換 石東里

摘要：以3種生菜子葉為外植體，研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生菜（Lactuca sativa）不定芽的誘導(dǎo)和植株離體再生的影響。結(jié)果表明，意大利生菜、玻璃生菜和結(jié)球生菜不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基分別為MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；3種生菜生根最適培養(yǎng)基分別為1/2 MS+0.05 mg/L NAA、1/2 MS和1/2 MS+0.1 mg/L NAA。通過(guò)分析影響3種生菜高頻離體再生體系建立的因素，為進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)功能性蔬菜奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：生菜（Lactuca sativa）；離體快繁；植物生長(zhǎng)物質(zhì)；不定芽；生根；再生

中圖分類(lèi)號(hào)：S636.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）06-0111-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.06.028

Abstract： In this experiment，three kinds of cotyledons from Lactuca sativa were used as explants to study the effects of different plant growth substances on the induction of adventitious buds and the in vitro regeneration. The results showed that the optimal medium for the induction of adventitious buds from Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.，Lactuca sativa L. var. crisha Hort. and Lactuca sativa var capitata L. were MS+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，MS+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，and MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，respectively. The optimum rooting medium for the three kinds of Lactuca sativa were 1/2 MS+0.05 mg/L NAA，1/2 MS，and 1/2 MS+0.1 mg/L NAA. By analyzing the factors that affect the establishment of high-frequency regeneration system of three kinds of Lactuca sativa，it laid a foundation for further development of functional vegetables by using genetic engineering technology.

Key words： Lactuca sativa； rapid propagation in vitro； plant growth substance； adventitious buds； rooting； regeneration

植物疫苗將基因工程技術(shù)與機(jī)體免疫原理相結(jié)合，具有生產(chǎn)簡(jiǎn)單、成本較低、使用安全方便、易貯存等優(yōu)點(diǎn)。轉(zhuǎn)基因植物易于大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白，作為廉價(jià)的生物反應(yīng)器展示了誘人的前景[1，2]。植物反應(yīng)器本身不存在危害人類(lèi)健康的因素，既安全又可靠[3]。利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，植物細(xì)胞壁可以保護(hù)疫苗抗原免受胃腸道內(nèi)環(huán)境的降解，從而使轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗成為可能[4]。生菜（Lactuca sativa）為菊科萵苣屬草本植物，是一種廣泛受到歡迎的綠葉蔬菜，整株可食、鮮嫩爽口、熱量低，含有豐富的維生素及人體必需的礦物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5，6]。生菜生長(zhǎng)周期短，易繁殖，重組蛋白在其葉片中可以穩(wěn)定儲(chǔ)存和運(yùn)輸，并能通過(guò)口服途徑被人體或動(dòng)物機(jī)體有效吸收，因此是一種理想的轉(zhuǎn)基因植物反應(yīng)器[7-11]。穩(wěn)定組織培養(yǎng)體系的建立是生菜遺傳轉(zhuǎn)化的重要基礎(chǔ)和保證。生菜取材方便，易于離體培養(yǎng)，比較適合表達(dá)外源蛋白[12]。目前，有關(guān)生菜離體培養(yǎng)的研究較多，但生菜品種繁多，不同品種組織培養(yǎng)的條件不同，離體再生的效果存在明顯的差異[13-15]。因此，有必要對(duì)生菜離體培養(yǎng)條件繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化，從而建立穩(wěn)定高效的生菜離體再生體系。

目前，有關(guān)玻璃生菜離體快繁的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)選用玻璃生菜、意大利生菜和結(jié)球生菜為材料，研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)3種生菜愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響，進(jìn)而獲得比較適合生菜高效再生的培養(yǎng)基類(lèi)型，為今后生菜遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和品質(zhì)的改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

意大利生菜（Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.）、玻璃生菜（Lactuca sativa L. var. crisha Hort.）和結(jié)球生菜（Lactuca sativa var capitata L.）種子，由山東省黃河三角洲野生植物資源開(kāi)發(fā)利用工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

1）愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化培養(yǎng)基。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），以MS培養(yǎng)基母液為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（0.1、0.15、0.2和0.5 mg/L）和NAA（0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L），調(diào)節(jié)pH至5.8。所有培養(yǎng)基均添加3%的蔗糖和1%的瓊脂。

2）生根培養(yǎng)基的配制。以MS或1/2MS培養(yǎng)基母液為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA（0.05和0.1 mg/L），調(diào)節(jié)pH至5.8，見(jiàn)表2。

1.2.2 種子的消毒和種植 生菜種子用10% NaClO消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，然后將種子接種到1/2MS培養(yǎng)基固體中進(jìn)行培養(yǎng)。生菜的生長(zhǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，濕度保持在60%～70%，溫度控制在25 ℃左右，光照度為2 000 lx。

1.2.3 生菜愈傷組織誘導(dǎo)和分化 以生長(zhǎng)5 d的生菜子葉為材料，切成約0.5 cm×0.5 cm大小，接種到L1～L16培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽的分化培養(yǎng)。30 d統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，分化出芽的數(shù)量和芽分化率。愈傷組織誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%；不定芽分化率=（產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%。

1.2.4 再生根的誘導(dǎo)培養(yǎng) 當(dāng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽長(zhǎng)度大約3～5 cm時(shí)，切取生長(zhǎng)良好的不定芽，接種于生根培養(yǎng)基R1～R6中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，21 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的生根率和根增殖系數(shù)。生根率=（產(chǎn)生不根的外植體數(shù)/接種數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將3種生菜的子葉接種于L1～L16培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。結(jié)果表明，在上述培養(yǎng)基中，幾乎所有外植體都可脫分化產(chǎn)生愈傷組織，但愈傷組織的生長(zhǎng)情況卻存在明顯的差異。意大利生菜外植體在L4、L5、L9和L15培養(yǎng)基中，外植體產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)旺盛，堆積成團(tuán)；而在L6、L7、L12和L16培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織量相對(duì)較少（圖1A至圖1D）。玻璃生菜在L2、L8、L10和L13中，子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)較旺盛，多為疏松的白色或淡綠色；而在L1、L4、L5、L6、L7、L9和L12中，子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織量較少，多為致密的淡綠色或乳白色（圖1E至圖1H）。結(jié)球生菜在L4、L8、L11、L13、L14、L15中，子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織生長(zhǎng)較旺盛，多為疏松的白色；而在L1、L2、L5、L7、L12、L16中，子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織不明顯，量較少，多為致密的淡綠色（圖1I至圖1L）。

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生菜不定芽分化的影響

生菜子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)，可分化產(chǎn)生不定芽。結(jié)果表明，意大利生菜在上述培養(yǎng)基中，愈傷組織分化效果最差的是L5，幾乎觀察不到明顯的不定芽；其次是L1、L10、L13和L14，在這些培養(yǎng)基中，不定芽的分化率不到10.0%；愈傷組織分化不定芽效果較好的培養(yǎng)基為L(zhǎng)7、L12和L16，不定芽的分化率達(dá)到80.0%以上，不定芽的數(shù)量較多，生長(zhǎng)情況較好，其中L16培養(yǎng)基中愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽的效果最好，不定芽分化率達(dá)到88.9%，不定芽數(shù)量多且生長(zhǎng)旺盛（圖1A至圖1D）。玻璃生菜不定芽誘導(dǎo)率較高，但多數(shù)不定芽生長(zhǎng)情況較差，存在嚴(yán)重的玻璃化現(xiàn)象。其中L2、L8、L13和L15不定芽分化效果較差，不定芽分化率大約在50.0%左右，芽小量少且玻璃化現(xiàn)象非常明顯；L7和L9不定芽分化效果明顯，不定芽數(shù)量較多，但玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重；L1、L12和L16不定芽誘導(dǎo)率幾乎為100%，不定芽分化明顯，數(shù)量較多，且玻璃化現(xiàn)象不明顯，其中L12不定芽生長(zhǎng)旺盛，效果最佳（圖1E至圖1H）。在這16種培養(yǎng)基中，結(jié)球生菜不定芽的誘導(dǎo)率都很高，幾乎都為100%。其中，L8及L15的不定芽分化效果最差，芽少而小、長(zhǎng)勢(shì)差；在L3～L7、L9、L10、L13、L14中不定芽長(zhǎng)勢(shì)一般，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；在L1、L2、L11、L12、L16中，不定芽分化效果好，生長(zhǎng)旺盛、芽多而大、質(zhì)量好，相比之下，L2不定芽分化效果最好，不定芽增殖旺盛（圖1I至圖1L）。

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生菜不定芽生根的影響

將生菜不定芽接種到R1～R6培養(yǎng)基中，21 d后統(tǒng)計(jì)不定芽生根率。結(jié)果表明，意大利生菜在R5和R6培養(yǎng)基中，不定芽的生根效果較差，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根不僅細(xì)而長(zhǎng)，而且數(shù)量較少；在R1培養(yǎng)基中，不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生的根粗而長(zhǎng)，但數(shù)量較少；R3和R4培養(yǎng)基中不定芽產(chǎn)生主根的數(shù)量較多，生根率較高，達(dá)到60.0%以上；在R2培養(yǎng)基中，不定芽生根率最高，接近75.0%，主根粗而長(zhǎng)，數(shù)量較多，根系發(fā)達(dá)。玻璃生菜不定芽在R3培養(yǎng)基中生根率最低，主根短而少，效果最差；在R1培養(yǎng)基中，生根率低于50.0%，主根細(xì)而短，數(shù)量較少，根系不發(fā)達(dá)；在R2培養(yǎng)基中，不定芽生根率較高，但主根粗而短，數(shù)量較少，根系不發(fā)達(dá)；R4和R5培養(yǎng)基中，不定芽生根率低于50.0%，側(cè)根較多，根系生長(zhǎng)一般；R6培養(yǎng)基中，不定芽生根率達(dá)到53.8%，是培養(yǎng)基中生根系數(shù)最高的，主根細(xì)而長(zhǎng)，側(cè)根較多，根系發(fā)達(dá)。結(jié)球生菜不定芽在R1培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生的主根細(xì)而長(zhǎng)，數(shù)量較多，根系較為發(fā)達(dá)，生根率約53.3%；R2中主根細(xì)而短，根系較差，生根率僅有18.8%；R3中主根粗而多，側(cè)根少，根系生長(zhǎng)一般，生根率約53.3%；R4中主根粗而長(zhǎng)，側(cè)根多，根系發(fā)達(dá)，生根率達(dá)到66.7%；R5中主根細(xì)而長(zhǎng)，數(shù)量較多，生根率為60.0%；R6中主根細(xì)而長(zhǎng)，數(shù)量較多，根系生長(zhǎng)一般，生根率為57.1%。相比之下，在R4培養(yǎng)基中，結(jié)球生菜不定芽的生根效果最好。

2.4 3種生菜離體再生體系的建立

選擇生長(zhǎng)良好的3種生菜的子葉，分別接種于最適愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基中，7 d后可觀察到外植體的表面產(chǎn)生少量乳白色的愈傷組織。繼續(xù)培養(yǎng)至14 d，愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)，增大增多，結(jié)構(gòu)較致密，并有少量的綠色芽點(diǎn)產(chǎn)生（圖2A、圖2E和圖2I）。21 d后，愈傷組織再分化效果明顯，可以看到在子葉的表面產(chǎn)生數(shù)量較多的不定芽（圖2B、圖2F和圖2J）。繼續(xù)培養(yǎng)至30 d，愈傷組織的數(shù)量基本不再增加，而不定芽繼續(xù)增大增多。35 d后，不定芽生長(zhǎng)明顯，高而壯（圖2C、圖2G和圖2K）。當(dāng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽長(zhǎng)度約3～5 cm時(shí)，選擇生長(zhǎng)健壯的不定芽，接種于生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，3周后可以觀察到不定芽的基部產(chǎn)生大量的不定根，進(jìn)而獲得試管苗（圖2D、圖2H和圖2L）。

3 小結(jié)與討論

利用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白或可食性疫苗廉價(jià)、安全，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[16]。生菜不用加工處理，可以直接食用，是一種常用的植物反應(yīng)器。高頻離體再生體系的建立是植物遺傳轉(zhuǎn)化的前提和基礎(chǔ)。目前有關(guān)生菜離體再生的研究雖有很多，但生菜品種不同，組織培養(yǎng)的條件也不同；即使是同一種生菜，種子的來(lái)源不同，離體再生的條件也存在差異[17，18]。迄今為止，生菜離體再生還存在不定芽分化率低，生根效果差，玻璃化比較嚴(yán)重等諸多不足之處。因此，篩選合適的生菜品種，建立穩(wěn)定高效的再生體系已成為亟待解決的重要課題。本試驗(yàn)以3種生菜的子葉為外植體，進(jìn)行離體再生條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，影響生菜愈傷組織誘導(dǎo)和分化的最主要因素是6-BA和NAA的濃度。當(dāng)6-BA和NAA比例合適時(shí)，外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織量較少，結(jié)構(gòu)較致密，再分化產(chǎn)生不定芽的效果較好，芽增殖系數(shù)高，不定芽數(shù)量多而大，生長(zhǎng)旺盛；反之，外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織較多，堆積成團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松，多為非胚性愈傷組織，分化效果極差，芽小量少且玻璃化現(xiàn)象嚴(yán)重。3種生菜對(duì)6-BA和NAA比例要求不同，從意大利生菜、玻璃生菜到結(jié)球生菜，二者的比例逐漸提高。就3種生菜而言，在最適條件下，玻璃生菜和結(jié)球生菜不定芽誘導(dǎo)率較高，接近100%；而意大利生菜不定芽誘導(dǎo)率不到90%。其中玻璃生菜誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽最多，但易玻璃化；結(jié)球生菜產(chǎn)生的芽量雖不如玻璃生菜，但玻璃化程度較輕；意大利生菜產(chǎn)生的芽則較少。在生根的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，無(wú)論是否加入NAA，生根效果都較差，主根短而少，生根率低。當(dāng)培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基時(shí)，有利于3種生菜的生根。培養(yǎng)基不含NAA時(shí)，有利于玻璃生菜的生根，此時(shí)生根效果最好，根系發(fā)達(dá)；而意大利生菜和結(jié)球生菜還需加入一定濃度的NAA，方可有效的促進(jìn)生根。通過(guò)對(duì)比3種生菜離體快繁的最適條件，初步建立起比較高效穩(wěn)定的生菜離體再生體系，對(duì)于今后通過(guò)基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)功能性蔬菜具有非常重要的意義。

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