陳希曦，黎淑貞，吳海濤，黎平，郭江華，梁輝洪

(廣東省江門市中心醫(yī)院生殖中心，江門 529030)

相對于卵裂期胚胎移植，囊胚移植被認為是更符合生理的[1]；胚胎從卵裂期至囊胚經(jīng)歷了細胞融合、囊胚腔形成、囊胚腔擴張和內(nèi)細胞團孵出，基因調(diào)控由母型調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換為胚胎型調(diào)節(jié)，具有了更高的發(fā)育潛能[2]，研究已證實囊胚移植可以提高臨床妊娠率及胚胎著床率，減低多胎率[3]。凍融胚胎行囊胚培養(yǎng)是囊胚培養(yǎng)的一種新的臨床應(yīng)用，選擇性解凍卵裂期胚胎是該應(yīng)用一個顯著特點。本研究的目的在于探討胚胎質(zhì)量與囊胚形成之間的關(guān)系，選擇性挑選卵裂期胚胎進行解凍,力求形成1～2個優(yōu)質(zhì)/可用囊胚進行移植。

資料和方法

一、研究對象

收集2013～2016年在江門市中心醫(yī)院行凍融胚胎囊胚培養(yǎng)449名患者共478個周期的資料，進行回顧性分析。

納入標準：其胚胎均以玻璃化快速冷凍方法進行冷凍。

二、治療方法回顧

1.胚胎凍融技術(shù)：將D3卵裂期優(yōu)于4B、5B、6C以上且有發(fā)育潛能的胚胎進行玻璃化快速冷凍方法，采用加藤冷凍及解凍試劑盒(Kitazato，日本)，按其說明書進行操作。

2.子宮內(nèi)膜準備：采用激素替代或自然周期進行子宮內(nèi)膜的準備。激素替代于月經(jīng)第3～5天開始口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)，根據(jù)監(jiān)測內(nèi)膜的生長情況調(diào)整給藥的劑量及時間。當口服戊酸雌二醇天數(shù)≥14 d、內(nèi)膜厚度≥8 mm，并測血孕酮(P)水平<3.18 nmol/L，即以肌注黃體酮(浙江仙琚制藥)進行內(nèi)膜的轉(zhuǎn)化，此時為D0；自然周期以排卵日為D0。

3.囊胚培養(yǎng)及移植：于D2下午3～4時或D3上午9～10時解凍卵裂期胚胎，進行囊胚培養(yǎng)。采用Quinn’s Adavantage序貫培養(yǎng)液(SAGE，美國)或Vitrolife序貫培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)，按其說明書進行操作。于D5上午8～9時觀察，若當天形成可用囊胚即移植，若未形成可用囊胚則D6上午8～9時再觀察，若D6形成可用囊胚即移植。移植囊胚數(shù)1～2個。

4.移植后支持及妊娠判定：囊胚移植后繼續(xù)激素替代至10 d，測尿HCG及血β-HCG確定是否妊娠。如妊娠，繼續(xù)激素替代至妊娠8～9周開始逐漸減量，至孕11～12周停藥；移植后30 d左右 B超檢查，確定臨床妊娠及妊娠胎數(shù)。

三、胚胎評價標準及觀察指標

1.D3胚胎評價標準：(1)D3胚胎細胞數(shù)：胚胎的卵裂球數(shù)，分為<7細胞、7～9細胞、>9細胞；(2)D3胚胎細胞評級：依據(jù)胚胎的對稱性、無核碎片的比例[4]，將胚胎評級為A級(等大，碎片≤5%)、B級(不等大、無碎片或等大、碎片≤25%)、C級(等大或不等大、碎片≤50%)、D級(碎片>50%)；(3)D3胚胎質(zhì)量：以D3胚胎細胞數(shù)以及評級綜合判定，以4A、8B等表示。優(yōu)質(zhì)胚胎為D3的7～9細胞B級以上的胚胎，非優(yōu)質(zhì)胚胎包括<7細胞、>9細胞以及7～9細胞的C+D級胚胎。解凍后胚胎進行重新上述標準評級。

2.解凍后胚胎存活狀態(tài)：復蘇胚胎超過一半細胞保持完整定義為存活胚胎。全存活：胚胎細胞均存活；半存活：胚胎細胞存在裂解(死亡)，存活細胞≥1/2。

3.囊胚評價標準：采用Gardner人類囊胚分級系統(tǒng)[2]，將 D5評分≥3BB、D6評分≥4BB定為優(yōu)質(zhì)囊胚，將D5評分>3CC、D6評分>4CC定為可用囊胚。囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)胚胎數(shù)，可用囊胚形成率=可用囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)胚胎數(shù)，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=優(yōu)質(zhì)囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)胚胎數(shù)。

4.觀察指標：比較不同D3胚胎質(zhì)量的囊胚形成率、可用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率，分析各觀察指標與可用囊胚形成、優(yōu)質(zhì)囊胚形成的相關(guān)性。

四、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、患者一般資料

共納入449名患者的478個周期。年齡范圍為21～45歲，平均(31.16±4.31)歲；不育年限為1～18年，平均(4.24±3.01)年；助孕指征：輸卵管因素203例，宮腔內(nèi)人工授精(IUI)失敗53例，男方因素143例，排卵障礙6例，上次IVF受精失敗/受精率低3例，雙方因素41例。

二、囊胚培養(yǎng)結(jié)果

449名患者進行了478個解凍周期，共解凍培養(yǎng)2 097個胚胎，總囊胚形成率58.89%(1 235/2 097)、總可用囊胚形成率47.88 %(1 004/2 097)、總優(yōu)質(zhì)囊胚形成率18.69%(392/2 097)。

三、各因素與囊胚形成的關(guān)系

1.患者年齡：各年齡組之間的囊胚形成率、可用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率無顯著差異(P>0.05)(表1)。

2.解凍后胚胎存活狀態(tài)：全存活組囊胚形成率、可用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于半存活組(分別為59.71% vs.51.02%、48.97% vs.37.24 %、19.67% vs.9.18 %，P<0.05)(表2)。

3.D3胚胎質(zhì)量：優(yōu)質(zhì)胚胎組囊胚形成率、可用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組(分別為67.51% vs.49.95%、53.56% vs.41.98%、22.10% vs.15.16%，P<0.05)(表3)。

4.D3胚胎細胞數(shù)：<7細胞組囊胚形成率、可用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著低于7～9細胞組及>9細胞組(P<0.05)(表4)。

5.D3胚胎細胞評級：A+B組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著高于C+D組(19.82% vs.14.83%，P<0.05)(表5)。

表1 患者年齡與囊胚形成率[n(%)]

表2 解凍胚胎存活狀態(tài)與囊胚形成率[n(%)]

注：與全存活組比較，*P<0.05

表3 D3胚胎質(zhì)量與囊胚形成率[n(%)]

注：與優(yōu)質(zhì)胚胎組比較，*P<0.05

表4 D3胚胎細胞數(shù)與囊胚形成率[n(%)]

注：與<7細胞組比較，*P<0.05

表5 D3胚胎細胞評級與囊胚形成率[n(%)]

注：與A+B組比較，*P<0.05

四、Logistic分析

將上述因素分析中的差異因素，即患者年齡、胚胎解凍存活狀態(tài)、D3胚胎質(zhì)量、D3胚胎細胞數(shù)、D3胚胎細胞評級做Logistic分析，用Forward LR方法，結(jié)果提示患者年齡、胚胎解凍存活狀態(tài)、D3胚胎細胞數(shù)與可用囊胚形成顯著相關(guān)(P<0.05)，患者年齡、胚胎解凍存活狀態(tài)、D3胚胎細胞數(shù)、D3胚胎細胞評級與優(yōu)質(zhì)囊胚形成顯著有關(guān)(P<0.05)(表6、7)。

表6 可用囊胚形成多因素Logistic回歸分析

表7 優(yōu)質(zhì)囊胚形成多因素Logistic回歸分析

討 論

胚胎培養(yǎng)能夠挑選出高質(zhì)量胚胎[1]，囊胚是胚胎體外培養(yǎng)的終末階段，因此囊胚培養(yǎng)不僅有利于挑選具備發(fā)育潛能的胚胎，淘汰發(fā)育潛能差及染色體異常的胚胎，提高移植周期的臨床妊娠率和活產(chǎn)率[5-6]，同時還可明顯降低多胎妊娠的發(fā)生率。有研究表明囊胚質(zhì)量與臨床結(jié)局顯著相關(guān)[7]，但質(zhì)量差的囊胚也有妊娠機會且一旦妊娠并不會增加不良產(chǎn)科和圍產(chǎn)期結(jié)局[8]。因此，對D3卵裂期胚胎進行選擇性解凍后囊胚培養(yǎng)，最終形成1～2個優(yōu)質(zhì)或可用囊胚進行移植為最佳，多于2個可能面臨胚胎二次冷凍、無囊胚形成等而給患者帶來心理的負面影響。在本研究中的質(zhì)量評估納入胚胎解凍后存活狀態(tài)、D3胚胎細胞數(shù)、D3胚胎細胞評級以及D3胚胎質(zhì)量，分析D3卵裂期胚胎已有質(zhì)量指數(shù)與囊胚形成之間關(guān)系，為臨床選擇性解凍胚胎提供依據(jù)。

年齡是影響囊胚形成的因素之一[9]。本研究中單因素分析結(jié)果顯示隨著年齡增長各囊胚形成率均有所下降，然均無統(tǒng)計學差異；但Logistic分析結(jié)果顯示可用囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率與患者年齡均顯著有關(guān)，但二者的Exp(B)、95%CI均在1附近，B值分別為0.028、0.027。因此，我們認為年齡對凍融胚胎囊胚形成有一定影響，但其影響力不如其他影響因素；其次可能是由于納入≥40歲患者的胚胎數(shù)較少造成了偏倚。

研究發(fā)現(xiàn)胚胎的冷凍過程本身可引起重要的細胞內(nèi)改變[10]，冷凍胚胎解凍后卵裂球的存活程度反映了胚胎內(nèi)在質(zhì)量，能更好地承受冷凍過程的胚胎有著更好的發(fā)育潛能。本研究結(jié)果也證實這一點，Logistic分析結(jié)果顯示胚胎解凍后存活狀態(tài)是各種影響因素中對可用囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率影響最大者。

對于卵裂期胚胎質(zhì)量的評估，目前應(yīng)用最廣泛的評分方法依然是胚胎形態(tài)學評分系統(tǒng)[11]，依據(jù)胚胎發(fā)育的速度、卵裂球數(shù)目、細胞質(zhì)的均勻性及碎片進行評分分級，因此胚胎質(zhì)量是對胚胎細胞數(shù)與細胞評級的綜合評估。Logistic分析結(jié)果胚胎質(zhì)量與可用囊胚、優(yōu)質(zhì)囊胚無顯著相關(guān)。我們認為其原因在于：<7細胞胚胎較≥7細胞胚胎的各囊胚形成率低，而7～9細胞與>9細胞胚胎之間囊胚形成率相當；而細胞評級的區(qū)別僅僅導致優(yōu)質(zhì)囊胚形成率差異；胚胎質(zhì)量在細胞數(shù)與細胞評級二者此長彼消中削弱其對可用囊胚、優(yōu)質(zhì)囊胚形成的影響力；此外，已許多研究表明單從D3胚胎的形態(tài)來預測胚胎發(fā)育潛能是不夠精確[1，12-13]，Graham等[13]研究顯示，對符合胚胎選擇標準的D3胚胎與不符合使用標準的剩余胚胎進行囊胚培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，二者間的囊胚率并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。凍融胚胎囊胚培養(yǎng)是以傳統(tǒng)評分系統(tǒng)對D3胚胎進行評估后將符合選擇標準的胚胎進行冷凍保存后再解凍后囊胚培養(yǎng)，因此本研究對象是符合選擇標準的胚胎，而這些胚胎再行囊胚培養(yǎng)時依然呈現(xiàn)出不同的囊胚形成率。本研究目的在于通過已知的胚胎質(zhì)量參數(shù)去預測囊胚形成的可能性，提高此囊胚培養(yǎng)策略的有效性。這也揭示了該種策略的不足：可能丟棄那些本可以形成囊胚甚至優(yōu)質(zhì)囊胚的不符合選擇標準的胚胎。因此，我們認為凍融胚胎囊胚培養(yǎng)應(yīng)用于那些已有冷凍胚胎同時存在多胎高危因素或多次移植失敗的患者。

人類胚胎正常的發(fā)育速度是：受精后第1天為2細胞期，第2天為 4～6 細胞期，第 3 天為7～9 細胞期[14]。因此在D3時，<7細胞胚胎發(fā)育較慢，>9細胞胚胎則發(fā)育較快。Lundin 等[15]研究顯示發(fā)育較快的胚胎可能有更高的妊娠率；有學者認為胚胎發(fā)育速度過快說明非整倍體等遺傳缺陷比例較高，會削弱胚胎發(fā)育潛能[16]；有研究顯示，D3移植8細胞胚胎的臨床妊娠率高于非8細胞胎[17-18]，亦有學者認為D3移植8細胞胚胎時妊娠率的提高可能與子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育的同步化有關(guān)[19-20]。由于每個胚胎觀察時間點存在差異，細胞分裂是一個連續(xù)動態(tài)過程，從而胚胎細胞數(shù)是很容易變化的，僅能粗略地反映胚胎發(fā)育速度。在本研究中7～9細胞、>9細胞D3胚胎的囊胚形成率顯著高于<7細胞胚胎；因此在Logistic分析中將細胞數(shù)分為<7細胞與≥7細胞兩組，結(jié)果提示隨著D3胚胎細胞數(shù)增加有助于可用囊胚、優(yōu)質(zhì)囊胚形成。

綜上所述，在凍融胚胎囊胚培養(yǎng)中，患者年齡、胚胎解凍存活狀態(tài)、D3胚胎細胞與可用囊胚形成有關(guān)，患者年齡、胚胎解凍存活狀態(tài)、D3胚胎細胞、D3胚胎細胞評級與優(yōu)質(zhì)囊胚形成有關(guān)，其中胚胎解凍后存活狀態(tài)對可用/優(yōu)質(zhì)囊胚形成預測價值最大。

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