亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        巨噬細胞外泌體抑制HBV DNA復制

        2018-05-09 09:58:21周文靖徐若男王福生
        傳染病信息 2018年2期
        關鍵詞:外泌體抗病毒外周血

        楊 帆,楊 濤,周文靖,徐若男,王福生

        慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是由HBV感染引起的一種潛在危及生命的肝臟疾病。據(jù)WHO報道,全球約有2.4億HBV感染者[1-2]。病毒持續(xù)復制、機體HBV特異性免疫功能低下,誘發(fā)肝組織發(fā)生特異性和非特異性免疫損傷是CHB發(fā)生的主要病理基礎[3]。

        外泌體于1983年首次在綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)[4],是一種特異性的亞細胞結構,表達CD63、CD81、MFGE8、GAPDH等膜蛋白以及熱休克蛋白等分子[5]。不同細胞來源的外泌體,其組成成分、表面標志物和生物學功能不盡相同[6-8]。例如在小鼠肝纖維化模型中,外泌體相關微小RNA(microRNA,miRNA)-214 作為效應分子直接參與肝星狀細胞的激活[9]。另外,血漿外泌體中miRNA-192升高可能是酒精性肝損傷加重的危險因素[10]。

        前期研究顯示IFN-α可以通過誘導肝臟非實質細胞分泌高水平外泌體相關的miRNA-638間接抑制HBV DNA復制,發(fā)揮抗病毒效應[11]。然而免疫細胞尤其是巨噬細胞(macrophage,M?)是否可以借助外泌體發(fā)揮直接抗病毒效應,并且這種抗病毒效應與miRNA-638的關系目前尚不清楚。本研究應用實時定量 PCR的方法,體外驗證外泌體是否具有抑制HBV DNA復制的功能,同時檢測M?及M?外泌體中miRNA-638的表達,探討M?外泌體中miRNA-638抑制HBV DNA復制及與CHB患者肝損傷及病毒復制的相關性。其次,通過實時定量 PCR檢測CHB患者外周血血清外泌體中miRNA-638的表達,并分析其與肝損傷的相關性。

        1 對象與材料

        1.1 對象 2016年12月—2017年9月解放軍第三〇二醫(yī)院門診收治的CHB免疫活化(immune activation,IA)期、低(非)復制(inactive carrier,IC)期患者41例。其中,IA期患者25例(男19例,女6例),平均年齡為(31.5±9.2)歲;IC期16例(男12例,女4例),平均年齡為(36.4±15.1)歲。納入標準:①IA期:HBsAg和HBeAg陽性,HBV DNA>100 000 IU/ml,轉氨酶>60 U/L ;②IC期:HBeAg陰性且HBeAb陽性,HBV DNA<10 000 IU/ml,轉氨酶正常。排除標準:合并HCV或HIV感染;合并酒精性肝損傷;肝臟原發(fā)或繼發(fā)性惡性腫瘤;肝外梗阻性病變;孕婦等。2組患者均為未接受抗病毒治療的初治患者,健康對照(healthy control,HC)為同時期本研究室工作人員,共12例(表1)。

        表1 基本臨床資料Table 1 Basic clinical data

        1.2 材料 HepG2.2.15及THP-1細胞株由解放軍第三〇二醫(yī)院感染病診療與研究中心提供;DMEM、1640培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco公司);佛 波 酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)、GW4869(Sigma公司);anti-CD14-percp-cy5.5、anti-CD11b-FITC、anti-CD9-FITC及 anti-CD63-percpvio700(美國BD公司);ExoQuick、ExoQuick-TC外泌體提取試劑盒(美國SBI);超過濾管(美國Millipore);HBV DNA檢測試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司);Trizol試劑、總外泌體RNA分離試劑盒(北京天漠生物科技有限公司);miRNA反轉錄試劑盒(廣州銳博科技生物有限公司);miRNA-638、內(nèi)參(U6)及外參(cel-mir-39-3p)的特異性探針(廣州銳博科技生物科技有限公司)。

        2 方 法

        2.1 細胞培養(yǎng) 將人-單核細胞系THP-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的1640培養(yǎng)基中,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。細胞經(jīng)1200 rpm離心5 min后換液或傳代,同時要注意維持THP-1細胞均一、圓形、透亮的懸浮狀態(tài)。HepG2.2.15細胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。細胞經(jīng)1200 rpm離心5 min后換液或傳代。

        2.2 M?外泌體的體外誘導 將懸浮的THP-1細胞以5×105個/ml的密度接種于75 cm2培養(yǎng)基中,并加PMA(50 ng/ml)進行誘導。24 h后懸浮的THP-1細胞被誘導為貼壁的M?,用PBS清洗并更換為無FBS的1640培養(yǎng)基,加入10%無外泌體的FBS作為對照組,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)上清備用。

        2.3 外泌體的分離 ①M?上清外泌體分離:取M?上清液,用超過濾管3000×g離心30 min,取上層上清,按5∶1比例加入外泌體抽提試劑,快速混合均勻后置于4 ℃過夜,次日取出,1500×g離心30 min后棄去上清,沉淀即為抽提的外泌體,用PBS重懸后通過BCA法進行蛋白定量。置于-80 ℃冰箱長期保存,避免反復凍融。②血清外泌體分離:取所有入組者的外周血血清與外泌體抽提試劑按4∶1比例混合均勻后,置于4 ℃冰箱30 min,1500×g離心30 min后棄去上清,沉淀即為抽提的血清外泌體。置于-80 ℃冰箱長期保存,避免反復凍融。

        2.4 外泌體的鑒定 外泌體電鏡標本制備及觀察:取外泌體樣品,向樣品中滴入染色劑醋酸鈾水溶液(1%),混勻,用移液槍滴加至去靜電的復膜銅網(wǎng)上,室溫靜置自然干透后于透射電鏡下觀察,并進行拍攝。外泌體流式細胞儀檢測:將latex beads溶于300 μl MES buffer中,混勻后4000 rpm離心 15 min。每管加入 20 μg/μl的外泌體,加入MES buffer混勻。室溫下孵育60 min后,甘氨酸室溫封閉30 min。用含3% FBS MES buffer洗滌后分別加入CD9抗體和CD81抗體,同型IgG抗體作為空白對照。

        2.5 M?外泌體與HepG2.2.15細胞共培養(yǎng) 將10 μmol/L M?外泌體阻斷劑GW4869加入M?培養(yǎng)上清,無血清條件下刺激48 h,將細胞上清與HepG2.2.15細胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)48 h。收集上清用于HBV DNA定量檢測。

        2.6 HBV DNA的實時定量 PCR定量分析 取HBV DNA檢測試劑盒中的各組分,平衡至室溫后混勻備用。取5 μl M?與HepG2.2.15細胞共培養(yǎng)后的細胞培養(yǎng)上清加至96孔板后繼續(xù)加入5 μl樣品釋放劑(陰性對照、陽性對照、定量參考品與待測樣本相同處理),每管加入40 μl PCR混合液,2000 rpm離心30 s。PCR反應條件為:50 ℃2 min;94 ℃ 5 min,94 ℃ 15 s,57 ℃ 30 s,45 個循環(huán);25 ℃ 10 s。

        2.7 外泌體miRNA-638的檢測 分別提取M?、非M?、M?外泌體以及血清外泌體總RNA。用特異的反轉錄探針將miRNA-638反轉錄成cDNA,使用miRNA反轉錄試劑盒配制反轉錄體系,配置反應體系的所有操作均在冰上進行。根據(jù)microRNA Assay操作手冊配制相關試劑進行PCR反應。采用U6作為內(nèi)參照,cel-mir-39-3p作為外參照,以2-ΔΔCt值評估m(xù)iRNA-638的相對表達量。

        2.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料呈正態(tài)分布以±s表示,非正態(tài)分布的資料以中位數(shù)(最小值,最大值)表示,組間差異顯著性檢驗采用成組t檢驗,多組比較采用單因素方差分析,相關性分析采用Spearman相關性分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        3 結 果

        3.1 M?的體外誘導及鑒定 THP-1細胞經(jīng)50 ng/ml PMA刺激24 h后,細胞由懸浮、圓形變成貼壁、有偽足的M?(圖1A)。M?經(jīng)流式細胞儀檢測結果顯示,PMA刺激后的M?高表達CD11b-FITC及CD14-percp-cy5.5 ,陽性率分別為:97.2%、96.4%(圖1B)。

        圖1 M?形態(tài)和流式鑒定A.PMA誘導前后M?的形態(tài)學觀察;B.M?的流式鑒定Figure 1 Morphology and flow identification of macrophage

        3.2 外泌體的形態(tài)學鑒定及流式細胞學分析 在透射電鏡下顯示M?外泌體呈圓形或橢圓形,大小不一,外形直徑在100 nm左右,可見明顯的膜性結構(圖2A)。流式細胞儀檢測結果顯示提取的外泌體表達特異性表面標志物分子CD9和CD81,陽性率分別為59.3%、55.8%(圖2B)。

        3.3 M?外泌體抑制HepG2.2.15細胞HBV DNA復制 通過實時定量PCR檢測HepG2.2.15細胞上清中HBV DNA的表達水平。結果如表2所示,無血清條件下,M?外泌體可以明顯抑制HBV DNA的復制。經(jīng)GW4869阻斷后,發(fā)現(xiàn)M?上清抑制HepG2.2.15細胞HBV DNA復制的能力明顯降低(P<0.05)(圖3)。以上結果顯示,體外條件下,M?來源的外泌體可以有效抑制HepG2.2.15細胞HBV DNA的復制。

        圖2 M?來源外泌體的特征鑒定A.外泌體的電鏡鑒定;B.外泌體的流式鑒定Figure 2 Characteristics identification of macrophage-derived exosomes

        表2 HBV DNA定量情況(±s,log10IU/ml)Table 2 Quantification of HBV DNA(±s,log10IU/ml)

        表2 HBV DNA定量情況(±s,log10IU/ml)Table 2 Quantification of HBV DNA(±s,log10IU/ml)

        注:FBS均指無外泌體的FBS;-.表示無FBS或GW4869刺激;+.表示有FBS或GW4869刺激;ND.沒有檢測

        培養(yǎng)條件 FBS- FBS+GW4869 - 2.926±0.454 4.600±0.598 GW4869 + 4.533±0.751 ND

        圖3 M?來源外泌體抑制HBV DNA復制(n=18)注:-.表示無FBS或GW4869刺激;+.表示有FBS或GW4869刺激(FBS均指無外泌體的FBS);***.P<0.001Figure 3 Macrophage-derived exosomes inhibits HBV DNA replication (n=18)

        3.4 M?外泌體中miRNA-638表達水平分析 結合前期的研究結果,為了進一步分析M?中miRNA的表達情況,經(jīng)磁珠分選人單核細胞后,分別檢測人單核M?以及除去單核M?以外的外周血單個核細胞中miRNA的表達,結果顯示,人外周血來源M?組中的miRNA-638的表達水平高于非M?組(P<0.05)(圖4A)。THP-1來源的M?經(jīng)體外無FBS(無外泌體)刺激后,M?外泌體中miRNA-638的表達也明顯升高(P<0.05)(圖4B)。

        3.5 CHB患者血清外泌體中miRNA-638的表達 通過實時定量PCR檢測受試對象血清外泌體中miRNA-638的表達,結果顯示,IA期、IC期及HC組3組miRNA-638的相對表達量分別為:0.168±0.208、0.824±0.605、1.307±0.282,IA 期 患者血清外泌體中miRNA-638表達水平低于IC期,并且2組患者的miRNA-638表達水平均低于HC組(P均<0.05)(圖5)。

        3.6 CHB患者IA期血清外泌體中miRNA-638與肝損傷和HBV DNA復制的相關性分析 CHB患者IA期血清外泌體中miRNA-638表達水平與ALT(r=0.539,P=0.006)、AST(r=-0.589,P=0.002)、 和 HBV DNA(r=-0.656,P=0.000)水平均呈負相關(圖6)。

        4 討 論

        外泌體來自于細胞的內(nèi)吞系統(tǒng),電鏡下外泌體呈球狀、杯狀,直徑在30~100 nm之間,富含效應分子如mRNA、miRNA和蛋白質等[12]。外泌體中的miRNA因其本身所具有的調(diào)控基因表達的強大功能,吸引了更多的研究者的關注。miRNA是一類長約19~25個核糖核苷酸的非編碼調(diào)控單鏈小分子的RNA。目前miRbase數(shù)據(jù)庫已有多達9500多個該類分子,研究證實許多miRNA與人類病毒感染、腫瘤等的發(fā)生和發(fā)展密切相關[13]。前期研究顯示,IFN-α的抗病毒效應是通過M?相關外泌體介導的,與外泌體中高表達的miRNA-4284、miRNA-638分子密切相關[11]。外泌體富含效應分子如mRNA、miRNA和蛋白質等在HBV DNA復制、肝細胞炎性損傷、肝細胞惡性轉化的過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。以往的研究發(fā)現(xiàn),單核細胞來源的外泌體可以調(diào)節(jié)肝臟的炎性反應[16]。然而,M?作為天然免疫的重要組成部分,自身的抗病毒功能不容忽視。M?來源的外泌體是否具備直接的抗病毒功能,在肝臟炎性損傷中的作用目前還不清楚。就目前而言,肝臟疾病相關外泌體的研究還處于起步階段,特別是免疫細胞來源的外泌體與病毒性肝炎、肝硬化以及肝癌之間的研究還較少。

        圖4 人外周血M?及THP-1細胞上清外泌體中miRNA-638的表達鑒定(n=4)A.M?及去除M?以外的外周血單個核細胞中miRNA-638的表達;B.有無血清刺激條件下,M?上清外泌體中miRNA-638的表達Figure 4 Expression of miRNA-638 in the exosomes derived from human peripheral blood macrophages and the supernatant of THP-1 cell line (n=4)

        分泌外泌體的細胞受不同物質的調(diào)控,M?外泌體具有自己特殊的性質,其表面常見分子標志有CD9、CD81、CD63等。本研究從M?培養(yǎng)上清中分離鑒定出外泌體,電鏡下觀察近似圓形,直徑在30~100 nm之間,表達特征性標志分子CD9和CD81。并且M?來源的外泌體可以有效抑制HepG2.2.15細胞中HBV DNA復制。GW4869是已知的外泌體阻斷劑[17],當外泌體被特異性阻斷劑(GW4869)阻斷后,細胞上清中總蛋白和總RNA水平降低(前期研究已證實),外泌體對HBV DNA復制的抑制效果也明顯減弱。單獨應用GW4869并不影響HepG2.2.15細胞自身的HBV DNA的復制。說明外泌體可能是抑制HBV DNA復制的效應分子。

        目前已有大量的文獻涉及外泌體中miRNA的體內(nèi)研究。本研究進一步證實M?外泌體中高水平表達miRNA-638分子,經(jīng)無血清刺激后表達上調(diào)。臨床研究結果顯示,IA期患者血清外泌體相關miRNA-638表達較IC期明顯降低。并且IA期患者血清外泌體中miRNA-638的表達水平與其自身ALT、AST及HBV DNA水平呈負相關。但本研究并未進行miRNA-638的阻斷試驗,須要進一步確定外泌體中miRNA-638對HBV DNA復制和HBsAg合成的影響,同時由于病例數(shù)較少,是否可以作為診斷肝損傷的免疫學指標還有待擴大樣本量進一步觀察。另外,入組的2組CHB患者均未接受抗病毒治療,而抗病毒治療是否會影響到外泌體的分泌和功能還有待進一步探索。

        圖6 CHB患者血清外泌體miRNA-638與血清轉氨酶和病毒復制的相關性分析Figure 6 Correlation with exosome associated miRNA-638 derived from serum in CHB patients with serum transaminase and viral replication

        【參考文獻】

        [1]Wang Y,Zhao C,Zhang L,et al.Predictive value of interferongamma inducible protein 10 kD for hepatitis B e antigen clearance and hepatitis B surface antigen decline during pegylated interferon alpha therapy in chronic hepatitis B patients[J].Antiviral Res,2014,103:51-59.

        [2]Bartel DP.MicroRNAs: genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.

        [3]Gong LL,Zhao BB,Fan WF,et al.Correlations of IFN-gammainducible protein-10 with the risk of chronic hepatitis B and the efficacy of interferon therapy in Asians[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(7):8367-8375.

        [4]Johnstone RM,Adam M,Hammond JR,et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes) [J].J Biol Chem,1987,262(19):9412-9420.

        [5]楊帆,楊濤,王福生,等.肝臟疾病中外泌體的作用和臨床研究進展[J].傳染病信息,2018,31(2):66-70.

        [6]Blanchard N,Lankar D,Faure F,et al.TCR activation of human T cells induces the production of exosomes bearing the TCR/CD3/zeta complex[J].J Immunol,2002,168(7):3235-3241.

        [7]Van Niel G,Raposo G,Candalh C,et al.Intestinal epithelial cells secrete exosome-like vesicles[J].Gastroenterology,2001,121(2):337-349.

        [8]De Gassart A,Geminard C,Hoekstra D,et al.Exosome secretion:the art of reutilizing nonrecycled proteins? [J].Traffic,2004,5(11):896-903.

        [9]Charrier A,Chen R,Chen L,et al.Exosomes mediate intercellular transfer of pro-fibrogenic connective tissue growth factor (CCN2)between hepatic stellate cells,the principal fibrotic cells in the liver[J].Surgery,2014,156(3):548-555.

        [10]Momen-Heravi F,Saha B,Kodys K,et al.Increased number of circulating exosomes and their microRNA cargos are potential novel biomarkers in alcoholic hepatitis[J].J Transl Med,2015,13:261.

        [11]Li J,Liu K,Liu Y,et al.Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-alpha-induced antiviral activity[J].Nat Immunol,2013,14(8):793-803.

        [12]Gould SJ,Raposo G.As we wait: coping with an imperfect nomenclature for extracellular vesicles[J].J Extracell Vesicles,2013,2.

        [13]Banerjee-Basu S,Larsen E,Muend S.Common microRNAs target established ASD genes[J].Front Neurol,2014,5:205.

        [14]Yang N,Li S,Li G,et al.The role of extracellular vesicles in mediating progression,metastasis and potential treatment of hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2017,8(2):3683-3695.

        [15]Deng W,Lu M.The role of microRNAs in hepatocyte metabolism and hepatitis B virus replication[J].Virol Sin,2016,31(6):472-479.

        [16]Saha B,Momen-Heravi F,Kodys K,et al.MicroRNA Cargo of extracellular vesicles from alcohol-exposed monocytes signals naive monocytes to differentiate into M2 macrophages[J].J Biol Chem,2016,291(1):149-159.

        [17]Mittelbrunn M,Gutierrez-Vazquez C,Villarroya-Beltri C,et al.Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells[J].Nat Commun,2011,2:282.

        猜你喜歡
        外泌體抗病毒外周血
        慢性乙型肝炎抗病毒治療是關鍵
        肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:52
        外泌體miRNA在肝細胞癌中的研究進展
        間充質干細胞外泌體在口腔組織再生中的研究進展
        抗病毒治療可有效降低HCC的發(fā)生及改善患者預后
        肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:14
        循環(huán)外泌體在心血管疾病中作用的研究進展
        抗病毒藥今天忘吃了,明天要多吃一片嗎?
        肝博士(2020年4期)2020-09-24 09:21:26
        對抗病毒之歌
        外泌體在腫瘤中的研究進展
        白血病外周血體外診斷技術及產(chǎn)品
        結腸炎小鼠外周血和結腸上皮組織中Gal-9的表達
        国产免费三级av在线| 国产激情视频在线| 国产成人精品一区二区日出白浆| 免费看黄片的视频在线观看| 久久狠狠色噜噜狠狠狠狠97| 三上悠亚av影院在线看| 国产成年无码aⅴ片在线观看| 在线观看中文字幕不卡二区| 精品人无码一区二区三区| 国产精品你懂的在线播放| 欧美成人久久久免费播放| 亚洲一区二区三区在线| 穿着白丝啪啪的av网站| 狠狠色综合7777久夜色撩人| 日韩毛片基地一区二区三区| 精品熟妇av一区二区三区四区 | 亚洲AV无码成人精品区日韩密殿| 一区二区三区在线观看视频精品| 亚洲av永久无码精品古装片 | 国产免费午夜福利蜜芽无码| 美丽小蜜桃1一3在线观看| 寂寞少妇做spa按摩无码| 久久AV老司机精品网站导航| 久久国产高潮流白浆免费观看| 蜜臀av毛片一区二区三区| 国产精品第一国产精品| 无码日韩人妻AV一区免费| 亚洲日本精品一区二区三区| 精品亚洲国产成人蜜臀av| 色婷婷综合中文久久一本| 日韩中文字幕网站| 中文字幕一区二区av| 最新系列国产专区|亚洲国产| 亚洲天堂资源网| 日本高清在线一区二区三区| 国产精品理论片在线观看| 3d动漫精品啪啪一区二区下载 | 精品人妻av区乱码| 亚洲熟妇av乱码在线观看 | 98色花堂国产精品首页| 日本一区二区午夜视频|