程思杰，趙娜娜，嚴(yán) 錦，王瑞蘭，余靈祥，肖朝輝，雷光林，張培瑞，王兆海，張紹庚，楊鵬輝

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)每年大約有74萬新增HCC病例，同時(shí)又有70萬HCC死亡病例，其中大約50%發(fā)生在中國[1-2]。由于高發(fā)病率和高病死率，HCC在世界范圍內(nèi)尤為被重視，而我國的HCC發(fā)病率及病死率也呈逐年上升趨勢，高居各種惡性腫瘤相關(guān)死亡原因的總體第2位[2-3]，嚴(yán)重危害人類健康。HCC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程。已有研究表明HCC的發(fā)生發(fā)展與HBV、HCV感染以及感染引起的相關(guān)通路變化相關(guān)[4-5]；也與多種干細(xì)胞生長因子的異常表達(dá)引起的信號通路變化密切相關(guān)[6-7]。然而，HCC發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制至今尚未明確。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是一類不編碼蛋白或只能編碼短肽，轉(zhuǎn)錄本長度一般超過200 nt的非編碼RNA分子，起初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過程中的副產(chǎn)物，無任何生物學(xué)功能[8-9]。但是越來越多的研究顯示，LncRNA在基因轉(zhuǎn)錄翻譯、表觀遺傳、細(xì)胞分化等生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，并且在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程[10-12]，有望成為新的潛在腫瘤標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)，為腫瘤的診斷和預(yù)后提供新的研究思路[13-15]。此外，特異性表達(dá)的LncRNA譜可以將癌組織和癌旁組織進(jìn)行準(zhǔn)確判別[16]。因此，本研究基于人類LncRNA公共數(shù)據(jù)庫GSE55191基因數(shù)據(jù)，檢測了LncRNA LOC728290在HCC患者中配對（癌組織、癌旁組織）表達(dá)水平差異，并進(jìn)一步探討LncRNA LOC728290的表達(dá)水平與患者臨床病理特征、術(shù)后無復(fù)發(fā)生存時(shí)間的關(guān)系，為HCC患者早期診斷及預(yù)后提供參考。

1 對象與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2013年10月—2016年12月于解放軍第三〇二醫(yī)院肝膽外科行肝癌切除術(shù)患者65例，患者術(shù)前均未接受化療、放療等輔助治療，標(biāo)本經(jīng)病理分析證實(shí)均為HCC。對照組標(biāo)本來自于同一患者的癌旁組織（距離手術(shù)切緣至少3 cm），術(shù)后病理檢查未發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。所有標(biāo)本在離體后立即放入液氮中保存。腫瘤分化程度依據(jù)Edmondson-Steiner分級標(biāo)準(zhǔn)確定，腫瘤分期按美國腫瘤研究聯(lián)合委員會2010年發(fā)布的第7版分期系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)確定。

1.2 儀器與試劑 LncRNA LOC728290及GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)及合成；RNA提取試劑Trizol購自美國Life Technologies公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）試劑盒均購自全式金生物科技有限公司；生物分光光度儀購自美國Thermo公司；qRT-PCR儀購自美國Applid Biosystems公司。LncRNA LOC728290引物序列為：5′-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3′（正向引物）；5′-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3′（反向引物）。GAPDH：5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′（正向引物）；5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′（反向引物）。

1.3 RNA的提取 取100 mg液氮凍存的肝組織并加1 ml Trizol，用組織勻漿儀研磨，研磨充分后抽提RNA；RNA含量和純度采用核酸蛋白定量檢測儀檢測，RNA純度的判斷采用A260/A280的比值，當(dāng)該比值為1.8～2.0時(shí)認(rèn)為RNA樣品的純度合格。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.4 RT-PCR及qRT-PCR 按照反轉(zhuǎn)錄說明書將所提取組織標(biāo)本RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Green說明書配制qRT-PCR反應(yīng)體系。取cDNA進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s變性，60℃ 30 s退火，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每次都將待測樣品及內(nèi)參同時(shí)進(jìn)行qRT-PCR，基于2-△△Ct的方法進(jìn)行相對定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較LncRNA LOC728290在癌組織和配對癌旁組織的表達(dá)水平；LncRNA LOC728290高表達(dá)組與低表達(dá)組患者臨床病理特征的比較采用χ2檢驗(yàn)；臨床病理差異患者的LncRNA LOC728290表達(dá)水平比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)；總體生存率采用Kaplan-Meier生存分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LncRNA LOC728290在HCC患者癌組織及配對癌旁組織中的表達(dá)水平 通過qRT-PCR分別檢測65例HCC患者癌組織和配對癌旁組織中LncRNA LOC728290的表達(dá)。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果表明，LncRNA LOC728290在癌組織中表達(dá)量顯著低于配對癌旁組織（t=12.540，P=0.001）（圖1A）；其中54例HCC患者（83.0%）LncRNA LOC728290在癌組織中的表達(dá)水平較配對癌旁組織下調(diào)（圖1B）。

圖1 LncRNA LOC728290在HCC患者中癌組織及配對癌旁組織相對表達(dá)水平A.LncRNA LOC728290在HCC患者癌組織和配對癌旁組織中的表達(dá)水平（n=65）；B.LncRNA LOC728290在HCC患者癌組織較配對癌旁組織的相對表達(dá)水平，正數(shù)代表表達(dá)量升高，負(fù)數(shù)則代表降低Figure 1 Relative expression level of LncRNA LOC728290 in tumor tissues and its paired adjacent tissues of HCC patients

2.2 HCC組織LncRNA LOC728290表達(dá)量與患者臨床特征的關(guān)系 根據(jù)HCC患者癌組織中LncRNA LOC728290相對表達(dá)量的中位數(shù)將65例標(biāo)本分為LncRNA LOC728290高表達(dá)組（n=32）和低表達(dá)組（n=33）[17]，通過比較2組患者的臨床特征發(fā)現(xiàn)，LncRNA LOC728290的表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、是否有門靜脈癌栓及病理分級之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。而LncRNA LOC728290的表達(dá)與患者AFP水平及患者是否存在微脈管浸潤差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（表1）。進(jìn)一步對AFP水平≥20 ng/m（ln=39）和AFP水平＜20 ng/m（ln=26）標(biāo)本中LncRNA LOC728290表達(dá)量比較分析顯示：血清AFP≥20 ng/ml的患者癌組織中的LncRNA LOC728290的表達(dá)水平較血清AFP＜20 ng/ml組患者顯著降低（t=2.421，P=0.021）（圖2A）。對有微脈管浸潤的HCC患者（n=47）和無微脈管浸潤的HCC患者（n=18）標(biāo)本中LOC728290的表達(dá)量檢測結(jié)果顯示：微脈管浸潤的HCC患者LncRNA LOC728290顯著低表達(dá)（t=2.021，P=0.040）（圖2B）。

2.3 HCC患者癌組織中LncRNA LOC728290表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 結(jié)合臨床患者隨訪信息，分析LncRNA LOC728290的表達(dá)水平與HCC患者（n=65）術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，LncRNA LOC728290表達(dá)水平低的HCC患者無復(fù)發(fā)生存率較其表達(dá)水平高的HCC患者明顯降低，2者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.047）（圖3）。

3 討 論

HCC是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及病死率也逐年攀升[18]。越來越多的研究表明LncRNA的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著不可忽視的作用[19-21]。HCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，已有研究表明LncRNA H19、MALAT1和HULC與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22-24]，但其具體作用機(jī)制尚不明確?；诖耍狙芯渴紫葘?shù)據(jù)庫中HCC的LncRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)LncRNA LOC728290在HCC中顯著低表達(dá)，具有成為HCC患者預(yù)后標(biāo)志物的潛力。本研究進(jìn)一步證實(shí)LncRNA LOC728290在65例HCC患者癌組織中較配對癌旁組織表達(dá)顯著下調(diào)；同時(shí)LncRNA LOC728290表達(dá)水平低的HCC患者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間較表達(dá)水平高的患者顯著降低，推測LncRNA LOC728290可能參與HCC的發(fā)生發(fā)展過程。由于肝組織的復(fù)雜性，HCC患者合并HBV、HCV感染與否，是否具有肝纖維化、肝硬化，門靜脈癌栓或微脈管浸潤等，必然對應(yīng)不同的細(xì)胞內(nèi)信號通路或腫瘤微環(huán)境的改變。因此，LncRNA LOC728290在HCC中表達(dá)下降的機(jī)制與HCC發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制還需要后續(xù)的研究來證實(shí)。

表1 HCC組織中LncRNA LOC728290高表達(dá)組與低表達(dá)組臨床指標(biāo)比較（n=65）Table 1 Comparison of clinical indexes of LncRNA LOC728290 between the high expression group and the low expression group in HCC tissues (n=65)

近年來，隨著直接抗病毒藥物的發(fā)展與應(yīng)用，即使在不聯(lián)合使用干擾素的情況下，其對慢性肝炎尤其是HCV感染引起的慢性肝炎也取得了良好的治療效果。但直接抗病毒藥物對肝硬化患者和IL-28B抗性基因型患者治療效果卻不盡如人意，患者發(fā)生HCC的幾率仍維持在較高水平[25]，因此探尋新的標(biāo)志物或潛在靶標(biāo)的任務(wù)仍然非常迫切。近年來，研究表明多種LncRNA（HOTAIR、H19、ZEB1-AS1等）參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望作為疾病潛在預(yù)后指標(biāo)[26-28]。本研究，統(tǒng)計(jì)分析了LncRNA LOC728290的表達(dá)水平與臨床病理資料的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)LncRNA LOC728290的表達(dá)與患者AFP水平是否＞20 ng/ml及患者是否存在微脈管浸潤有關(guān)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），血清AFP在肝癌的診斷中發(fā)揮著重要的作用[29-30]，推測LncRNA LOC728290可能是HCC發(fā)生的一個(gè)重要標(biāo)志物；此外還發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與患者微脈管浸潤具有相關(guān)性，而微脈管浸潤及門靜脈癌栓是HCC肝外轉(zhuǎn)移的主要途徑[31-32]，由此揭示LncRNA LOC728290在HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，具體的生物學(xué)功能、調(diào)控機(jī)制還有待深入探究。然而，LncRNA LOC728290的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤分期及是否合并肝硬化等其他臨床病理指標(biāo)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與目前臨床患者樣本量較小、腫瘤異質(zhì)性等因素有關(guān)，還須要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證該結(jié)論。另外，LncRNA LOC728290在不同HCC細(xì)胞系的差異表達(dá)，其相互作用的靶基因及信號通路以及其在體外細(xì)胞模型和體內(nèi)荷瘤裸鼠發(fā)揮的具體功能等還有待進(jìn)一步研究，以揭示其在HCC發(fā)生發(fā)展中的具體調(diào)控機(jī)制；并且進(jìn)一步隨訪完善患者總生存時(shí)間與疾病預(yù)后關(guān)系，以期使LncRNA LOC728290成為HCC潛在的臨床早期診斷、判斷疾病預(yù)后的候選靶標(biāo)。

圖2 LncRNA LOC728290在AFP水平、有/無微脈管浸潤HCC患者癌組織中的表達(dá)量差異A.LncRNA LOC728290在不同AFP水平組中的表達(dá)；B.LncRNA LOC728290在有/無微脈管浸潤患者癌組織的表達(dá)Figure 2 Differential expression levels of LncRNA LOC728290 in HCC patients with different levels of serum AFP and patients with or without microvascular invasion

圖3 不同LncRNA LOC728290的表達(dá)水平與HCC患者術(shù)后無復(fù)發(fā)生存曲線Figure 3 Correlations between LncRNA LOC728290 expression level and recurrence-free survival of HCC patients

【參考文獻(xiàn)】

[1]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[3]Saha SK,Parachoniak CA,GhantaKS,et al.Mutant IDH inhibits HNF-4alpha to block hepatocyte differentiation and promote biliary cancer[J].Nature,2014,513(7516):110-114.

[4]Protzer U.Hepatitis: epigenetic control of HBV by HBx protein--releasing the break[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2015,12(10):558-559.

[5]Zhu M,Guo J,et al.Hepatitis B virus X protein induces expression of alpha-fetoprotein and activates PI3K/mTOR signaling pathway in liver cells[J].Oncotarget,2015,6(14):12196-12208.

[6]Zavattari P,Perra A,Menegon S,et al.Nrf2,but not beta-catenin,mutation represents an early event in rat hepatocarcinogenesis[J].Hepatology,2015,62(3):851-862.

[7]Gauglhofer C,Paur J,Schrottmaier WC,et al.Fibroblast growth factor receptor 4: a putative key driver for the aggressive phenotype of hepatocellular carcinoma[J].Carcinogenesis,2014,35(10):2331-2338.

[8]Necsulea A,Soumillon M,Warnefors M,et al.The evolution of lncRNA repertoires and expression patterns in tetrapods[J].Nature,2014,505(7485):635-640.

[9]Ponting C,Oliver PL,Reik W.Evolution and functions of long noncoding RNAs[J].Cell,2009,136(4):629-641.

[10]Fitzgerald KA,Caffrey DR.Long noncoding RNAs in innate and adaptive immunity[J].Curr Opin Immunol,2014,26:140-146.

[11]He X,Bao W,Li X,et al.The long non-coding RNA HOTAIR is upregulated in endometrial carcinoma and correlates with poor prognosis[J].Int J Mol Med,2014,33(2):325-332.

[12]Martens-Uzunova ES,Bottcher R,Croce CM,et al.Long noncoding RNA in prostate,bladder,and kidney cancer[J].Eur Urol,2014,65(6):1140-1151.

[13]Du Z,Sun T,Hacisuleyman E,et al.Integrative analyses reveal a long noncoding RNA-mediated sponge regulatory network in prostate cancer[J].Nat Commun,2016,7:10982.

[14]Wan L,Sun M,Liu GJ,et al.Long non-coding RNA PVT1 promotes non-small cell lung cancer cell proliferation through epigenetically regulating LATS2 expression[J].Mol Cancer Ther,2016,15(5):1082.

[15]Zhai W,Sun Y,Jiang M,et al.Differential regulation of LncRNASARCC suppresses VHL-mutant RCC cell proliferation yet promotes VHL-normal RCC cell proliferation via modulating androgen receptor/HIF-2alpha/C-MYC axis under hypoxia[J].Oncogene,2016,5(Suppl 1):S4866.

[16]Yang F,Zhang L,Huo XS,et al.Long noncoding RNA high expression in hepatocellular carcinoma facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2 in humans[J].Hepatology,2011,54(5):1679-1689.

[17]Yuan JH,Yang F,Wang F,et al.A long noncoding RNA activated by TGF-beta promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Cell,2014,25(5):666-681.

[18]Lechel A,Gougelet A.Early HCC treatment: a future strategy against interferon/miR-484 axis to revert precancerous lesions [J].Gut,2016,65(7):1703-1704.

[19]Iguchi T,Uchi R,Nambara S,et al.A long noncoding RNA,lncRNA-ATB,is involved in the progression and prognosis of colorectal cancer[J].Anticancer Res,2015,35(3):1385-1388.

[20]Qiu JJ,Lin YY,Ding JX,et al.Long non-coding RNA ANRIL predicts poor prognosis and promotes invasion/metastasis in serous ovarian cancer[J].Int J Oncol,2015,46(6):2497-2505.

[21]Yue B,Qiu S,Zhao S,et al.LncRNA-ATB mediated E-cadherin repression promotes the progression of colon cancer and predicts poor prognosis[J].J Gastroenterol Hepatol,2016,31(3):595-603.

[22]Luo F,Sun B,Li H,et al.A MALAT1/HIF-2alpha feedback loop contributes to arsenite carcinogenesis[J].Oncotarget,2016,7(5):5769-5787.

[23]Panzitt K,Tschernatsch MM,Guelly C,et al.Characterization of HULC,a novel gene with striking up-regulation in hepatocellular carcinoma,as noncoding RNA[J].Gastroenterology,2007,132(1):330-342.

[24]Ohrnberger S,Thavamani A,Braeuning A,et al.Dysregulated serum response factor triggers formation of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2015,61(3):979-989.

[25]王福生，李元元，史繼靜，等.直接抗病毒藥物對慢性丙型肝炎特殊人群的治療進(jìn)展[J].傳染病信息，2017，30(2):70-74.

[26]Li J,Chen Z,Tian L,et al.LncRNA profile study reveals a three-lncRNA signature associated with the survival of patients with oesophageal squamous cell carcinoma[J].Gut,2014,63(11):1700-1710.

[27]Thum T.Noncoding RNAs and myocardial fibrosis[J].Nat Rev Cardiol,2014,11(11):655-663.

[28]Zhang S,Chen S,Yang G,et al.Long noncoding RNA HOTAIR as an independent prognostic marker in cancer: a meta-analysis[J].PLoS One,2014,9(8):e105538.

[29]Carr BI,Guerra V,Giannini EG,et al.Significance of platelet and AFP levels and liver function parameters for HCC size and survival[J].Int J Biol Markers,2014,29(3):e215-e223.

[30]Dwyer JP,Hosking P,Lubel J.Multiple liver lesions in a patient with positive hepatitis C serology and elevated AFP: is it HCC [J].Gastroenterology,2014,147(3):e12-e13.

[31]Li T,Xie J,Shen C,et al.Upregulation of long noncoding RNA ZEB1-AS1 promotes tumor metastasis and predicts poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Oncogene,2016,35(12):1575.

[32]Li T,Xie J,Shen C,et al.Amplification of long noncoding RNA ZFAS1 promotes metastasis in hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,2015,75(15):3181-3191.