徐瑞，張曉

南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473000

哮喘是兒童時(shí)期常見(jiàn)的一種反復(fù)發(fā)作的哮鳴氣喘肺系疾病，隨著環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，哮喘患病率有逐年上升的趨勢(shì)，2000年全國(guó)哮喘防治小組采用整群抽樣調(diào)查我國(guó)城區(qū)兒童哮喘的現(xiàn)患病率為0.12%～3.34%，平均1.54%，累計(jì)患病率為0.25%～4.63%，平均1.98%[1]。而河南省2001年采用分層隨機(jī)對(duì)18個(gè)市共43個(gè)流調(diào)點(diǎn)進(jìn)行整體抽樣調(diào)查顯示：0～14歲兒童累積哮喘患病率為1.75%，其中78.8%在3歲內(nèi)發(fā)病，7歲前起病的占90.6%[2]。哮喘本質(zhì)的病理變化就是一種氣道慢性炎癥；緩解期控制氣道慢性炎癥、降低高反應(yīng)性、促進(jìn)黏膜壁的修復(fù)等求本治療將是規(guī)范化治療哮喘的重點(diǎn)。一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是一種內(nèi)源性調(diào)控分子，由左旋精氨酸在一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)的作用下氧化而成，在機(jī)體內(nèi)起著重要的信使作用?？偟囊谎趸厦?Total Nitric Oxide Synthase，TNOS)主要包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)和構(gòu)成型一氧化氮合酶(constitutive Nitric Oxide Synthase，cNOS)，前者主要調(diào)節(jié)生理功能，后者主要在病理狀態(tài)下產(chǎn)生。哮喘發(fā)作時(shí)，機(jī)體在多種刺激因素的誘導(dǎo)下使iNOS合成的NO增加，局部NO大量合成，引起氣道充血，毛細(xì)血管通透性增加，使血漿滲漏，加重哮喘病情。

小青龍湯出自張仲景《傷寒論》麻黃湯證之后，為外解表邪、內(nèi)蠲水飲、宣肺平喘的著名經(jīng)方，數(shù)千年的臨床實(shí)踐證實(shí)其在治療支管哮喘方面療效確切。地龍性咸、寒，具有清熱熄風(fēng)、通絡(luò)、平喘、利尿的功效，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明其含有的廣地龍次黃嘌呤有顯著舒張支氣管的作用，并可拮抗組織胺引起的平滑肌痙攣，具有明顯抗炎平喘作用[3]。小青龍湯變方是由小青龍湯加地龍而成，是宋桂華教授治療哮喘的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)方，臨床療效顯著。因此，本研究通過(guò)觀(guān)察不同劑量小青龍湯變方對(duì)發(fā)作期哮喘小鼠血清及肺組織勻漿液中NO含量、NOS活性和肺組織病理改變的影響，試圖闡明該方在哮喘急性期可能的作用機(jī)制，同時(shí)為探求中藥源iNOS抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康、清潔級(jí)、雄性BALB/c小鼠50只，鼠齡4～5周，體質(zhì)量20～25 g。由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于河南中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)室自然光線(xiàn)采光，通風(fēng)良好，控制室溫在20～25℃之間，濕度(50±10)%，晝夜周期12 h。動(dòng)物飼料為河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的滅菌、標(biāo)準(zhǔn)干燥鼠糧。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 卵白蛋白(Ovalhumin，OVA)(美國(guó)Sigma公司，規(guī)格1 g/瓶，批號(hào)：20110209)，2%OVA霧化液配制：2 gOVA溶于含50 mg氫氧化鋁的100 mL生理鹽水中，充分混勻，冷藏靜置；0.05%卵蛋白抗原混懸液：5 mgOVA溶于含5 mg氫氧化鋁的10 mL生理鹽水中；地塞米松注射液(河北華威制藥公司)配置成4.5 mg/kg(約相當(dāng)于人用量0.5 mg/kg)；小青龍湯變方高劑量組：按100 mL溫開(kāi)水含生藥100 g濃度配制(麻黃、白芍各18 g，細(xì)辛、五味子、地龍各12 g，甘草、干姜各5 g，半夏、桂枝各9 g)；小青龍湯變方低劑量組：按100 mL溫開(kāi)水含生藥50 g濃度配制(麻黃、白芍各9 g，細(xì)辛、五味子、地龍各6 g，半夏、桂枝各4.5 g，干姜、甘草各2.5 g)，所有中藥均采用三九顆粒劑，由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 氧化鋁干粉(上海美化公司，100 mL/瓶，批號(hào)：20110308)；NO(酶法)試劑盒、NOS比色法檢測(cè)試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；無(wú)水乙醇、蘇木素液、戊巴比妥干粉、伊紅、中性樹(shù)膠等。

1.4 動(dòng)物分組 將50只健康、清潔級(jí)、雄性BALB/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：空白組、模型組、小青龍湯變方低劑量組、小青龍湯變方高劑量組、激素組，每組10只。

1.5 模型的制備及干預(yù) 參考汪受傳主編《中醫(yī)兒科臨床研究》[4]中哮喘小鼠模型制作方法：在實(shí)驗(yàn)第1、7、14天造模組小鼠腹腔內(nèi)注射OVA和氫氧化鋁凝膠混懸液0.2 mL致敏(含100 μg OVA和2 mg氫氧化鋁)；而空白組同時(shí)注射等量的生理鹽水；在第15天將造模組小鼠置于自制激發(fā)箱內(nèi)，給予2 mL2%的OVA生理鹽水懸液霧化吸入以激發(fā)哮喘(35 min/d，共7天)?？瞻捉M小鼠用2 mL生理鹽水進(jìn)行霧化吸入。誘喘成功后小鼠表現(xiàn)為前期煩躁不安，活動(dòng)頻繁；后期靜伏不動(dòng)，毛發(fā)豎立，呼吸急促，萎靡不振，嚴(yán)重者伸頸，縮胸，收腹呈喘息狀，大小便失禁等。

空白組按照造模方法用生理鹽水代替OVA；造模成功后，模型組干預(yù)藥物用生理鹽水代替；小青龍湯變方低、高劑量組：從OVA吸入第1天起，霧化吸入前0.5 h，灌胃小青龍湯變方，低劑量組給藥量0.5 g/(mL·d)，高劑量組給藥量 1 g/(mL·d)，連續(xù)給藥7天，從實(shí)驗(yàn)起每5天測(cè)一次小鼠體質(zhì)量，以及時(shí)調(diào)整給藥。激素組：自吸入OVA第1天起，霧化前0.5 h腹腔注射地塞米松針劑4.5 mg/(kg·d)(約相當(dāng)于人的劑量0.5 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥7天，具體用藥劑量參照苗明三主編《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[5]提供的常用動(dòng)物與人的不同體質(zhì)量的藥物換算公式計(jì)算：D2=D1×K2/K1，D2為動(dòng)物用藥量，D1為人的劑量，K2為 1，K1為 0.11。

1.6 標(biāo)本采集及制備 各組小鼠末次激發(fā)結(jié)束后12 h內(nèi)以1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射以麻醉、頸椎脫臼法處死所有小鼠，按取血、制備肺組織勻漿液、取肺組織的順序立即采集標(biāo)本。取血標(biāo)本用低速離心機(jī)以2 000 r/min的速度離心20 min，用移液管吸取血清放置一次性試管，于-20℃冰箱保存，以備指標(biāo)檢測(cè)；取肺組織后在醫(yī)用無(wú)菌紗布上滲干后放入已編好號(hào)的10%中性福爾馬林固定液中備用，以備標(biāo)本的檢測(cè)。采用比色法測(cè)定血清及肺組織中NO的含量，采用硝酸還原酶法測(cè)定血清及肺組織中NOS的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以(x±s)表示，先對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，若方差齊則用SNK法進(jìn)行多樣本間的兩兩比較，不齊時(shí)用Dunnett's T3比較，取α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)第17天，激素組死亡1只，考慮為腹腔注射操作不當(dāng)所致。與空白組比較，造模組小鼠在霧化第一天，約霧化12 min左右即出現(xiàn)煩躁不安、抓頭撓腮、呼吸深快、腹部痙攣抽動(dòng)、活動(dòng)減少、遲滯、大便增多等過(guò)敏喘息表現(xiàn)，但隨著干預(yù)藥物次數(shù)的增多及時(shí)間的延長(zhǎng)，小青龍湯變方低劑量組、小青龍湯變方高劑量組和激素組小鼠再次給予霧化后上述表現(xiàn)均較模型組明顯減輕，模型組則過(guò)敏喘息癥狀仍然較重，精神較差，活動(dòng)進(jìn)一步減少，進(jìn)食、飲水明顯減少。

2.2 各組小鼠血清、肺組織勻漿液中NO含量比較見(jiàn)表1。與空白組比較，模型組小鼠血清及肺組織NO含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，小青龍湯變方低、高劑量組和激素組小鼠血清及肺組織NO含量明顯下降(P＜0.05)。與小青龍湯變方低劑量組比較，小青龍湯變方高劑量組小鼠血清及肺組織NO含量降低更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與小青龍湯變方高劑量組比較，激素組在降低哮喘小鼠體內(nèi)血清及肺組織NO含量數(shù)值變化方面較為接近，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠血清、肺組織勻漿液中NO含量比較(x±s)

2.3 各組小鼠血清中NOS含量比較 見(jiàn)表2。與空白組比較，模型組小鼠體內(nèi)血清TNOS、iNOS含量均明顯增高(P＜0.05)。與模型組比較，小青龍湯變方低、高劑量組和激素組小鼠血清TNOS、iNOS均明顯降低(P＜0.05)；與小青龍湯變方低劑量組比較，小青龍湯變方高劑量組在降低小鼠體內(nèi)血清TNOS、iNOS方面作用更加顯著(P＜0.05)；其中激素組與小青龍湯變方高劑量組療效接近，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 各組小鼠血清中NOS含量比較(x±s) U/mL

2.4 各組小鼠肺組織勻漿液中NOS含量比較 見(jiàn)表3。與空白組比較，模型組小鼠肺組織勻漿液中TNOS、iNOS含量明顯增高(P＜0.05)。與模型組比較，小青龍湯變方低、高劑量組和激素組小鼠肺組織勻漿液中TNOS、iNOS含量均明顯降低(P＜0.05)。與小青龍湯變方低劑量組比較，小青龍湯變方高劑量組小鼠肺組織勻漿液中TNOS、iNOS含量下降顯著(P＜0.05)；小青龍湯變方高劑量組及激素組療效接近，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 各組小鼠肺組織勻漿液中NOS含量比較(x±s) U/mL

2.5 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。空白組小鼠肺組織氣管纖毛排列整齊，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，血管無(wú)充血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象不明顯。模型組小鼠支氣管黏膜下層可見(jiàn)中性粒細(xì)胞為主的炎性浸潤(rùn)，伴見(jiàn)纖毛部分脫落、粘連、倒伏、壞死等，氣管壁明顯增厚，局部血管充血水腫。激素組、小青龍湯變方低、高劑量組較模型組有明顯好轉(zhuǎn)，以激素組和小青龍湯變方高劑量組病變最為輕微，僅見(jiàn)少許淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，充血輕微，氣道壁厚度較模型組明顯變薄，但比空白組厚。小青龍湯變方低劑量組小鼠氣管壁、肺組織周?chē)廊豢梢?jiàn)較多淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性浸潤(rùn)，氣管壁較厚，較模型組明顯好轉(zhuǎn)，但不如激素組、小青龍湯變方高劑量組改善明顯。

面對(duì)數(shù)量龐大的2型糖尿病患者和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),作為無(wú)法治愈的慢性疾病,治療目的在于實(shí)現(xiàn)對(duì)血糖有效控制,同時(shí)防止并發(fā)癥出現(xiàn);患者自我管理是2型糖尿病患者治療的核心所在,這是需要緊隨病情所采取的方式[1-2]。因此不管是在血糖控制上,還是自我管理上,均需要重視關(guān)鍵因素。目前全球調(diào)查結(jié)果顯示,在自我管理水平方面2型糖尿病患者整體偏低。他們?cè)诠芾砟芰ι媳憩F(xiàn)不強(qiáng),血糖控制不穩(wěn)定,可引起急慢性并發(fā)癥,同時(shí)使患者產(chǎn)生焦慮和抑郁情緒M。因此如何提高2型糖尿病患者自我管理狀況已成為迫切需要解決的問(wèn)題[3-4]。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色結(jié)果 (×200)

3 討論

哮喘病人呼出氣中NO含量較正常人高，其主要是由于哮喘患者氣道上分布的多種炎性細(xì)胞因子刺激iNOS活性增強(qiáng)所致。大量炎性因子可誘導(dǎo)iNOS活性表達(dá)增強(qiáng)，致使NO釋放增多并發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，研究證明，NO參與了哮喘時(shí)支氣管微循環(huán)改變。Bemareggi M等[6]證明NO對(duì)微循環(huán)亦有雙重作用，在生理狀態(tài)下，NO可以抑制微循環(huán)血漿滲出，但在哮喘狀態(tài)下，NO可增加微循環(huán)通透性，增加血漿滲出，致氣道高反應(yīng)性和加重哮喘發(fā)病。

研究表明，哮喘病人呼出氣中NO含量較正常人高2～3倍[7]，iNOS抑制劑可以降低哮喘患者呼出氣NO水平。楊利康等[8]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哮喘豚鼠肺組織中cNOS活性水平變化不明顯，說(shuō)明哮喘時(shí)神經(jīng)性一氧化氮的缺乏不明顯，是iNOS活性水平升高，導(dǎo)致肺組織中NO水平隨之升高，從而引起氣道高反應(yīng)性增強(qiáng)，加重哮喘發(fā)病。哮喘患者呼出氣中NO含量增加，在哮喘惡化時(shí)進(jìn)一步升高[9]，一定程度上反映哮喘炎癥反應(yīng)的過(guò)程和嚴(yán)重程度。吸入外源性NO雖然可輕度擴(kuò)張支氣管，但卻增加了氣道的高反應(yīng)性，而哮喘的本質(zhì)是氣道慢性炎癥改變，氣道局部平滑肌痙攣只是哮喘病理過(guò)程的一個(gè)組成部分而非全部，因此選擇性抑制iNOS活性將是治療哮喘的方向之一，也是激素治療哮喘的機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了哮喘小鼠體內(nèi)血清、肺組織勻漿液中NO含量明顯增高，iNOS活性增強(qiáng)，而cNOS變化不明顯，NO、iNOS在哮喘發(fā)病中起著重要的作用。哮喘發(fā)作時(shí)iNOS活性明顯增強(qiáng)，可以促進(jìn)病理狀態(tài)下NO過(guò)量產(chǎn)生，加重哮喘發(fā)作期癥狀及肺組織的炎性浸潤(rùn)。

綜上，本課題研究結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了小青龍湯變方可降低哮喘發(fā)作期小鼠體內(nèi)iNOS含量、抑制其活性表達(dá)，降低NO過(guò)量產(chǎn)生，從而改善哮喘癥狀及肺組織病理變化，且以高劑量組改善更為明顯。推測(cè)小青龍湯變方治療急性發(fā)作期哮喘的作用機(jī)制之一可能和影響機(jī)體組織內(nèi)NO和iNOS代謝活性有關(guān)，且在一定范圍內(nèi)隨著藥量的增加而發(fā)揮更強(qiáng)的作用，這體現(xiàn)了中醫(yī)藥復(fù)方在治療疾病中多途徑、多靶點(diǎn)的療效優(yōu)勢(shì)。此外，小青龍變方高劑量組的治療作用和激素組接近，為臨床部分哮喘發(fā)作期癥狀較輕，未達(dá)到使用激素指證的患兒提供了另一種治療選擇。但本研究樣本量偏小，可重復(fù)性偏低，下一步我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，制定更嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)、準(zhǔn)確、具有更高可重復(fù)性的研究方案，進(jìn)一步揭示中醫(yī)藥多途徑、多靶點(diǎn)的療效優(yōu)勢(shì)。

［參考文獻(xiàn)］

[1]全國(guó)兒童哮喘防治協(xié)作組．中國(guó)城區(qū)兒童哮喘患病率調(diào)查[J]．中華兒科雜志，2003，41(2)：123．

[3]張保國(guó)，劉慶芬．小青龍湯現(xiàn)代研究與新用[J]．中成藥，2012，34(2)：340-344．

[4]汪受傳．中醫(yī)兒科臨床研究[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：167.

[5]苗明三．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]．北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2010：57.

[6]Bevelander M．Nitrogen dioxide promotes allergic sensitization to inhaled antigen[J]．J Immunol， 2007， 179(6)： 3680-3688.

[7]沈華浩．哮喘手冊(cè)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：17-30．

[8]楊利康，劉翱，陳宇英，等．一氧化氮及一氧化氮合酶在哮喘大鼠氣道高反應(yīng)中的作用[J]．中國(guó)臨床康復(fù)，2004，8(36)：8235．

[9]黃鐵群．一氧化氮在哮喘發(fā)病和治療中的雙重性[J]．國(guó)外醫(yī)學(xué)：呼吸系統(tǒng)分冊(cè)，1998，18(1)：51-53．