劉 威， 王 爽， 溫 娜， 王洪羽， 金 宏

缺血性腦血管疾病是影響人類健康和生命的常見病、多發(fā)病，腦血流中斷和再灌注使腦組織細胞產(chǎn)生損傷級聯(lián)反應(yīng)，引起氧自由基爆發(fā)，細胞凋亡，導(dǎo)致腦細胞大量死亡[1]。目前研究熱點集中在如何減輕疾病過程中腦細胞缺氧/復(fù)氧損傷，常利用體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞研究缺血性腦病發(fā)病機制和臨床用藥。離體神經(jīng)元尤其是海馬神經(jīng)元對缺血缺氧較整體腦組織更為敏感且可排除體內(nèi)多種因素的影響，因此建立缺血性腦損傷模型往往選擇原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元為實驗對象[2]。但在實驗過程中，原代提取的神經(jīng)細胞往往生長慢、狀態(tài)不穩(wěn)定，影響實驗進度，因此培養(yǎng)穩(wěn)定有效的原代神經(jīng)細胞是建立腦細胞缺氧損傷模型的先決條件。目前常用的原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)方法有直接消化法和種植法[3,4]。本研究分別用上述方法培養(yǎng)新生大鼠神經(jīng)細胞，利用H2O2對其造成缺氧/復(fù)氧損傷，通過觀察細胞損傷程度比較兩種培養(yǎng)方法獲得細胞的穩(wěn)定性，并探討用H2O2造細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的最佳時間，為臨床藥物研究提供制作神經(jīng)細胞氧化損傷模型可靠方法。

1 材料與方法

1.1 材料 新生48 h內(nèi)SD大鼠，購于吉大動物實驗中心。噻唑藍(MTT)、細胞培養(yǎng)試劑均由Gibco公司提供；2 μmol/L阿胞糖苷、胰蛋白酶購于Sigma；丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；G-LISA RhoA活性測定試劑盒由Cytoskeleton公司提供；超凈工作臺購于蘇州凈化設(shè)備廠，CO2培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司；倒置相差顯微鏡購于日本Olympus公司；酶標(biāo)儀購于美國Biorad公司。

1.2 方法

1.2.1 用海馬組織直接消化建立神經(jīng)元細胞培養(yǎng)體系 將新生乳鼠以75%酒精消毒后斷頭，剪開頭骨將腦組織放置于冰臺上培養(yǎng)皿內(nèi)。解剖鏡下輕柔剝離皮質(zhì)表面系膜，鈍性分離出海馬組織，放置入冰臺上盛有緩沖液的平皿中清洗，放入大離心管邊緣內(nèi)以眼科剪剪碎，注意剪得越碎越好。在大試管內(nèi)加入D-Hanks液，沖洗剪碎的腦組織2～3遍，加入預(yù)熱的0.15%胰蛋白酶和Dnase共5 ml，將瓶口密封后置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化30 min。取出大離心管，加入血清2 ml終止消化，以鈍頭玻璃滴管反復(fù)輕柔吹打底部組織塊，直至組織塊分散完全。將組織消化完全，用200目細胞篩過濾，收集液以1000 rpm離心3 min，棄上清后以神經(jīng)細胞培養(yǎng)液(內(nèi)含5%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液)重懸，計數(shù)細胞密度以1×106/ml接種于5 ml細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。差速貼壁1 h以除去成纖維細胞，24 h后換用含阿糖胞苷2 μmol/L的培養(yǎng)液，作用24 h后換用神經(jīng)元培養(yǎng)液。根據(jù)細胞狀態(tài)3～5 d更換一次培養(yǎng)液，第4天加入終濃度為1.5 mmol/L亮氨酸甲酯以除去小膠質(zhì)細胞，培養(yǎng)15 d左右根據(jù)細胞狀態(tài)可進行實驗。

1.2.2 將海馬神經(jīng)元種植于星形膠質(zhì)細胞層上建立共同培養(yǎng)體系 首先建立星型細胞培養(yǎng)體系，用手術(shù)刀片在腦組織表面片取2層約2 mm厚的腦組織按上法消化完畢，種植于培養(yǎng)瓶內(nèi)。其內(nèi)有少量小膠質(zhì)細胞，對神經(jīng)元細胞生長有毒性需除去。我們的經(jīng)驗是：3～4 d后星型膠質(zhì)細胞細胞貼壁緊密，而小膠質(zhì)細胞尚未貼壁緊密，換液時用鈍頭玻璃滴管吸取室溫PBS液反復(fù)沖洗細胞層10～20次，可除去小膠質(zhì)細胞。與常規(guī)加入亮氨酸甲酯等藥物抑制小膠質(zhì)細胞生長相比，本純化方法安全有效，是本實驗創(chuàng)新之處。待星形膠質(zhì)細胞鋪滿底板，換無血清培養(yǎng)液以防止細胞過度生長。然后消化海馬組織，方法同上，5×105/ml種植于培養(yǎng)好的星型細胞層上，10～15 d左右細胞狀態(tài)穩(wěn)定可用于實驗。

1.2.3 建立各組細胞缺氧復(fù)氧損傷模型 為方便描述，將直接法消化所得神經(jīng)元命名為A組；將種植法所得神經(jīng)元命名為B組。兩種方法培養(yǎng)的神經(jīng)元接種于96孔板內(nèi)，生長良好時分兩組，空白組無處理因素繼續(xù)培養(yǎng)；模型組加入終濃度為600 μmol/L H2O2(本研究前期結(jié)果表明該濃度較適宜造成神經(jīng)元氧化損傷模型)的培養(yǎng)基培養(yǎng)50 min、2 h、3 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h，不同時間設(shè)5個復(fù)孔。

1.2.4 各組細胞存活情況觀察 培養(yǎng)結(jié)束后各組神經(jīng)細胞以PBS清洗兩次，加入無血清培養(yǎng)液及20 μl MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h。棄上清后每孔加入150 μl二甲基亞砜，震板10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度(A)值，計算細胞存活率。

1.2.5 各組細胞上清液LDH及細胞SOD、MDA檢測 將神經(jīng)細胞以1×105個/孔濃度接種于96孔板，每組5個復(fù)孔，H2O2同上法處理完畢，采用試劑盒檢測各組細胞上清液LDH活性，細胞SOD活性和MDA水平，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 各模型組RhoA活性檢測 將細胞培養(yǎng)板置于冰臺上，4 ℃ PBS沖洗后，吸凈PBS，每孔加入裂解液，用細胞刮刀將細胞層刮下。按G-LISA RhoA活性測定試劑盒說明書提示操作完畢后，酶標(biāo)儀490 nm處測定各組吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞形態(tài)觀察 A組培養(yǎng)15 d后，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。神經(jīng)細胞狀態(tài)較好，可見大多數(shù)細胞體積較大透亮，細胞間有密集突起相連接，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，其上少量細胞回縮成圓形，狀態(tài)較差(見圖1A)。B組星型膠質(zhì)細胞培養(yǎng)10 d后細胞扁平貼壁生長，無明顯突起連接，成片生長，邊界不明顯(見圖1B)。將海馬神經(jīng)元種植于其上培養(yǎng)5 d后，神經(jīng)元生長好，軸突舒展，無回縮細胞(見圖1C)。鏡下觀察結(jié)果，種植法培養(yǎng)的神經(jīng)細胞狀態(tài)優(yōu)于直接法。

2.2 不同時間點各組細胞存活率比較 MTT法檢測兩種方法培養(yǎng)的神經(jīng)細胞，其中先培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞，后將海馬細胞種植于其上的B組細胞存活率高于A組(P<0.05)，說明B組狀態(tài)較好，各組細胞缺氧50 min存活率在50%左右，能模擬體內(nèi)缺氧狀態(tài)(見表1)。

2.3 各組細胞上清液LDH及細胞SOD、MDA比較 試劑盒檢測各組細胞上清液LDH活性，各組細胞SOD活性，MDA含量表明，與A組細胞相比，B組細胞在氧化損傷的條件下，細胞完整性更好。LDH漏出較少，SOD活性較高，MDA生成較少，說明B組細胞膜穩(wěn)定性好于A組細胞(見表2、表3)。

2.4 各組細胞RhoA活性比較 ELISA法檢測兩組細胞RhoA活性結(jié)果表明，B組細胞RhoA活性較低，說明因此而產(chǎn)生的細胞凋亡作用較弱，表明B組細胞在氧化損傷的條件下較穩(wěn)定(見表4)。

表1 不同時間點各組細胞存活率比較

與空白組比較*P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；A、B損傷組間比較△P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

表2 各組細胞上清液LDH活性比較

與空白組比較*P<0.05；50 min，2 h時，A、B損傷組間比較△P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義

表3 各組細胞SOD、MDA含量比較

與空白組比較*P<0.05；50 min，2 h時，A、B損傷組間比較△P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

表4 各組細胞RhoA活性比較

與空白組比較*P<0.05；50 min，2 h時，A、B損傷組間比較△P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

圖1 兩種方法消化所得的神經(jīng)細胞

3 討 論

海馬組織功能與學(xué)習(xí)記憶、認知功能相關(guān)，且神經(jīng)元密度較高，提取細胞相對容易[5]，因此研究藥物往往選擇該組織消化提取神經(jīng)細胞。從海馬組織直接消化獲得神經(jīng)元細胞，其中含有部分星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和剝離腦膜時帶入的成纖維細胞。其中星型膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元細胞起滋養(yǎng)支持作用，需要建立兩者的共存體系。小膠質(zhì)細胞和成纖維細胞是雜質(zhì)細胞需清除。因成纖維細胞貼壁最早，1 h內(nèi)可貼壁，因此常用差速貼壁法去除。小膠質(zhì)細胞常通過加入亮氨酸甲酯抑制其生長[6]，但濃度時間不易把握，往往造成神經(jīng)細胞的損傷，影響實驗進行。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)可通過利用小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞貼壁能力的差異，在培養(yǎng)3～4 d通過對細胞層反復(fù)沖洗去除絕大部分小膠質(zhì)細胞，這種方法簡便易行，對細胞系內(nèi)其他細胞無影響，是本實驗創(chuàng)新之處。兩種方法培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元鏡下觀察，可見種植法建立的培養(yǎng)體系中神經(jīng)細胞存活率高、發(fā)育好。這可能是因為種植法可避免加入阿糖胞苷，減少對神經(jīng)元細胞的損傷[7]。

本研究在建立穩(wěn)定的神經(jīng)元培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上，探討了建立缺氧/復(fù)氧損傷模型方法。細胞缺氧/復(fù)氧損傷分子機制較為復(fù)雜，目前研究表明該損傷與再灌注過程中氧自由基爆發(fā)及細胞凋亡有關(guān)[8]。氧自由基攻擊生物膜，細胞膜受攻擊后產(chǎn)生MDA，線粒體膜受攻擊后漏出LDH，可通過檢測上述物質(zhì)的活性、含量等判斷細胞受氧化損傷的程度。另外細胞中也有對抗氧化的物質(zhì)如SOD，其含量多少也可反映細胞受損程度[9,10]。本研究用終濃度為600 μmol/L H2O2對神經(jīng)元進行處理造成氧化損傷，復(fù)氧18 h后檢測細胞存活率和LDH、SOD及MDA水平。結(jié)果表明缺氧50 min細胞存活率在50%左右，可最大程度模擬體內(nèi)細胞缺氧情況[11]。處理2 h和3 h損傷時間過長，細胞損傷嚴重不宜作為實驗對象。其中B組細胞在各損傷時間段下的存活率均高于A組細胞，說明B組細胞狀態(tài)優(yōu)于A組細胞。細胞LDH、SOD及MDA水平檢測結(jié)果表明，細胞培養(yǎng)液LDH活性顯著增加、SOD活性下降、MDA含量增加。與A組細胞相比，B組細胞在50 min、2 h組損傷較輕。

細胞缺氧/復(fù)氧損傷另一途徑為細胞凋亡。目前研究較多的是檢測各種凋亡蛋白如caspase-3、bcl-2等的含量，對RhoA/ROCK信號通路在細胞凋亡中的作用研究較少。RhoA/ROCK信號通路參與細胞損傷修復(fù)、細胞凋亡等多種細胞生物活動[12]。RhoA/ROCK信號通路蛋白具有GTP酶活性，可進一步激活JNK信號通路引發(fā)細胞凋亡[13,14]。其中RhoA蛋白最先被激活，在凋亡過程中起到“分子開關(guān)”作用，因此可通過檢測細胞RhoA含量對由凋亡引發(fā)的細胞損傷程度做出初步判斷[15]。本實驗結(jié)果表明損傷組細胞RhoA含量均高于空白組，其含量隨缺氧時間延長而增加，說明缺氧/復(fù)氧損傷可引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡，該信號通路其他機制待今后實驗進一步研究。

綜上所述，先建立穩(wěn)定的星形膠質(zhì)細胞，后將神經(jīng)元細胞種植于其上的共同培養(yǎng)細胞體系穩(wěn)定可靠，值得推薦。在建立缺氧/復(fù)氧損傷模型方面，選擇終濃度為600 μmol/L H2O2缺氧培養(yǎng)神經(jīng)細胞50 min，復(fù)氧培養(yǎng)18 h造成神經(jīng)細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型，最接近體內(nèi)真實水平，可用于各項細胞學(xué)實驗。

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